張思盼 張昌明 吳俊男 趙 越 徐孝東 郎 月 朱小東 劉志紅

足細(xì)胞損傷是特發(fā)性局灶節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)發(fā)病的中心環(huán)節(jié)[1]。研究發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞功能異常參與了FSGS的發(fā)病過程，其機(jī)制可能為T細(xì)胞分泌某種循環(huán)因子導(dǎo)致足細(xì)胞損傷[2]。

細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles,EVs)是細(xì)胞間通信的重要信使，EVs包含的miRNA可在細(xì)胞間運(yùn)輸并引起靶細(xì)胞效應(yīng)[3]。T細(xì)胞等免疫細(xì)胞是循環(huán)中EVs的重要來源[4-5]。研究顯示體內(nèi)足細(xì)胞可攝入白細(xì)胞來源EVs[6]， 提示EVs能夠進(jìn)入足細(xì)胞，但循環(huán)中EVs是否對(duì)損傷足細(xì)胞具有損傷效應(yīng)尚不明確。

特發(fā)性FSGS患者臨床表現(xiàn)大量蛋白尿，病理特點(diǎn)為足細(xì)胞損傷及局灶節(jié)段性腎小球硬化，腎小球無炎細(xì)胞浸潤或免疫復(fù)合物沉積。為了探討FSGS患者循環(huán)中EVs的致病作用及其來源，本研究從分析FSGS患者循環(huán)EVs入手，觀察其導(dǎo)致蛋白尿及足細(xì)胞損傷的作用，繼而對(duì)其所包含miRNAs的成分進(jìn)行分析，并對(duì)其是否來源于T細(xì)胞進(jìn)行了研究和闡述。

對(duì)象和方法

研究對(duì)象經(jīng)國家腎臟病臨床醫(yī)學(xué)研究中心腎活檢確診FSGS患者26例，尿蛋白定量>3.5 g/24h，血清白蛋白<30 g/L。排除家族史陽性、肥胖、HIV感染、丙型肝炎、毒物或藥物(如海洛因、二膦酸鹽)導(dǎo)致的繼發(fā)性FSGS。同時(shí)入組年齡、性別相匹配的健康志愿者15例。所有入組人員均已簽署知情同意書。人類樣品使用按照金陵醫(yī)院倫理委員會(huì)規(guī)定進(jìn)行。

主要實(shí)驗(yàn)材料和試劑Hsa-miRNA-193a mimic(銳博生物科技有限公司)。羅丹明標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽(Cytoskeleton公司)，抗Wilms瘤抑癌基因(WT1)抗體(Abcam公司)，HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(Engene公司)，化學(xué)發(fā)光試劑ECL(millipore公司)，激光共聚焦顯微鏡(Zeiss LSM 710)。

血標(biāo)本采集和血漿分離靜脈采集受試者外周血40 ml，EDTA抗凝。外周血采集后6h內(nèi)以3 000g離心10 min，分離血漿。

EVs分離血漿或細(xì)胞培養(yǎng)上清按照梯度離心法分離EVs，具體方法見參考文獻(xiàn)[7]。主要步驟為：1、4℃ 2 000g離心10 min，取上清，去除細(xì)胞和細(xì)胞碎片；2、4℃ 10 000g 離心30 min，取上清，去除大蛋白和細(xì)胞凋亡小體等；3、4℃ 100 000g (Beckman Coulter Optima L-80 ultracentrifuge)離心60 min，棄上清，PBS洗滌沉淀；4、4℃ 100 000g (Beckman Coulter Optima L-80 ultracentrifuge)離心60 min，棄上清，50 μl PBS重懸沉淀。BCA法(碧云天)測(cè)定EVs蛋白含量。

MiRNA芯片和RT-PCR 按照說明書使用mirVana miRNA 提取試劑盒(Ambion公司)提取血漿EVs和Jurkat T細(xì)胞EVs的總RNA，由上海伯豪生物技術(shù)有限公司進(jìn)行分析，抽提所得總RNA經(jīng)Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent technologies,Santa Clara,CA,US)電泳質(zhì)檢合格后備用。4例FSGS患者血漿EVs和4例對(duì)照血漿EVs RNA用Agilent Human miRNA (8*60K) V19.0 芯片(design ID： 46064)測(cè)定差異表達(dá)的miRNA。擴(kuò)大樣本量篩選時(shí)，RNA 樣品用 qRT-PCR kit (Takara Bio,Otsu,Japan)測(cè)定miRNA。Taqman探針購自Takara Bio。

