劉 柱， 華 穎， 陳萬勤， 徐瀟穎， 趙超群，梁晶晶， 丁宇琦， 周 霞， 羅金文*

(1.浙江省食品藥品檢驗研究院，浙江杭州 310052；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江杭州 310053)

雌性激素可調(diào)節(jié)動物生長模式，誘導(dǎo)奶牛發(fā)情和泌乳，提高牛奶產(chǎn)量[1]，但牛奶中激素殘留會隨著日常攝入在人體內(nèi)蓄積，導(dǎo)致內(nèi)分泌失調(diào)、生殖功能障礙、發(fā)育異常等病變[2]。我國農(nóng)業(yè)部176號、193號公告明確規(guī)定，禁止飼料和動物飲用水中添加己烯雌酚、雌二醇等雌性激素，農(nóng)業(yè)部235號公告規(guī)定己烯雌酚、己烷雌酚等外源性激素物質(zhì)在動物源性食品中不得檢出。因此，建立快速高效、準(zhǔn)確靈敏的雌性激素殘留檢測方法顯得十分重要。

目前激素殘留的測定方法主要有氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[3]、高效液相色譜法(HPLC)[4]和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)[5 - 7]。LC-MS/MS法測定激素時具有高選擇性和高靈敏度，且不需要衍生，但牛奶基質(zhì)復(fù)雜，激素的殘留量低，因此樣品前處理技術(shù)成為牛奶中雌性激素檢測的關(guān)鍵。多壁碳納米管(MWCNTs)是一種新型納米材料，于1991年由日本科學(xué)家Iijima首次發(fā)現(xiàn)[8]，它具有獨特的空間結(jié)構(gòu)，比表面積大、理化性質(zhì)穩(wěn)定，能通過靜電、范德華力和疏水等相互作用與不同性質(zhì)的化合物相互吸附，自被發(fā)現(xiàn)以來就引起了廣泛關(guān)注[9 - 10]，已被成功應(yīng)用于水體中多環(huán)芳烴、農(nóng)藥、磺胺等農(nóng)獸藥污染物的分離富集[11 - 12]。李魚等[4]使用MWCNTs作為固相萃取柱的填料實現(xiàn)了水樣中雌三醇、17α-乙炔基雌二醇及17β-雌二醇等微量激素的富集。然而MWCNTs的疏水性限制了它的應(yīng)用范圍[13]。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)MWCNTs兩端具有球形富勒烯突起，使用H2SO4和HNO3等強(qiáng)酸處理能產(chǎn)生羥基、羧基等官能團(tuán)[14]，有望實現(xiàn)對甾體類化合物的高效富集。而將MWCNTs改性修飾后再作為固相萃取材料應(yīng)用于雌性激素的研究尚未見報道。

本文采用氧化性強(qiáng)酸實現(xiàn)對MWCNTs進(jìn)行表面氧化改性的修飾，再應(yīng)用固相萃取(SPE)技術(shù)實現(xiàn)對牛奶樣品中雌性激素的富集、凈化，結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)分析技術(shù)建立牛奶中雌性激素的定性、定量檢測方法。本研究對于擴(kuò)展MWCNTs的應(yīng)用范圍，解決牛奶等復(fù)雜基質(zhì)樣品的前處理難題具有重要意義。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

AB 5500 QTRAP質(zhì)譜儀(美國，AB Sciex公司)；LC-30AD超高效液相色譜儀(日本，島津公司)；Milli-Q超純水器(美國，Millipore公司)；高速冷凍離心機(jī)(美國，Thermo公司)；KH-500DV超聲儀(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；全自動氮吹濃縮儀(美國，Biotage公司)。

