張?jiān)苽?， 黃優(yōu)生， 胡海山， 鄢 兵

(江西省分析測(cè)試研究所,江西南昌 330029)

近年來(lái)，嬰幼兒配方乳粉中激素殘留引起了人們的注意。不過(guò)，包括酸奶在內(nèi)的液體乳制品中激素檢測(cè)的研究報(bào)道并不多。本文重點(diǎn)選取5種激素，對(duì)包括奶粉、乳飲料、酸奶在內(nèi)的乳制品樣品進(jìn)行相關(guān)殘留檢測(cè)的方法研究。目前國(guó)內(nèi)外已有許多關(guān)于激素檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)與文獻(xiàn)報(bào)道，主要采用液相色譜法[1]、酶聯(lián)免疫吸附分析[2]、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[3 - 5]與氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[6 - 7]等方法。液相色譜法靈敏度低；酶聯(lián)免疫法操作步驟多，假陽(yáng)性率較高；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定激素時(shí)具有較高的靈敏度，但需要長(zhǎng)時(shí)間的衍生化過(guò)程。液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用測(cè)定激素時(shí)不僅具有較高靈敏度，而且不需要衍生就可以直接測(cè)定，提高了分析樣品的工作效率。

本方法在已有的標(biāo)準(zhǔn)與文獻(xiàn)研究的基礎(chǔ)上，優(yōu)化了提取、凈化、色譜測(cè)定等參數(shù)，成功建立了固相萃取(SPE)凈化、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法測(cè)定液體乳制品中雌酮、已烯雌酚、雙烯雌酚、已烷雌酚和孕酮5種激素的分析方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1200高效液相色譜儀，Agilent 6410高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)，Agilent公司)；HC-3514高速離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司)；DC-12氮吹儀(上海安譜科學(xué)儀器廠)；XH-B型渦旋混合器(江蘇康健醫(yī)療用品有限公司)；Milli-Q去離子水制備系統(tǒng)(美國(guó)，Millipore公司)；KQ-5200DE型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。CNWBOND NH2SPE小柱(500 mg/3mL)，CNWBOND LC-C18 SPE小柱(500 mg/3mL)，Poly-Sery HLB SPE小柱(60 mg/3mL)，Poly-Sery HLB SPE小柱(60 mg/3mL)。

標(biāo)準(zhǔn)品：雌酮、已烯雌酚、雙烯雌酚、己烷雌酚和孕酮(德國(guó)Dr.Ehrenstorfer公司)。標(biāo)準(zhǔn)品溶液的配制:分別準(zhǔn)確稱取雌酮、已烯雌酚、雙烯雌酚、己烷雌酚和孕酮標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg，置于50 mL容量瓶中,加入一定量的乙腈超聲溶解，冷卻至室溫，然后定容至刻度，搖勻，得濃度為0.2 mg/mL的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液，于4 ℃冰箱中避光保存。然后再吸取儲(chǔ)備液1 mL于20 mL容量瓶中，用50%乙腈溶液定容至刻度，搖勻，制備成10.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。乙腈(色譜純，Tedia公司)；甲醇(色譜純，Sigma-Aldrich公司)。實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

乳制品購(gòu)自當(dāng)?shù)爻小?/p>

1.2 樣品處理

液體乳制品：準(zhǔn)確稱取5.00 g樣品，置于50 mL帶螺旋蓋的聚丙烯離心管中，加入20 mL甲醇，渦旋混勻1 min，以3 500 r/min離心5 min，殘?jiān)偌?0 mL甲醇重復(fù)提取一次，合并上清液，于50 ℃真空濃縮至近干；加入1 mL甲醇超聲溶解，加10 mL水，過(guò)SPE小柱，用3 mL 10%甲醇淋洗，5 mL甲醇洗脫，50 ℃水浴氮?dú)獯蹈?；加? mL 50%乙腈溶液，渦旋溶解，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后，濾液供LC-MS/MS測(cè)定。

固體乳制品：準(zhǔn)確稱取2.00 g樣品，置于50 mL帶螺旋蓋的聚丙烯離心管中，加入5 mL水渦旋混勻1 min，加入20 mL甲醇，渦旋混勻1 min，以3 500 r/min的轉(zhuǎn)速離心5 min，殘?jiān)偌?0 mL甲醇重復(fù)提取一次，合并上清液，于50 ℃真空濃縮至近干；加入1 mL甲醇超聲溶解，加10 mL水，過(guò)SPE小柱，用3 mL 10%甲醇淋洗，5 mL甲醇洗脫，50 ℃水浴氮?dú)獯蹈?；加? mL 50%乙腈水溶液，渦旋溶解，經(jīng)0.22 μm濾膜過(guò)濾后，濾液供LC-MS/MS測(cè)定。

1.3 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

液相色譜條件：色譜柱:ZORBAX SB -C18柱(100×2.1 mm,3.5 μm)。ESI負(fù)離子模式：流動(dòng)相為乙腈(A)與5 mmol/L乙酸銨溶液(B)，梯度洗脫程序：0～1 min，10%～80%A；1～3 min，80%A；3～3.1 min，80%～10%A；3.1～8 min，10%A。流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；柱溫：40 ℃。ESI正離子模式：流動(dòng)相為乙腈(A)與0.1%甲酸溶液(B)，梯度洗脫程序：0～1 min，30%～80%A；1～3 min，80%A；3～3.1 min，80%～10%A；3.1～8 min，10%A。流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；柱溫：40 ℃。

串聯(lián)質(zhì)譜條件：離子源:電噴霧離子源(ESI)；檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；干燥氣溫度：350 ℃；干燥氣流速：10 L/min；霧化氣壓力：275.8 kPa；毛細(xì)管電壓：4 000 V；電子倍增管電壓：300 V。每種化合物的離子源模式、母離子、子離子、駐留時(shí)間、錐孔電壓、碰撞能量等質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 5種激素的質(zhì)譜采集參數(shù)Table 1 Mass spectrometric acquisition parameters of 5 hormones

*quantitative ion.