細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染條件性永生化人足細(xì)胞來自M.Saleem (University of Bristol,Bristol,United Kingdom)，培養(yǎng)條件和文獻(xiàn)報(bào)道一致[8]。Jurkat細(xì)胞購自上海細(xì)胞所，培養(yǎng)條件與atcc.org說明一致。使用LipofectamineTMRNAiMAX Transfection Reagent(Invitrogen，)按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后48h收集EVs，-80℃保存?zhèn)溆?。為了闡明EVs能否介導(dǎo)T細(xì)胞與足細(xì)胞之間的通信進(jìn)而導(dǎo)致足細(xì)胞損傷，用miR-193a mimics轉(zhuǎn)染Jurkat T細(xì)胞使之過表達(dá)miR-193a，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清中EVs，或與體外培養(yǎng)的足細(xì)胞孵育，觀察足細(xì)胞損傷。

動(dòng)物模型制備實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用經(jīng)金陵醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。8周齡雄性Balb/c小鼠尾靜脈注射EVs，隔天一次，共注射三次，檢測(cè)尿蛋白，腎臟組織學(xué)改變。EVs經(jīng)RIPA裂解后行蛋白濃度測(cè)定，每只小鼠每次注射30 μg[7]。測(cè)定注射前和注射后第6天尿白蛋白/肌酐比值，將尿白蛋白/肌酐比值>200 μg/mg定義為蛋白尿。同上，收集過表達(dá)miR-193a的EVs，注射給小鼠，觀察小鼠蛋白尿、足細(xì)胞損傷等。

尿蛋白測(cè)定按照生產(chǎn)廠家說明書使用Albuwell M andCreatinine Companion Kits (Exocell Inc.)測(cè)定小鼠尿白蛋白和肌酐。

足細(xì)胞骨架定量分析足細(xì)胞肌動(dòng)蛋白用羅丹明-鬼筆環(huán)肽染色，共聚焦顯微鏡拍照。羅丹明染色區(qū)域轉(zhuǎn)化為黑色像素后用ImageJ 軟件定量分析。灰度為0(黑色)到200(白色，細(xì)胞骨架最大值)。計(jì)算平均足細(xì)胞骨架像素比值和單細(xì)胞骨架蛋白含量。

Western印跡體外培養(yǎng)足細(xì)胞用含磷酸酶抑制劑和蛋白酶抑制劑(Roche)的RIPA裂解。電泳轉(zhuǎn)膜后用抗WT1抗體(Abcam)孵育。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用Graphpad Prism 6.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組數(shù)據(jù)的比較使用非配對(duì)t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

FSGS患者循環(huán)中EVs包涵的miR-193a可導(dǎo)致足細(xì)胞損傷為明確FSGS患者EVs中miRNA表達(dá)情況，我們對(duì)兩組EVs進(jìn)行芯片檢測(cè)和分析，共檢出551種miRNA。與對(duì)照組EVs相比，F(xiàn)SGS組升高大于1.5倍的miRNA有62個(gè)(圖1A)。RT-PCR驗(yàn)證升高的 miRNA有48個(gè)。擴(kuò)大樣本量，對(duì)這48個(gè)miRNA進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)FSGS組有6個(gè)miRNA較對(duì)照組EVs升高(圖1B)。用非參數(shù)t檢驗(yàn)比較FSGS患者和對(duì)照EVs的miRNA的CT值，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。將這6個(gè)miRNA mimics分別用10 nmol/L,50 nmol/L,100 nmol/L濃度轉(zhuǎn)染足細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)miR-193a(50 nmol/L,100 nmol/L)轉(zhuǎn)染后的足細(xì)胞，細(xì)胞骨架出現(xiàn)明顯損傷(P<0.05)(圖1C)。