雌二醇(98.0%±1.0%)、雌三醇(98.8%±0.5%)、己烯雌酚(99.5%±1.0%)、己烷雌酚(99.8%±0.5%)、己二烯雌酚(96.0%±1.0%)、雌酮(99.5%±0.5%)，均購自德國Dr.Ehrenstorfer公司；炔雌醇(≥98%)購自美國SIGMA公司；己烯雌酚-D8(98.9%)、雌酮-D2(99.5%)、己烷雌酚-D4(98.5%)均購自加拿大T.R.C.公司；已二烯雌酚-D2(85.6%)購自北京振翔公司。雌激素標(biāo)準(zhǔn)溶液：準(zhǔn)確稱取上述雌性激素標(biāo)準(zhǔn)品，分別用甲醇配制成1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-18 ℃下避光保存；將上述各單標(biāo)儲備液用甲醇稀釋成10 mg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，于-18 ℃下避光保存；使用前用50%甲醇將混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液稀釋成濃度為1 000 μg/L和100 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)工作液。準(zhǔn)確稱取上述雌性激素的同位素內(nèi)標(biāo)分別用甲醇配制成500 mg/L的同位素內(nèi)標(biāo)儲備液，于-18 ℃下避光保存；再將上述各同位素內(nèi)標(biāo)儲備液用甲醇稀釋成1 000 μg/L的混合同位素內(nèi)標(biāo)工作液，于-18 ℃下保存。甲醇、乙腈、乙酸乙酯、叔丁基甲醚、正己烷，均為色譜純(Merk公司)；乙酸、氨水為色譜純(Sigma公司)；HNO3、H2SO4為優(yōu)級純(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；其它試劑均為分析純。

1.2 MWCNTs固相萃取柱的制備

1.2.1MWCNTs表面修飾處理稱取2.0 g MWCNTs粉末，置于500 mL平底燒瓶中，緩慢加入100 mL濃H2SO4，超聲分散30 min，加入150 mL濃HNO3，常溫超聲1 h，于加熱反應(yīng)釜中120 ℃回流1 h，再降至60 ℃回流12 h(過夜)，冷卻至室溫，除去上層酸液，去離子水反復(fù)洗至中性，80 ℃干燥，研磨成細(xì)粉，即得表面修飾的MWCNTs。

1.2.2裝柱及活化取表面修飾MWCNTs粉末150 mg，加入10 mL甲醇，震蕩混合使表面修飾MWCNTs粉末分散在甲醇中，快速倒入6 mL固相萃取空柱中，調(diào)節(jié)甲醇流速為1滴/秒，使MWCNTs均勻填充，放置6 mL固相萃取柱專用柱篩板。使用前依次用5 mL甲醇、5 mL水活化。

1.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取5.00 g牛奶樣品(固體奶粉復(fù)原后稱取)于50 mL離心管中，加入10 mL乙腈，渦旋混合1 min，超聲提取10 min，于4 ℃下15 000 r/min高速離心10 min，取5 mL上清液，用去離子水稀釋10倍后全部過固相萃取柱，依次用10 mL水和10 mL 10%甲醇溶液淋洗，抽至近干后，用5 mL的氨水-甲醇(5∶95，V/V) 溶液洗脫，收集洗脫液，重復(fù)洗脫一次，合并洗脫液，整個過程控制流速1 mL/min，洗脫液于45 ℃下氮氣吹至近干，準(zhǔn)確加入1.0 mL初始流動相復(fù)溶，過0.22 μm微孔濾膜后，供UPLC-MS/MS分析。

1.4 UPLC-MS/MS分析條件

1.4.1UPLC條件色譜柱：Waters ACQUITY UPLC?BEH C18柱(100×2.1 mm,1.7 μm)；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣體積：5 μL；流速：0.4 mL/min；流動相：0.02%氨水溶液(A相)，乙腈(B相)；梯度洗脫程序：0～5 min，80%～20%A；5～6 min，20%A；6～6.1 min，20～80%A；6.1～9 min，80%A。

1.4.2MS條件采用多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)檢測，負(fù)離子模式：噴霧電壓4.5 kV，霧化器壓力(GS1)345 kPa，輔助氣壓力(GS2)345 kPa，離子源溫度500 ℃，氣簾氣壓力(CUR)275 kPa。優(yōu)化后的母離子、子離子和錐孔電壓、碰撞能量等相關(guān)參數(shù)見表1。

表1 雌性激素的主要質(zhì)譜參數(shù)和保留時間Table 1 MS parameters and retention time for the analysis of estrogens

*Quantitative ion.

