王方嬡 鄒強(qiáng) 諶晶晶 單迎光 黃從新

TBX18是保守的轉(zhuǎn)錄因子 Tbox家族中與心臟靜脈極相關(guān)的TBX1亞族中的一員,是新的祖細(xì)胞標(biāo)志因子之一。在心臟發(fā)育過(guò)程中,眾多轉(zhuǎn)錄因子參與竇房結(jié)的生長(zhǎng)發(fā)育，包括Tbx18、Tbx3、SHOX2、Isl1等,TBX18在這些轉(zhuǎn)錄因子的上游，基因譜系分析表明在心臟流出道區(qū)域，表達(dá)TBX18的間質(zhì)祖細(xì)胞分化為具有起搏功能的心肌細(xì)胞并最終形成竇房結(jié)[1-2]。

本實(shí)驗(yàn)室前期以腺病毒為載體過(guò)表達(dá)TBX18能誘導(dǎo)脂肪干細(xì)胞(ADSCs)向起搏樣細(xì)胞分化，隨后使用經(jīng)皮微創(chuàng)的注射方式[3],將攜帶TBX18的腺病毒載體注入三度房室傳導(dǎo)阻滯的犬模型中成功構(gòu)建異位起搏節(jié)律點(diǎn)，然而腺病毒的表達(dá)時(shí)限較短且不能整合到宿主的染色體中，將TBX18導(dǎo)入細(xì)胞或動(dòng)物體內(nèi)構(gòu)建生物起搏表達(dá)持續(xù)時(shí)間短。筆者探索攜帶TBX18轉(zhuǎn)錄因子的慢病毒載體轉(zhuǎn)染ADSCs，使其整合到宿主細(xì)胞的染色體中以實(shí)現(xiàn)目的基因長(zhǎng)期持久的表達(dá)，觀察其能否誘導(dǎo)ADSCs向起搏細(xì)胞分化，進(jìn)而研究TBX18慢病毒載體構(gòu)建生物起搏的可行性。

1 材料與方法

1.1材料

低糖 DMEM(L-DMEM)培養(yǎng)基、胎牛血清( G ibco 公司 ) ,羊抗兔 α-SMA 多克隆抗體、驢抗羊 IgG 多克隆抗體 ( Chem icon 公司), I 型膠原酶、胰蛋白酶 (Sigma 公司)、Tbx18慢病毒、GFP慢病毒(漢恒公司)，SPF級(jí)雌性SD大鼠，重約40～50 g，來(lái)自武漢大學(xué)動(dòng)物試驗(yàn)中心。

1.2方法

1.2.1ADSCs的分離與培養(yǎng) 取大鼠雙側(cè)腹股溝脂肪墊約5 mL，取下后先在 PBS 液中漂洗 2 次，再移入超凈臺(tái)中，用PBS 液漂洗 3 次，后用眼科剪仔細(xì)地去除結(jié)締組織及血管內(nèi)皮，剪成 1 mm3左右的小塊；將剪碎的脂肪組織置于裝有 L-DMEM培養(yǎng)基的離心管中，加入 0.1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的 I 型膠原酶，置于37 ℃水浴箱中緩慢震蕩 45 min；加入等量的10%FBS的DMEM培養(yǎng)基終止消化，用100 μm的濾網(wǎng)過(guò)濾以除去其中未消化的組織，將上層液體移至新的離心管中，1 200 r/min 離心 5 min；將上清液輕輕吸出，將細(xì)胞沉淀用完全培養(yǎng)基(含10%FBS)重懸并稀釋?zhuān)俅坞x心1 200 r/min 離心 5 min；將上清液吸出，用完全培養(yǎng)基重懸，懸浮細(xì)胞經(jīng)血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)后，按3×104cells/mL 密度接種于培養(yǎng)皿后置于 37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)；48 h 后換液，以后隔2～3 d換一次液；并用相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化，貼壁細(xì)胞至 80%～90%融合時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2人TBX18慢病毒制備 pHBLV-CMV-MCS-3flag-EF1-ZSgreen-puro載體(漢恒公司提供)酶切線(xiàn)性化并膠回收；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增 TBX18的開(kāi)放閱讀框，酶切完成后 回 收 膠；采用HB-infusionTM無(wú)縫克隆試劑盒對(duì)將 酶切后的片段和酶切后的載體進(jìn)行克隆連接；轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5a；將轉(zhuǎn)化后的TBX18平板挑菌，提取質(zhì)粒后酶切鑒定，用293細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增，直至獲得大量純化的TBX18慢病毒載體。

