鄧振山，段陽(yáng)陽(yáng)

(延安大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 延安 716000)

植物促生菌(plant growth-promoting bacteria,PGPB)是指從植物根系表面或者植物體內(nèi)分離出來(lái)的、可促進(jìn)植物生長(zhǎng)及其對(duì)礦物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)的吸收和利用，并能抑制有害生物的一類有益菌株。植物促生菌對(duì)植物的促生作用是通過(guò)多種機(jī)制和途徑實(shí)現(xiàn)的，主要包括：(1)產(chǎn)生調(diào)節(jié)植物生長(zhǎng)的信號(hào)物質(zhì)，如吲哚乙酸、赤霉素、細(xì)胞分裂素和乙烯；(2)非共生固氮；(3)抵抗病原菌；(4)溶解磷礦物及其他養(yǎng)分；(5)產(chǎn)生鐵載體；(6)產(chǎn)生1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸ACC脫氨酶[1]。此外，PGPB還能提高植物的抗逆性，如耐干旱、高鹽、重金屬毒害和農(nóng)藥，是防治植物病蟲(chóng)害和誘導(dǎo)抗病性的天然菌源，具有較高的理論價(jià)值和應(yīng)用價(jià)值[2-6]。同時(shí)，PGPB也可以應(yīng)用于微生物肥料的生產(chǎn)，是今后一段時(shí)期內(nèi)農(nóng)業(yè)生物技術(shù)發(fā)展的重要領(lǐng)域和方向之一[7]。

秋海棠(BegoniagrandisDry)屬多年生草本植物，不僅是著名的觀賞花卉，還可藥用、食用，加工成飲料和飼料等[8]?，F(xiàn)有的研究主要集中在農(nóng)作物PGPB方面，而對(duì)花卉的PGPB研究較少。鑒于此，本研究以健康的秋海棠植株作為試驗(yàn)材料，從中分離出促生菌，通過(guò)解磷、固氮、產(chǎn)氨、產(chǎn)吲哚乙酸(indoleacetic acid，IAA)等生物學(xué)檢測(cè)，篩選出具有良好促生防病作用的菌株，同時(shí)進(jìn)行了盆栽試驗(yàn)和大田試驗(yàn)，以期為促生菌在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 供試植物種子及病原真菌 供試植物種子為大豆種子；供試指示病原真菌為番茄灰霉病菌(BotrytiscineraPers.)、西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.Niveum)、玉米大斑病菌(Setosphaeriaturcica)、棉花枯萎病菌(Fusariumoxysporumf.sp.vasinfectum)，均由西北農(nóng)林科技大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院鑒定并惠贈(zèng)。

1.1.2 盆栽試驗(yàn)基質(zhì) 盆栽試驗(yàn)所用培養(yǎng)基質(zhì)由珍珠巖和蛭石(質(zhì)量比1∶2)組成，滅菌分裝入一次性紙杯內(nèi)備用。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 (1)PDA培養(yǎng)基。馬鈴薯汁1 000 mL，葡萄糖(或蔗糖)20 g，瓊脂18 g，pH值自然，121 ℃下滅菌30 min。

(2)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g,瓊脂18 g,自來(lái)水1 000 mL，pH 7.2～7.4，121 ℃下滅菌30 min。

(3)YMA培養(yǎng)基。甘露醇10 g，NaCl 0.1 g，酵母膏1.0 g，K2HPO40.5 g，MgSO4·7H2O 0.2 g，CaCO33.0 g，瓊脂18 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 7.0～7.2，121 ℃下滅菌30 min。

(4)無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基。葡萄糖10 g,(NH4)2SO40.5 g，KCl 0.3 g,MgSO4·7H2O 0.3 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，MnSO4·4H2O 0.02 g，Ca3(PO4)25 g，自來(lái)水1 000 mL，pH 7.0～7.2，121 ℃下滅菌30 min。