圖1 FSGS患者循環(huán)EVs包涵的miR-193a導(dǎo)致足細(xì)胞損傷A:FSGS患者循環(huán)EVs中包涵miRNAs的篩選;B:RT-PCR結(jié)果，F(xiàn)SGS患者EVsmiR-193a水平較健康人EVs升高;C:miR-193a(50 nM,100 nM)轉(zhuǎn)染足細(xì)胞后均可引起細(xì)胞骨架損傷;FSGS：局灶節(jié)段性腎小球硬化；EVs:細(xì)胞外囊泡；FSGS EVs：FSGS患者血漿EVs；CTL EVs：健康人血漿EVs； Scram.：miR-193a的隨機(jī)對(duì)照序列Scramble；*：P<0.05

FSGS患者循環(huán)EVs導(dǎo)致小鼠蛋白尿和足細(xì)胞損傷將FSGS患者和正常對(duì)照循環(huán)EVs經(jīng)尾靜脈隔天注射Balb/c小鼠。注射后第6天時(shí)注射FSGS患者循環(huán)EVs的小鼠尿白蛋白肌酐比值異常(>200 μg/mg)比例明顯高于對(duì)照組(圖2A，表1)。分別用兩組的EVs處理體外培養(yǎng)足細(xì)胞，檢測(cè)細(xì)胞骨架改變。FSGS患者EVs可引起細(xì)胞肌動(dòng)蛋白減少、骨架結(jié)構(gòu)紊亂(圖2B、C)。

表1注射健康人與FSGS患者血漿EVs后小鼠蛋白尿產(chǎn)生情況

對(duì)照組FSGS組總數(shù)1526產(chǎn)生蛋白尿小鼠數(shù)08產(chǎn)生蛋白尿小鼠比例030.77%

FSGS:局灶節(jié)段性腎小球硬化;EVs:細(xì)胞外囊泡

源于過表達(dá)miR-193a的T細(xì)胞的EVs導(dǎo)致小鼠蛋白尿及足細(xì)胞損傷用過表達(dá)miR-193a的Jurkat細(xì)胞分泌的EVs注射小鼠，電鏡下Jurkat細(xì)胞分泌的EVs直徑在150 nm以內(nèi)(圖3A)，過表達(dá)miR-193a的EVs與對(duì)照EVs大小無明顯差異。體外實(shí)驗(yàn)表明兩組EVs被足細(xì)胞攝取的能力無明顯差異。Mimics轉(zhuǎn)染組較對(duì)照序列轉(zhuǎn)染組Jurkat細(xì)胞分泌的EVs中miR-193a含量明顯升高(圖3B)。小鼠尾靜脈隔天注射兩種EVs 12d后，注射過表達(dá)miR-193a EVs的小鼠出現(xiàn)蛋白尿(圖3C)，尿蛋白肌酐比增加(圖3D)，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)該組小鼠足細(xì)胞足突融合(圖3E)。將Jurkat細(xì)胞分泌的EVs與足細(xì)胞共同處理，4h后可見DilC16標(biāo)記EVs已進(jìn)入足細(xì)胞(圖3F)，經(jīng)檢測(cè)證實(shí)足細(xì)胞內(nèi)miR-193a含量明顯高于對(duì)照組(圖3G)。miR-193a過表達(dá)EVs處理后，體外培養(yǎng)的足細(xì)胞出現(xiàn)明顯的骨架紊亂(圖3H)。

圖2 FSGS患者循環(huán)EVs引起小鼠蛋白尿和足細(xì)胞損傷 A:FSGS患者血漿EVs可引起小鼠尿白蛋白肌酐比值升高;B:FSGS患者EVs引起足細(xì)胞骨架損傷;FSGS：局灶節(jié)段性腎小球硬化；EVs:細(xì)胞外囊泡；FSGS EVs：FSGS患者血漿EVs；CTL EVs：健康人血漿EVs；*：P<0.05

圖3 源于過表達(dá)miR-193a的T細(xì)胞的EVs誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷A:電鏡觀察Jurkat細(xì)胞分泌的EVs;B:miR-193a mimics和scramble轉(zhuǎn)染的Jurkat細(xì)胞分泌的EVs RNA進(jìn)行RT-PCR;C-E:小鼠尾靜脈注射過表達(dá)miR-193a EVs和對(duì)照EVs(C),ELISA法測(cè)定小鼠尿蛋白/肌酐比值(D)，電鏡下兩組小鼠足突結(jié)構(gòu)(E);F:Jurkat EVs進(jìn)入足細(xì)胞;G:過表達(dá)miR-193a的EVs處理足細(xì)胞RNA進(jìn)行RT-PCR;H:富含miR-193a的EVs處理足細(xì)胞后肌動(dòng)蛋白纖維減少;Scram.EVs：轉(zhuǎn)染miR-193a對(duì)照序列scramble的Jurkat細(xì)胞分泌的EVs；miR-193a EVs：轉(zhuǎn)染miR-193a mimics的Jurkat細(xì)胞分泌的EVs;*P<0.05