1.2.3病毒轉(zhuǎn)染效率 確定ADSCs最適感染復(fù)數(shù)(MOI值)，取第 3 代 ADSCs 接種入24 孔板中，待生長(zhǎng)至 50%融合時(shí)，分別以 MOI=0，20，50，80，100 轉(zhuǎn)染攜帶Tbx18慢病毒，然后加入無(wú)血清DMEM 培養(yǎng)基使總體積為1 ml，混勻，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，感染后24 h，用新鮮的完全培養(yǎng)基替換含病毒的培養(yǎng)液，繼續(xù) 37℃培養(yǎng)。感染后48、72 h通過(guò)熒光顯微鏡觀察。同時(shí)各感染細(xì)胞分別加入 0.25%胰蛋白酶消化，250 μl PBS 重懸后于 200 目濾網(wǎng)過(guò)濾送檢，應(yīng)用流式細(xì)胞儀對(duì)GFP陽(yáng)性細(xì)胞率進(jìn)行定量分析。

1.2.4轉(zhuǎn)染細(xì)胞中目的蛋白的分析 取第 3 代 ADSCs 接種入6孔板中，待生長(zhǎng)至 50%融合時(shí)，棄培養(yǎng)基，PBS洗3遍，隨機(jī)分為T(mén)BX18組、GFP組、null組三組，每組設(shè)三個(gè)平行孔。TBX18組轉(zhuǎn)染TBX18慢病毒，GFP組轉(zhuǎn)染等量的GFP慢病毒作為空病毒對(duì)照組，null組不轉(zhuǎn)染病毒作為空白對(duì)照組。加入按最適MOI計(jì)算所需的慢病毒量(所需病毒液的體積=細(xì)胞數(shù)×MOI/病毒滴度)，然后加入無(wú)血清DMEM 培養(yǎng)基使總體積為 2 ml，混勻，置于CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，感染后24 h，用新鮮的完全培養(yǎng)基替換含病毒的培養(yǎng)液。轉(zhuǎn)病毒7天后，用TBS緩沖液潤(rùn)洗待測(cè)細(xì)胞2～3次，加入適當(dāng)體積的細(xì)胞總蛋白提取試劑裂解。收集細(xì)胞并在4°C 2 000 r/min離心5 min，吸取上清，即為總蛋白溶液。使用BCA蛋白質(zhì)濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定樣品的蛋白濃度。按照每泳道40 ug總蛋白進(jìn)行12%聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳。用5%脫脂奶粉TBST溶液封閉和稀釋一抗，GAPDH(以1∶10 000稀釋),TBX3(以1∶1 000稀釋),SHOX2(以1∶500稀釋),ISL1(以1∶1 000稀釋),縫隙連接蛋白Cx45(以1∶1 000稀釋)、Cx43(以1∶2 000稀釋)、Cx 30.2(以1∶1 000稀釋)、肌鈣蛋白(cTnI)(以1∶1 000稀釋)、α-肌動(dòng)蛋白(SMA)(以1∶5 000稀釋)和GADPH(以1∶10 000稀釋)。封閉1h后，一抗4°C過(guò)夜；后用TBST溶液沖洗。二抗采用HRP-GoatantiRabbit(以1∶10 000稀釋)孵育30min，并用TBST沖洗。用化學(xué)發(fā)光檢測(cè)法顯影。各條帶掃描后采用圖像分析系統(tǒng)分析平均灰度值，自以GADPH校正計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。GFP組及null組的檢測(cè)方法同前。

