沈 斐， 許燕娟， 姜 晟， 趙 斌, 石浚哲

(1.無錫市環(huán)境監(jiān)測中心站，江蘇無錫 214121；2.江南大學環(huán)境與土木工程學院，江蘇無錫 214122；3.江蘇省環(huán)境監(jiān)測中心,江蘇南京 210036)

藻毒素是有害藍藻水華中出現(xiàn)頻率最高、造成危害最嚴重的污染物，目前已成為全球性的環(huán)境問題。微囊藻毒素(Microcystins,MC)是一類具有生物活性的環(huán)狀七肽化合物，是水華藍藻產(chǎn)生的細胞內(nèi)毒素，它在細胞內(nèi)合成，細胞破裂后釋放到水體中，具有強烈促癌作用[1]，同時也是污染范圍最廣、研究最多的藻毒素[2]。WHO于2004年在《飲用水衛(wèi)生準則》中規(guī)定MC-LR在飲用水中濃度不得高于1 μg/L。鑒于微囊藻毒素的毒性及危害，我國國家標準《地表水環(huán)境質(zhì)量標準》(GB 3838-2002)和2006年新頒布的《生活飲用水衛(wèi)生標準》(GB 5749-2006)已將MC-LR列入其中，控制限值為1 μg/L。目前，測定微囊藻毒素的方法主要有高效液相色譜(HPLC)[3 - 4]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)[5]和酶聯(lián)免疫分析(ELISA)[6]等。LC-MS/MS法具有高靈敏度、高選擇性等特點，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于微囊藻毒素的測定。

目前LC-MS/MS測定水中微囊藻毒素基本上采用的是外標法定量[7]。由于常用的外標法定量方法中標樣和待測樣是獨立進行實驗的，實驗間的偶然誤差無法消除。除此以外，LC-MS/MS測定過程中標樣和待測樣對于不同基質(zhì)所帶來的干擾較為敏感，基質(zhì)的不同會對實驗結(jié)果產(chǎn)生一定的誤差，而合適的內(nèi)標在一定條件下可以減少基質(zhì)所帶來的影響[8]。由于藻毒素同位素內(nèi)標物目前還無商品化的產(chǎn)品，亮氨酸腦啡肽的環(huán)狀結(jié)構(gòu)與藻毒素相似，已經(jīng)應(yīng)用于微囊藻毒素的測定[9 - 10]。本文研究建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)測定MC-LR、MC-RR、MC-YR、MC-LA、MC-LY、MC-LW和MC-LF 7種微囊毒素，并采用亮氨酸腦啡肽作為內(nèi)標物，使用內(nèi)標法進行定量分析，除此以外還對上述7種微囊藻毒素的子離子進行了探索。本研究在不需要對水樣進行繁雜前處理的前提下，只需通過0.22 μm濾膜過濾，利用超高效液相色譜快速的分離能力，在4 min內(nèi)即可同時獲知7種物質(zhì)的含量。方法具有快速、操作簡便、效率高、重復性好等特點，能夠更好地反映樣品的真實性和代表性，并且檢出限完全滿足《地表水環(huán)境質(zhì)量標準》(GB 3838-2002)的排放限值，特別適用于環(huán)境突發(fā)事件的應(yīng)急監(jiān)測，為及時反映污染情況及政府部門快速作出應(yīng)急措施提供參考。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑及材料

超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)，Acquity系列超高效液相色譜儀(美國，Waters公司)；API4000+串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國，AB Sciex公司)；Mili-Q去離子水發(fā)生器(美國，Millipore公司)；0.22 μm 聚醚颯(PES)針式濾頭(上海安譜科學儀器有限公司)。

甲醇、乙腈(色譜純，德國CNW科技公司)；甲酸(美國Sigma-Aldrich公司)； 微囊毒素：MC-LR、MC-RR、MC-YR、MC-LA、MC-LY、MC-LW和MC-LF(99%，瑞士Alexis Biochemicals)；亮氨酸腦啡肽(上海吉爾生化有限公司)。實驗用水為去離子水。

1.2 樣品采集及前處理

用500 mL棕色玻璃瓶采集滿瓶水樣(不留頂空)，采集后的水樣在4 ℃暗處儲存，當天分析。樣品過0.22 μm水相濾頭后，加入亮氨酸腦啡肽內(nèi)標溶液，直接進樣。由于微囊藻毒素具有弱疏水性，分子中的氨基及羧基又具有一定極性，在濾膜過濾過程中可能通過氫鍵吸附在濾膜表面，造成損失[11]。本實驗采用聚醚颯(PES)針式濾頭過濾樣品[11 - 12]，其測試結(jié)果和加標回收率并無明顯差別，適合方法要求。