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜方法建立

采用蠕動泵將濃度為100 μg/L的雌性激素溶液及同位素內(nèi)標(biāo)溶液連續(xù)直接進(jìn)樣，在ESI-模式下，確定各目標(biāo)化合物的母離子和子離子，分別優(yōu)化毛細(xì)管電壓、錐孔電壓、碰撞能量和碰撞室出口電壓等質(zhì)譜參數(shù)，以達(dá)到最佳靈敏度。在優(yōu)化條件下，選擇相對豐度較高、響應(yīng)穩(wěn)定的離子作為定量離子，優(yōu)化后的質(zhì)譜參數(shù)詳見表1。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

圖1 7種雌性激素的總離子流(TIC)色譜圖Fig.1 TIC chromatogram of 7 estrogens1.estradiol；2.estriol；3.ethinylestradiol；4.estrone；5.diethylstilbestrol；6.dienestrol；7.hexestrol.

鑒于目標(biāo)化合物都含-OH或-CO-的類甾體物質(zhì)，極性中等偏弱，實驗選擇Water公司ACQUITY UPLC?BEH C18柱(100×2.1 mm,1.7 μm)、Cortecs C18柱(100×2.1 mm，2.7 μm)和HSS T3柱(100×2.1 mm,1.8 μm)三種不同類型的色譜柱進(jìn)行考察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)ACQUITY UPLC?BEH C18色譜柱對目標(biāo)化合物的分析效果較好，保留時間適中，峰形尖銳，可滿足對20種目標(biāo)物的定性、定量檢測要求。

比較乙腈-水和甲醇-水兩種流動相，結(jié)果表明乙腈-水作為流動相時分離度和靈敏度明顯優(yōu)于甲醇-水。為進(jìn)一步提高化合物的離子化效率，增加靈敏度，結(jié)合目前LC-MS/MS法檢測雌性激素和孕激素的相關(guān)報道[7,15]，在流動相中添加對負(fù)離子有增強(qiáng)作用的氨水，通過比較0.01%～0.04%的氨水濃度對靈敏度的影響，最終確定流動相為乙腈-0.02%氨水溶液；再優(yōu)化流動相比例，最終選擇線性梯度洗脫，目標(biāo)物分離度較好、保留時間適中，優(yōu)化后的多反應(yīng)監(jiān)測總離子流色譜圖見圖1。

2.3 表面修飾MWCNTs的表征

本實驗參考彭曉俊等[16]對MWCNTs的表面改性處理方式，用濃H2SO4和濃HNO3組成的混酸對MWCNTs進(jìn)行化學(xué)切割，并在碳納米管的表面氧化形成一定量的含氧官能基團(tuán)-COOH和-OH。本實驗與彭曉俊等的工藝不同，增加濃HNO3的比例，選擇120 ℃回流1 h，再60 ℃回流12 h，可有效除去MWCNTs中的雜質(zhì)顆粒，增加MWCNTs表面含氧官能團(tuán)的數(shù)量。氧化修飾后MWCNTs可以在水中分散成懸浮液，黑色顆粒沒有下沉，這可能是由于氧化修飾后的MWCNTs中含有-COOH等含氧親水官能團(tuán)，增加了MWCNTs的親水性[17]。應(yīng)用掃描電鏡進(jìn)行表征，結(jié)果如圖2所示，氧化處理后的MWCNTs長度分布均勻，長徑比適中，其傅里葉變換紅外(FT-IR)光譜測試的結(jié)果與彭曉俊等[16]的結(jié)果相同，在特征峰3 734 cm-1出現(xiàn)羧基的特征峰，在3 414 cm-1處出現(xiàn)羥基的伸縮振動峰，因此表明對MWCNTs的表面氧化修飾產(chǎn)生了羥基和羧基官能團(tuán)。

圖2 表面修飾MWCNTs的掃描電鏡(SEM)圖Fig.2 SEM images of surface modified MWCNTs

2.4 樣品提取方式的優(yōu)化

牛奶成分復(fù)雜，除含大量水外還含有蛋白質(zhì)、脂肪、碳水化合物等成分。牛奶中農(nóng)獸藥殘留的檢測大多采用乙腈作為提取溶劑。本文分別考察了甲醇、乙腈、叔丁基甲醚和乙酸乙酯4種提取溶劑的提取效果，結(jié)果與曹慧關(guān)于牛奶中青霉素的檢測[18]和趙超敏關(guān)于牛奶中4中雌性激素的檢測[19]的研究結(jié)果一致，甲醇和乙腈都具有提取雌激素的同時沉淀蛋白質(zhì)的作用，而乙腈沉淀蛋白的能力較甲醇強(qiáng)，沉淀效果好，離心后上清液與沉淀物完全分離，故本研究采用乙腈作為提取溶劑。