1.2.5α-SMA的檢測(cè) 取第3代 ADSCs 接種入6孔板中，待生長(zhǎng)至70%融合時(shí)，棄培養(yǎng)基，PBS洗3遍，隨機(jī)分為T(mén)BX18組、GFP組兩組，TBX18組轉(zhuǎn)染TBX18慢病毒，GFP組轉(zhuǎn)染等量的GFP慢病毒作為空病毒對(duì)照組。分別以最適MOI轉(zhuǎn)染TBX18慢病毒及GFP慢病毒，培養(yǎng)48 h 后換液，72 h 后置于熒光顯微鏡下觀察。棄去培養(yǎng)基，PBS洗滌 2 次，4%多聚甲醛固定 15 min，用 PBS 洗三遍，0.2% Triton X-100 通透 15 min，PBS 洗三遍，5% 羊血清封閉 30 min，加入一抗(羊抗兔 α-SMA，1∶100)，4℃濕盒內(nèi)過(guò)夜，用 PBS 洗3 遍，加驢抗羊 IgG 的二抗(1∶400)，室溫避光放 2 h，PBS 洗 3遍。棄掉洗滌液，最后用 DAPI 復(fù)染細(xì)胞核。甘油封固后，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.2.6TBX18,HCN4mRNA的檢測(cè) 取第 3 代 ADSCs 接種入6孔板中，待生長(zhǎng)至50%融合時(shí)，棄培養(yǎng)基，PBS洗3遍，隨機(jī)分為T(mén)BX18組、GFP組兩組，TBX18組轉(zhuǎn)染TBX18慢病毒，GFP組轉(zhuǎn)染等量的GFP慢病毒作為空病毒對(duì)照組。分別以最適MOI轉(zhuǎn)染TBX18慢病毒及GFP慢病毒，培養(yǎng)48 h 后換液，72 h 后置于熒光顯微鏡下觀察。分別采用實(shí)時(shí) RT-PCR 方法檢測(cè)第7、14、21、28天細(xì)胞TBX18及HCN4 mRNA水平，以 NAGPH作為內(nèi)參校正后計(jì)算的相對(duì)表達(dá)量。棄去培養(yǎng)基，PBS 洗 2 次，采用 Trizol 試劑提取總 RNA。取少量 RNA溶液用 TE 稀釋(1∶100) 后，讀取其在分光光度計(jì) 260 nm 和280 nm 處的吸收值，進(jìn)行 RNA 的濃度和純度的測(cè)定。進(jìn)行變性瓊脂糖凝膠電泳，并在紫外透射光下觀察其完整性。cDNA的合成體系：5 ×AMV Buffer 2.0 μL，dNTP Mixture 2.0 μL，AMV 1.0 μL，Oligo dT1.0 μL，RNase Inhibitor 1.0 μL，總RNA13 μL(2 μg)，加入逆轉(zhuǎn)錄酶 0.5 μL，37°C水浴 60min。然后 95 °C干浴 3min。PCR使用 SYBR Green I PCR 試劑盒。引物設(shè)計(jì):在http://www.ncbi.nlm.nih.gov檢索 TBX18和HCN4。引物序列如下：TBX18 5′-TGCTGTCCCTGCTACACATC-3′,5′-GCTGTAGGTCTCTGCCAAGG-3′;HCN4 5′-CACTAAGGGCAACAAGGAGACC-3′， 5′-TCTTTGTTGCCCTTAGTGAGC-3′反應(yīng)體系為：加入 SYBR Green 1 染料 10μL，引物混合物 1 μL，cDNA 5 μL，PCR 反應(yīng)條件為93°C，2 min。