1.3 儀器分析條件

色譜條件:采用Waters公司 Acquity BEH130 C18柱(100×2.1 mm,1.7 μm)，以含0.1%甲酸水溶液(A)和含0.1%甲酸的乙腈(B)作流動相，流速0.4 mL/min，柱溫40.0 ℃。梯度洗脫程序：0～1 min 20%B；1～2.5 min，20%～95%B；2.5～3.5 min 95%B；3.5～3.6 min 95%～20%B；3.5～4 min 20%B。進樣量為10 μL。

質(zhì)譜條件:采用多反應(yīng)監(jiān)測(MRM)模式，使用ESI+離子源，最佳噴霧電壓為5 500 V，氣簾氣(Curtain GAS)為20 psi，霧化氣(GSl)為55 psi，輔助加熱氣(GS2)為60 psi，噴針溫度(TEM)為450 ℃。特征離子的選取用針泵直接進樣，經(jīng)過對去簇電壓和碰撞能量等因素的優(yōu)化，確定了質(zhì)譜分析參數(shù)，列于表1。

表1 保留時間與質(zhì)譜分析參數(shù)Table 1 Retention time and parameters of MRM

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件

圖1 標準混合溶液的色譜圖Fig.1 The chromatogram of standards mixture

有報道利用甲醇/乙腈(40/60,V/V)作為流動相能很好地將7種微囊藻毒素完全分離[9]。雖然甲醇/乙腈(40/60,V/V)能夠?qū)⒒旌衔锖芎玫胤蛛x，但是由于樣品是水樣，純有機溶劑在混合樣品時容易導致混合不均勻，壓力不穩(wěn)，引起精密度變差及線性范圍變窄。純水和甲醇作為流動相雖然能夠提高離子在質(zhì)譜上的響應(yīng)，但是系統(tǒng)壓力較高，純水和乙腈作為流動相能夠控制超高效液相色譜的系統(tǒng)壓力，故本實驗選擇乙睛-水反相體系作為流動相。由于待測物均以正離子狀態(tài)進行檢測，因此在流動相中加入適量酸可以提高目標化合物的離子化效率，增加響應(yīng)值，特別是有助于藻毒素[M+2H]2+和[M+H]+母離子的形成，增強檢測的靈敏度。選擇0.1%甲酸最為合適，當甲酸的含量大于0.1%時，對于靈敏度及色譜峰形并未有區(qū)別。在梯度洗脫條件中，起始流動相采用高比例的水相有助于目標物與環(huán)境基體物質(zhì)分離，防止基質(zhì)效應(yīng)，影響目標物的電離效率[13 - 14]。色譜圖見圖1。

2.2 質(zhì)譜條件

根據(jù)微囊藻毒素的理化性質(zhì)和化學結(jié)構(gòu)，選擇ESI源作離子源，正模式分析。配制濃度為100 μg/L藻毒素的標準溶液，采用針泵直接連接質(zhì)譜樣品傳輸管(針泵流速為10 μL/min)進行一級質(zhì)譜掃描，確定各物質(zhì)的準分子離子峰，然后分別以其準分子離子為母離子，通過氫氣碰撞產(chǎn)生碎片離子進行二級質(zhì)譜掃描，選擇豐度較高的1到2種碎片離子作為定性與定量離子。母離子見表1，其中MC-LR、MC-YR常見的母離子[M+H]+分別為m/z996.0和m/z1046.0，實際測試過程中發(fā)現(xiàn)MC-LR母離子[M+2H]2+(m/z498.4)和MC-YR母離子(m/z523.4)響應(yīng)更高，靈敏度更高。在7種微囊藻毒素的各個子離子響應(yīng)：MC-LR(135.0>861.6)、MC-YR(134.9>911.4)、MC-RR(135.1>620.3)、MC-LA(135.1>213)、MC-LA(135.3>103.1)、MC-LW(135.1>213.1>375.0)和MC-LF (135.1>163.1>213.1>375.0)，見圖2。微囊藻毒素的共有基團Adda的甲氧基鍵斷裂形成的特征碎片離子(m/z135)相對于其他特征碎片離子響應(yīng)更高，所以本文選擇了m/z135作為定量離子。實際實驗中，采取定量離子時可以采用響應(yīng)更高的離子，以便提高物質(zhì)的檢出限以及定量的準確度，其它離子可以作為定性離子。