過表達(dá)miR-193a的T細(xì)胞分泌的EVs通過下調(diào)WT1表達(dá)導(dǎo)致足細(xì)胞損傷用過表達(dá)miR-193a的Jurkat細(xì)胞分泌的EVs處理足細(xì)胞，免疫印跡法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-193a的EVs處理的足細(xì)胞WT1表達(dá)降低(圖4)。

圖4 富含miR-193a的EVs可下調(diào)足細(xì)胞WT1表達(dá)EVs:細(xì)胞外囊泡；Scram.EVs：轉(zhuǎn)染對(duì)照序列的Jurkat細(xì)胞分泌的EVs；miR-193a EVs：轉(zhuǎn)染miR-193a mimics的Jurkat細(xì)胞分泌的EVs;*P<0.05

討 論

本研究發(fā)現(xiàn)FSGS患者循環(huán)中T細(xì)胞來源的EVs通過miR-193a介導(dǎo)足細(xì)胞損傷和蛋白尿的發(fā)生。

miRNA對(duì)維持足細(xì)胞穩(wěn)態(tài)具有重要作用：損傷性miRNA可誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷[9-10]，例如miR-193a過表達(dá)小鼠出現(xiàn)蛋白尿、腎臟出現(xiàn)局灶節(jié)段硬化性病變[10]。近年來研究發(fā)現(xiàn)miRNA可通過EVs運(yùn)輸至靶細(xì)胞，調(diào)節(jié)靶細(xì)胞功能[11]。為了明確FSGS患者循環(huán)EVs運(yùn)載的miRNA與正常人的表達(dá)差異，我們使用miRNA芯片和RT-PCR等方法篩選FSGS患者循環(huán)EVs中表達(dá)升高的miRNA，發(fā)現(xiàn)FSGS患者EVs中miR-193a較正常人EVs升高。體外培養(yǎng)足細(xì)胞過表達(dá)miR-193a后足細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)紊亂，表明FSGS循環(huán)EVs可能通過miR-193a參與足細(xì)胞損傷。

特發(fā)性FSGS足細(xì)胞損傷嚴(yán)重，腎小球內(nèi)無或很少有炎細(xì)胞浸潤。部分FSGS患者血清能引起大鼠腎小球?yàn)V過膜通透性增加[12]。這些證據(jù)提示存在某種循環(huán)致病因子，介導(dǎo)足細(xì)胞損傷。EVs是細(xì)胞間通信的重要信使[13]。在EVs介導(dǎo)的細(xì)胞間通信中，循環(huán)EVs在遠(yuǎn)隔細(xì)胞間傳遞信號(hào)占重要地位[14]。循環(huán)中EVs通過腎臟排泄[15]，電鏡觀察發(fā)現(xiàn)小鼠足細(xì)胞中有來自白細(xì)胞的EVs[6]，說明循環(huán)EVs可到達(dá)足細(xì)胞。本文發(fā)現(xiàn)部分FSGS患者血漿中EVs可引起體外培養(yǎng)足細(xì)胞骨架損傷、小鼠蛋白尿和足細(xì)胞足突融合，表明來源于循環(huán)的EVs可介導(dǎo)足細(xì)胞損傷。

既往研究發(fā)現(xiàn)只有小部分(16.3%)特發(fā)性FSGS患者血液中存在循環(huán)致病因子[16]，循環(huán)致病因子也不是特定的單一物質(zhì)[2，17-19]。FSGS患者血漿注射大鼠，也只有部分大鼠產(chǎn)生蛋白尿[12]。此外，F(xiàn)SGS是一病理形態(tài)學(xué)診斷名詞，病因具有多樣性，病理表現(xiàn)不一，F(xiàn)SGS患者血漿EVs注射小鼠后，只有小部分小鼠產(chǎn)生了蛋白尿，與臨床上FSGS病因多樣、病理表現(xiàn)不同相一致。