2 結(jié)果

2.1脂肪干細(xì)胞的表型特征

脂肪干細(xì)胞進(jìn)行原代培養(yǎng),接種4 h后開(kāi)始貼壁，顯微鏡下觀察多呈圓形或橢圓形，細(xì)胞核居中。接種后24 h，細(xì)胞換液， 基本為貼壁細(xì)胞，有突起伸出，為多邊形、三角形或呈長(zhǎng)梭形。纖維細(xì)胞樣形態(tài)，漩渦狀或輻射狀生長(zhǎng)。原代培養(yǎng)的細(xì)胞 7 d 左右可達(dá) 80%～90% 融合，細(xì)胞集落間相互重疊交叉 ，可以傳代。傳代后細(xì)胞 24 h 貼壁，增長(zhǎng)迅速，2～3 d 可傳一代，經(jīng) 3 ～ 4代傳代純化，細(xì)胞逐漸朝一個(gè)方向排列，胞體細(xì)長(zhǎng)，類(lèi)似成纖維細(xì)胞樣形態(tài)，漩渦狀或輻射狀生長(zhǎng)。圖1。

圖1 光鏡下第三代ADSCs形態(tài)(× 200)

2.2病毒轉(zhuǎn)染效率

病毒轉(zhuǎn)染后72 h 后置于熒光顯微鏡下觀察，三組均有綠色熒光表達(dá)，MOI=20 組熒光亮度較弱，熒光細(xì)胞數(shù)量較少；50、80及100 組熒光亮度及表達(dá)的細(xì)胞數(shù)目相似。但 MOI 值過(guò)高可能會(huì)造成細(xì)胞毒性，MOI=80時(shí)細(xì)胞增殖減慢，胞體皺縮。當(dāng)MOI=100則出現(xiàn)細(xì)胞漂浮、死亡現(xiàn)象(圖 2)。因此我們選用 MOI=50 作為今后的轉(zhuǎn)染劑量。經(jīng)過(guò)持續(xù)觀察，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞體積變大，長(zhǎng)度增長(zhǎng)，核仁變大增多，一直有熒光表達(dá)。

A: 20 B: 50 C: 80 D: 100

MOIn0205080100轉(zhuǎn)染效率6045．6±3．287．7±2．188．7±2．792．3±2．4

2.3三組轉(zhuǎn)染細(xì)胞目的蛋白比較

TBX18組Tbx3、SHOX2、ISL1、cTN1、α-SMA、HCN4和Cx45、Cx30.2的蛋白表達(dá)水平顯著高于GFP組和null組，而Cx43與GFP組差異不大，但顯著低于null組(P<0.05,圖3、表2)。

2.4TBX18組及GFP組轉(zhuǎn)染細(xì)胞的α-SMA比較

TBX18組α-SMA陽(yáng)性細(xì)胞顯著增加，熒光顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞發(fā)出紅色熒光，GFP組均未見(jiàn)表達(dá)(圖4)。

2.5TBX18組及GFP組轉(zhuǎn)染細(xì)胞的TBX18,HCN4表達(dá)水平比較TBX18組可檢測(cè)到持續(xù)的TBX18及HCN4表達(dá)，且表達(dá)量顯著高于GFP組(P<0.05;表3)。

圖3轉(zhuǎn)錄因子(TBX3、ISL1、SHOX2)、縫隙連接蛋白(CX45、CX43、CX30.2)，cTNI、α-SMA的蛋白表達(dá)

表2 三組轉(zhuǎn)染細(xì)胞目的蛋白相對(duì)含量比較

注：與null組比較，*P<0.05;與GFP組比較，#P<0.05

3 討論

ADSCs 是源于脂肪組織的成體干細(xì)胞，具有自我更新和多向分化潛能且具有一定免疫調(diào)節(jié)功能的生物細(xì)胞，可抑制T淋巴細(xì)胞增殖和活化，不會(huì)引起免疫排斥反應(yīng)[4]。還具有取材簡(jiǎn)便，來(lái)源廣泛，患者創(chuàng)傷小，不存在倫理問(wèn)題等重要特性，有望成為構(gòu)建具有完整生物學(xué)功能的生物起搏細(xì)胞。