2 結(jié)果與討論

2.1 固相萃取凈化條件的選擇

實(shí)驗(yàn)分別用不同比例的甲醇水溶液和水溶解樣品殘?jiān)蟛捎霉滔噍腿≈鶅艋?，結(jié)果表明上樣溶液中甲醇含量低于20%時(shí)，5種目標(biāo)激素能完全保留在固相萃取柱中。為了保證所有目標(biāo)物均能保留在固相柱中，選用20%甲醇作為上樣液。實(shí)驗(yàn)分別試驗(yàn)了CNWBOND LC-C18 SPE小柱、Poly-Sery HLB SPE小柱、CNWBOND NH2SPE小柱、Poly-Sery HLB SPE小柱、石墨化碳黑小柱，對(duì)加標(biāo)后液體奶的凈化效果及回收率。結(jié)果顯示前兩種SPE小柱的凈化效果好，考慮價(jià)格因素，本實(shí)驗(yàn)采用CNWBOND LC-C18 SPE小柱來(lái)凈化樣品。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用1 μg/mL單標(biāo)準(zhǔn)溶液，以流動(dòng)注射的方式在正、負(fù)離子模式下進(jìn)行母離子全掃描，確定化合物的分子離子。孕酮在正離子模式下得到信號(hào)較強(qiáng)的母離子[M+H]+；已烯雌酚、雙烯雌酚、雌酮、己烷雌酚在負(fù)離子模式下才能獲得準(zhǔn)分子離子峰[M-H]-。再分別以待測(cè)物的分子離子峰為母離子，進(jìn)行子離子全掃描，選取豐度較強(qiáng)、干擾較小的兩個(gè)子離子作為定性與定量離子，優(yōu)化得到的質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2.3 色譜條件的優(yōu)化

已烯雌酚、雙烯雌酚、雌酮、己烷雌酚作為雌激素，在流動(dòng)相中加入乙酸銨可以增加其離子化效率，本研究用乙腈-5 mmol/L乙酸銨溶液為流動(dòng)相進(jìn)行色譜條件的優(yōu)化。孕酮作為孕激素，在流動(dòng)相中加入甲酸可以增加其離子化效率，本研究用體積分?jǐn)?shù)為0.1%甲酸溶液-乙腈為流動(dòng)相進(jìn)行色譜條件的優(yōu)化。采用梯度洗脫的方法，可以獲得較好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果(圖1)。

圖1 5種激素的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)色譜圖Fig.1 MRM chromatograms of 5 hormones1:estrone，2:diethyostilbestrol，3:dienestrol,4:hexestrol，5:progesterone.

2.4 線性范圍和檢出限

用流動(dòng)相逐級(jí)稀釋標(biāo)準(zhǔn)品貯備液，得一系列濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以濃度x為橫坐標(biāo)，峰面積y為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，考察峰面積與濃度的線性關(guān)系。以逐漸降低樣品中標(biāo)準(zhǔn)溶液添加量的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，以10倍信噪比(S/N=10)對(duì)應(yīng)濃度換算為定量限(LOQ)。結(jié)果表明，5個(gè)組分的峰面積與質(zhì)量濃度呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.9995，定量限為1～20 μg/kg，結(jié)果見表2。

表2 標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)和定量限(LOQ)(n=6)Table 2 Linear equations,correlation coefficients and limits of quantification (LOQ)(n=6)

2.5 方法的回收率與精密度

為了驗(yàn)證方法的可靠性，進(jìn)行了回收率實(shí)驗(yàn)。稱取不含激素殘留的空白樣品進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)加入回收實(shí)驗(yàn)，加入一定量的混合對(duì)照品溶液，按1.2方法處理后，平行測(cè)定6次，結(jié)果見表3。

2.6 實(shí)際樣品的測(cè)定

采用本方法對(duì)24種市售液體乳制品和9種固體乳制品進(jìn)行了激素含量的測(cè)定。經(jīng)測(cè)定，16種液體乳制品中含有孕酮，含量介于1.4 μg/kg與32 μg/kg之間；2種樣品檢出雙烯雌酚和已烯雌酚，含量接近檢出限；其它組分未檢出。2種固體乳制品中檢出孕酮，含量在10 μg/kg 和20 μg/kg之間；其它組分未檢出。

表3 方法的回收率和精密度(n=6)Table 3 Recoveries and precisions of the method (n=6)

3 結(jié)論

建立了一種可以準(zhǔn)確測(cè)定乳制品中多種激素的分析方法。結(jié)果表明，建立的方法快速、簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確，能夠滿足日常樣品檢測(cè)需求。

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