有報(bào)道，F(xiàn)SGS患兒伴有T細(xì)胞功能和亞群數(shù)量的異常[20]。阿霉素腎病小鼠模型，在去除了CD4+T細(xì)胞后腎臟損傷加重[21]，而去除CD8+T細(xì)胞后腎臟結(jié)構(gòu)和功能都得到了保護(hù)[22]。骨髓來源的抑制性細(xì)胞通過抑制T細(xì)胞激活保護(hù)FSGS患者的足細(xì)胞[23]。因此，T細(xì)胞功能異常有可能是循環(huán)致病因子的來源之一。研究表明T細(xì)胞可通過分泌EVs調(diào)控其他細(xì)胞功能[24-25]。T細(xì)胞分泌的EVs參與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病和肝炎[26-27]。為探討T細(xì)胞來源的EVs對(duì)足細(xì)胞的損傷作用，本文利用體外培養(yǎng)的T細(xì)胞系，使其過表達(dá)miR-193a，收集EVs，通過小鼠尾靜脈注射和體外培養(yǎng)足細(xì)胞共孵育的方法，發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞來源的EVs能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生蛋白尿，引起足細(xì)胞足突融合和足細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)損傷。以上結(jié)果表明T細(xì)胞來源的EVs可通過運(yùn)輸miR-193a導(dǎo)致足細(xì)胞損傷。因此T細(xì)胞來源的EVs可能是FSGS循環(huán)致病因子之一。本文未檢測(cè)兩組EVs的轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、DNA和膜脂質(zhì)成分是否存在差異，曾有研究利用iTRAQ測(cè)定人為改變細(xì)胞miRNA含量后，這些細(xì)胞分泌的EVs蛋白含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EVs的蛋白種類和表達(dá)量基本不變[28]。

張昌明等[29]發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素治療后完全緩解的FSGS患者血漿miR-193a-3p明顯低于大量蛋白尿的FSGS患者。Gebeshuber等[10]發(fā)現(xiàn)miR-193a過表達(dá)小鼠出現(xiàn)腎小球局灶節(jié)段硬化。miR-193a僅在特發(fā)性FSGS患者腎小球升高，而HIV相關(guān)腎病、糖尿病腎病、嘌呤霉素腎病、阿霉素腎病、suPAR模型、Heyman腎炎、硫酸魚精蛋白灌注、Alport綜合征、WT1敲除以及nephrin過表達(dá)等足細(xì)胞損傷模型中腎小球miR-193a均不升高[10]，說明該miRNA具有一定的疾病特異性。過表達(dá)miR-193a轉(zhuǎn)基因小鼠在8周齡時(shí)死于腎臟局灶節(jié)段硬化性病變，對(duì)不同周齡的miR-193a過表達(dá)小鼠的腎小球進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，miR-193a損傷足細(xì)胞依賴于下調(diào)WT1；WT1下調(diào)引起其靶基因podocalyxin和nephrin等對(duì)維持足細(xì)胞穩(wěn)定的關(guān)鍵基因表達(dá)下降，由此引起整個(gè)足細(xì)胞穩(wěn)定系統(tǒng)的毀損[10]。我們觀察了過表達(dá)miR-193a的T細(xì)胞來源的EVs對(duì)足細(xì)胞的影響，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)miR-193a的T細(xì)胞分泌的EVs可下調(diào)足細(xì)胞WT1表達(dá)，導(dǎo)致足細(xì)胞損傷。本文未直接向小鼠注射miR-193a mimics。本文未檢測(cè)其他足細(xì)胞標(biāo)志物變化，但是miR-193a損傷足細(xì)胞依賴于下調(diào)WT1表達(dá)，大部分足細(xì)胞功能關(guān)鍵基因都受WT1調(diào)控[30]，僅檢測(cè)蛋白表達(dá)變化不能明確是EVs中miR-193a引起的直接變化還是WT1下調(diào)引起的變化，或者EVs其他成分引起的變化。

本研究揭示了FSGS患者循環(huán)中T細(xì)胞來源的的EVs通過其運(yùn)輸?shù)膍iR-193a誘導(dǎo)足細(xì)胞損傷的機(jī)制，為研究FSGS的病因提供了新的思路。

致謝：標(biāo)本來自于國家腎臟疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心生物樣本庫。

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