以往的基因治療方法大多是通過(guò)腺病毒作為載體將TBX18導(dǎo)入細(xì)胞或動(dòng)物體內(nèi)。與腺病毒相比，慢病毒最大優(yōu)點(diǎn)是在感染分裂期細(xì)胞的同時(shí)，還可感染靜止期的細(xì)胞，目的基因可經(jīng)過(guò)病毒整合酶作用整合與宿主染色體組相融合，且在細(xì)胞分裂和分化過(guò)程中不會(huì)丟失，具有感染范圍廣和可在體內(nèi)外長(zhǎng)期、穩(wěn)定表達(dá)優(yōu)勢(shì)[5-6]。除此之外，因?yàn)槁《臼且环N復(fù)制活性的假病毒，比腺病毒更具安全性，并且本研究應(yīng)用的第四代慢病毒包裝系統(tǒng)，相較于第三代包裝系統(tǒng)，其將 pol基因分離出來(lái)，使gag、pol和env成為 3個(gè)獨(dú)立載體，而不是兩個(gè)載體，進(jìn)一步提高了生物安全性且尚未發(fā)現(xiàn)慢病毒具有致瘤活性。

A～D為T(mén)BX18組, E～H為GFP組，圖中藍(lán)色為細(xì)胞核，綠色為病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，紅色為α-SMA表達(dá)細(xì)胞(×400)

組別GAPDHTBX18HCN4GFP組(n=6) 7d17．28±0．0428．73±0．1631．72±0．10 14d15．31±0．0625．69±0．0529．86±0．03 21d15．53±0．2524．92±0．0229．73±0．06 28d16．10±0．0326．63±0．0530．00±0．10TBX組(n=6) 7d13．77±0．0615．74±0．20?27．51±0．28? 14d15．22±0．0516．72±0．06?28．04±0．13? 21d15．57±0．1917．50±0．07?27．68±0．09? 28d15．00±0．0816．89±0．19?26．87±0．18?

注：與GFP組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)比較，*P<0.05

本研究初步探討了慢病毒介導(dǎo)TBX18誘導(dǎo)ADSCs分化為起搏樣細(xì)胞。筆者的結(jié)果顯示TBX18慢病毒載體體外能轉(zhuǎn)染入ADSCs ，細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生了變化，肌管樣細(xì)胞明顯增多，TBX18轉(zhuǎn)染的ADSCs中cTN1和α-SMA的蛋白表達(dá)水平顯著高于GFP組和null組，說(shuō)明誘導(dǎo)分化細(xì)胞已經(jīng)具有心肌細(xì)胞的特征，而且TBX18可上調(diào)Tbx3、Shox2、ISL1、HCN4和Cx45、Cx30.2的蛋白表達(dá)水平的同時(shí)下調(diào)Cx43的表達(dá)，說(shuō)明部分已經(jīng)有向起搏細(xì)胞分化。誘導(dǎo)4周后，轉(zhuǎn)染的ADSCs仍表達(dá)相對(duì)較高的熒光強(qiáng)度，并且RT-PCR證實(shí)TBX18組TBX18及HCN4在慢病毒轉(zhuǎn)染的1～4周內(nèi)有持續(xù)表達(dá)，且顯著高于GFP組，說(shuō)明慢病毒適用于長(zhǎng)時(shí)間觀察細(xì)胞在體內(nèi)外的生物學(xué)行為，比腺病毒更有可能構(gòu)建長(zhǎng)期的生物起搏活性。

雖然我們通過(guò)細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化和特異基因及縫隙連接蛋白的表達(dá)顯示ASDCs已有向起搏樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化，但本實(shí)驗(yàn)仍然存在一些不足：只檢測(cè)到HCN4蛋白的分子水平表達(dá)，未用膜片鉗檢測(cè)到起搏電流，未充分驗(yàn)證分化細(xì)胞的起搏功能以及未深入探討其內(nèi)在機(jī)制。這些還需進(jìn)一步研究。

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3 單迎光,趙慶彥,黃鶴,等.在體經(jīng)皮微創(chuàng)注射TBX18構(gòu)建生物起搏點(diǎn)[J].中國(guó)心臟起搏與心電生理雜志,2016，30(6):527

4 Rehman J, Traktuev D, Li J, et al. Secretion of angiogenic andantiapoptotic factors by human adipose stromal cells[J]. Circulation,2004,109(10):1 292

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