2.5 固相萃取條件的優(yōu)化

表面修飾MWCNTs作為固相萃取柱的填料是影響凈化效果的直接因素，為了確保固相萃取小柱填料的均勻性，減少萃取柱中氣泡，本實驗采用濕法裝柱，與彭曉俊等[16]和寇立娟等[20]采用的干法填充相比，表面氧化修飾MWCNTs填充的更加均勻、緊密，凈化效果更好。本實驗先將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液添加至5 mL 乙腈-水(2∶1,V/V)的溶液中，確定提取液的稀釋倍數(shù)，再將混合標(biāo)準(zhǔn)溶液添加至空白樣品中，研究淋洗液和洗脫液的種類、用量等因素對固相萃取的影響，考察固相萃取參數(shù)。

2.5.1提取液稀釋倍數(shù)的確定移取500 μL混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液(10 mg/L)至50 mL乙腈-水(2∶1,V/V)溶液中，分別移取5 mL加標(biāo)溶液5份，采用不稀釋、5倍稀釋、10倍稀釋、15倍稀釋、45 ℃氮氣吹干后用水復(fù)溶的5種方式經(jīng)固相萃取柱凈化，通過檢測流出液中目標(biāo)化合物的濃度，考察乙腈提取液的處理方式，結(jié)果表明：提取液不經(jīng)稀釋直接過固相萃取時，流出液中可檢測出7種雌性激素，濃度在40～60 μg/L之間，這是由于雌性激素在乙腈中的溶解性好，分配系數(shù)大導(dǎo)致目標(biāo)化合物沒有被固相萃取柱全部吸附；采用將提取液45 ℃氮氣吹干再用水復(fù)溶后過柱的凈化方式，由于提取液中含有大量水，濃縮速度慢、耗時長，且濃縮過程中會產(chǎn)生懸浮固形物，堵塞柱篩板，造成部分目標(biāo)化合物的損失。將提取液用水稀釋10倍后過柱，流出液中7種目標(biāo)化合物均未檢出，表明溶液中乙腈含量低于7%時，7種雌性激素可以被氧化修飾MWCNTs固相萃取柱全部吸附。因此本實驗選擇將提取液用水稀釋10倍后再使用固相萃取柱凈化。

圖3 樣品溶液的pH對萃取效率的影響Fig 3 Effect of the pH value of the sample solution on the extraction efficiency

2.5.2溶液pH值的影響樣品溶液的pH值能影響化合物的電離平衡，改變目標(biāo)分析物存在狀態(tài)，影響目標(biāo)化合物與萃取劑之間的分配系數(shù)[21]，還能改變固相萃取材料氧化修飾MWCNTs表面官能團(tuán)的類型和密度，影響對目標(biāo)化合物的吸附效果[22]。本文所研究的目標(biāo)化合物呈弱酸性，所以考察pH值為2～10時MWCNTs固相萃取柱對目標(biāo)化合物的萃取效果，選擇pH值影響較大的4種雌性激素的回收率結(jié)果繪制圖3，結(jié)果表明萃取效率隨著pH值的升高而降低，特別是在堿性條件下，萃取效率急速下降，溶液的pH=6.0±1.0時的萃取效果較好。故純牛奶樣品可以直接采用純水稀釋后上樣，而酸奶或乳酸飲料等特殊樣品需采用純水稀釋后再調(diào)節(jié)pH=6.0±1.0后上樣。

2.5.3淋洗液和洗脫液的選擇及用量選擇合適的淋洗液可有效去除未被吸附的雜質(zhì)和被吸附的極性較大雜質(zhì)，減小給質(zhì)譜分析帶來的基質(zhì)效應(yīng)。分別采用5%、10%、15%、20%的甲醇溶液作為淋洗液進(jìn)行試驗，研究結(jié)果表明采用10 mL 10%的甲醇溶液作為淋洗液時各化合物的基質(zhì)效應(yīng)低，且淋洗液中7種雌性激素均未檢出，故采用10 mL水和10 mL 10%的甲醇溶液作為淋洗液，以去除雜質(zhì)。