圖2 標準溶液子離子色譜圖：(a) 微囊藻毒素-LR；(b) 微囊藻毒素-YR；(c) 微囊藻毒素-RR；(d) 微囊藻毒素-LA；(e) 微囊藻毒素-LY；(f) 微囊藻毒素-LW；(g) 微囊藻毒素-LFFig.2 The chromatograms of product ions:(a)microcystin-LR；(b) microcystin-YR；(c) microcystin-RR；(d) microcystin-LA；(e) microcystin-LY；(f) microcystin-LW；(g) microcystin-LF

2.3 標準曲線繪制

配制藻毒素混合標準溶液并直接進樣，以目標組分的響應(yīng)值(y)對相應(yīng)的質(zhì)量濃度(x，μg/L)繪制標準曲線。在水中添加低濃度標準溶液，按樣品步驟處理后分析，計算標準偏差s，方法檢出限(MDL)按MDL=s×t(n-1，0.95)計算。式中，t(n-1，0.95)為置信度95%、自由度(n-1)時的t值；n為重復樣品數(shù)，結(jié)果見表2。如表2所見，內(nèi)標法繪制標準曲線時，相關(guān)系數(shù)能達到0.998以上;方法檢出限為0.143～0.468 μg/L，滿足日常對微囊藻毒素檢測的要求。

表2 標準曲線、相關(guān)系數(shù)與檢出限(n=7)Table 2 Linear regression equations,correlation coefficients and detection limits for microcystins(n=7)

2.4 方法的精密度和準確度

在空白水樣中添加不同濃度水平的標準溶液，按上述方法進行測定，每個濃度水平行測定7次，計算回收率及相對標準偏差(RSD)，結(jié)果見表3。結(jié)果表明，空白水樣的加標測定值的相對標準偏差(RSD)小于7.63%，回收率大于88%，滿足日常測定要求。

表3 回收率和精密度測定(n=7)Table 3 Recoveries and repeatability spiked at three levels(n=7)

2.5 實際水樣的測試

采集某地表水及飲用水多個點位的水樣和人工培養(yǎng)銅綠微囊藻樣品，進行實際樣品分析。樣品1#～4#為某湖水不同點位的微囊藻毒素測定結(jié)果。5#和6#為人工培養(yǎng)銅綠微囊藻的微囊藻毒素濃度。

表4 實際水樣的測定結(jié)果(μg/L)Table 4 Results of real sample detection(μg/L)

ND:not detected.

3 結(jié)論

以亮氨酸腦啡肽作為內(nèi)標物，采用UPLC-MS/MS內(nèi)標法測定地表水中7種微囊藻，取得了良好的分析結(jié)果。該分析方法僅需4 min即可完成7種目標物的分離測定，適合藻毒素污染的應(yīng)急突發(fā)事件和科學研究項目的快速定性定量測定。

參考文獻：

[1] Zhao S J,Xie P,Li G Y,et al.Proteomics,2012,12(2):300.

[3] LIANG L L,GONG A J,LI H M,et al.Chinese Journal of Analytical Chemistry(梁麗麗,弓愛君,李紅梅，等.分析化學),2010,38(8):740.

[4] Lalita N S,Sarika S M，Tapan C.Water Research,2006,40(19):3485.

[5] Liming C,Baifen H,Qi C,et al.Analytica Chimica Acta,2006,569(1-2):157.

[6] Tsutsumi T,Nagata S,Yoshida E,et al.Food AgricImmunol,2000,17:231.

[7] PéREZ S,AGA D S.Trac Trends in Analytical Chemistry,2005,24(7):658.

[8] TRUFELLI H,PALMA P,FAMIGLINI G,et al.Mass Spectrometry Reviews,2011,30(3):491.

[9] XU W,CHEN Q,ZHANG T,et al.Analytica Chimica Acta,2008,626(1):28.

[10] LI H,PAN G,ZHANG H G.Environmental Chemistry(李宏,潘綱,張洪剛.環(huán)境化學),2014,33(12):2087.

[11] JIA Y L,CHEN W,ZHAO S,et al.Acta Hydrobiologica Sinica(賈云璐,陳偉,趙爽，等.水生生物學報),2014,38(1):87.

[12] XIONG J,QIAN S,XIE Y H,et al.Environmental Monitoring in China(熊杰,錢蜀,謝永洪，等.中國環(huán)境監(jiān)測),2014,30(3):119.

[13] Li W,Duan J,Niu C,et al.Journal of Chromatographic Science,2011,49:665.

[14] Shen F,Wang L H,Zhou Q,et al.Water Air & Soil Pollution,2017,228(69):1.