本文選擇在甲醇和乙腈中添加不同比例的氨水作為洗脫劑，考察洗脫效果。結(jié)果表明，5%氨水-甲醇和5%氨水-乙腈的洗脫效果相當(dāng)，各化合物的絕對回收率均大于80%，而乙腈較甲醇的毒性強(qiáng)，且不宜吹干，所以選擇氨水-甲醇(5∶95，V/V)溶液作為洗脫液，分兩次進(jìn)行洗脫，可以達(dá)到好的洗脫效果。

2.6 方法學(xué)驗證

2.6.1線性范圍、檢出限和定量限分別準(zhǔn)確移取混合標(biāo)準(zhǔn)工作液和混合同位內(nèi)標(biāo)工作液，用初始流動相配制成1～100 μg/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以雌酮-D2作為雌二醇、雌三醇、雌酮、炔雌醇的同位素內(nèi)標(biāo)，己二烯雌酚-D2作為己二烯雌酚的同位素內(nèi)標(biāo)，己烷雌酚-D4作為己烷雌酚的同位素內(nèi)標(biāo)，己烯雌酚-D8作為己烯雌酚的同位素內(nèi)標(biāo)，以待測物質(zhì)的峰面積和相應(yīng)內(nèi)標(biāo)的峰面積的比值(Y)為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度(X)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表2。結(jié)果表明7種雌性激素的線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均大于0.99；在5 g空白基質(zhì)樣品中加入200 μL混合標(biāo)準(zhǔn)工作液(10 μg/L)，理論加標(biāo)濃度為0.4 μg/kg，按照本文建立分析方法進(jìn)行檢測，結(jié)果信噪比均大于100，鑒于質(zhì)譜本身的穩(wěn)定性、不同儀器間的差異、信噪比和方法的適用性，確定本方法的檢出限為0.02～0.1 μg/kg，定量限為0.06～0.3 μg/kg。

表2 雌性激素的標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢出限(LODs)和定量限(LOQs)Table 2 The linear equations,correlation coefficients(r),LODs and LOQs of estrogens

2.6.2方法的適用性、回收率和精密度為了驗證方法的準(zhǔn)確性和可靠性，在陰性樣品中分別加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和混合同位素內(nèi)標(biāo)工作液，使加標(biāo)水平為0.5、5和10 μg/kg，每個濃度水平按照優(yōu)化后的方法平行測試6次，回收率和精密度的計算結(jié)果見表3。雌性激素的回收率在86.7%～103.6%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)在1.5%～6.9%之間，表明本方法的準(zhǔn)確度和精密度良好。

表3 方法的精密度和回收率(n=6)Table 3 Precision and recovery of the method(n=6)

實際樣品和加標(biāo)樣品的色譜圖見圖4。

圖4 陰性樣品(a)及陰性樣品中添加7種雌性激素(b)的MRM色譜圖Fig.4 MRM chromatograms of a negative milk sample(a) and a negative milk sample spiked with 7 estrogens 1.estradiol;2.estriol;3.ethinylestradiol;4.estrone;5.diethylstilbestrol;6.dienestrol;7.hexestrol.

3 結(jié)論

本文采用物理和化學(xué)手段對MWCNTs表面進(jìn)行氧化修飾，采用濕法裝柱的方式自制固相萃取小柱，考察溶液的pH值，淋洗液和洗脫液的種類和用量，確定固相萃取參數(shù)，實現(xiàn)對牛奶中7種雌性激素的快速富集和凈化，結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)技術(shù)，建立了一種同時快速檢測牛奶中7種雌性激素殘留的分析方法。在樣品前處理中加入同位素內(nèi)標(biāo)，不但能有效的去除基質(zhì)效應(yīng)的影響，還能排除前處理過程因樣品損失造成的回收率不穩(wěn)定的問題。將本文建立的方法與國家標(biāo)準(zhǔn)方法和已報道的方法進(jìn)行比對，表明該方法檢測成本低、分析速度快、基質(zhì)干擾小、檢出限低、定量結(jié)果更加準(zhǔn)確，為牛奶中雌性激素的微量分析提供更加準(zhǔn)確可靠的定性篩查和定量分析方法。

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