(5)無(wú)氮培養(yǎng)基。K2HPO40.5 g,Ca(PO4)22.0 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,FeCl30.01 g,蒸餾水1 000 mL，pH 6.8～7.0，121 ℃下滅菌30 min。

(6)Kings B培養(yǎng)基。參考文獻(xiàn)[9]的方法配制。

(7)產(chǎn)IAA培養(yǎng)基。參考文獻(xiàn)[10]的方法配制。

1.2 方 法

1.2.1 樣品采集 將健康的秋海棠植株整株挖出，采集健康部位的根部和莖部，放入滅菌的采集袋，做好標(biāo)記并立即帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行促生菌的分離。

1.2.2 促生菌的分離與純化 在超凈工作臺(tái)上，將采集的秋海棠根部和莖部，分別用清水洗凈表面附著的雜質(zhì)后，進(jìn)行表面消毒(在體積分?jǐn)?shù)75%乙醇溶液中浸泡1 min，用無(wú)菌水沖洗3次，再用質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%升汞溶液浸泡2～3 min，無(wú)菌水沖洗5次)[11]；用滅菌濾紙吸干多余水分后，再用無(wú)菌剪及滅菌刀將材料切割為6～8段(每段長(zhǎng)度約0.5 cm)，將表面消毒的材料段分別置于3種篩選培養(yǎng)基(PDA培養(yǎng)基、YMA培養(yǎng)基、牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基)中。將所有平板放置于(28±2) ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，反復(fù)純化直至獲得單一菌株，斜面保存并編號(hào)備用。為了驗(yàn)證材料表面消毒是否徹底，以經(jīng)表面消毒不做處理的材料在培養(yǎng)基上的組織印跡作為對(duì)照，檢驗(yàn)消毒效果。

1.2.3 抑菌活性的測(cè)定 采用平板對(duì)峙法進(jìn)行測(cè)定，以供試指示病原真菌為靶標(biāo)，將病原真菌接種于PDA平板進(jìn)行活化，于28 ℃下培養(yǎng)至病原菌長(zhǎng)滿平板。用打孔器將活化后的病原真菌菌落打成直徑為4 mm的菌餅，置于PDA平板中央，用同樣的方法在距其2 cm處接種已經(jīng)分離純化的促生菌，每個(gè)平板接4個(gè)菌餅，以只接指示病原真菌的平板作為對(duì)照，每處理3次重復(fù)，28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)，待對(duì)照平板上長(zhǎng)滿菌絲時(shí)，采用十字交叉法測(cè)量對(duì)照組和處理組抑菌圈直徑，并記錄數(shù)據(jù)。

1.2.4 目標(biāo)菌株促生能力的測(cè)定 (1)解磷能力。將待測(cè)菌株接種在液體無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基上，在搖床上于250 r/min、(28±2) ℃培養(yǎng)72 h后，取上清液涂布在固體無(wú)機(jī)磷培養(yǎng)基上，依據(jù)溶磷圈直徑，初步確定該菌株的解磷能力[1]。

(2)固氮能力。將待測(cè)菌株接種在液體無(wú)氮培養(yǎng)基中，(28±2) ℃培養(yǎng)72 h后將菌懸液涂布在固體無(wú)氮培養(yǎng)基上，48 h后觀察生長(zhǎng)情況，測(cè)定變色圈直徑。

(3)產(chǎn)IAA能力。 將待測(cè)菌株接種到Kings B培養(yǎng)基上，(28±2) ℃培養(yǎng)48 h后，每個(gè)平板滴加1 mL Salkowski試劑(每升10.8 mol/L H2SO4，含4.5 g FeCl3)，室溫暗處顯色2 h后，根據(jù)顯色深淺初步判斷產(chǎn)IAA含量。另取待測(cè)菌株接種于液體產(chǎn)IAA培養(yǎng)基中，于250 r/min、(28±2) ℃培養(yǎng)5 d，取2 mL培養(yǎng)液，10 000 r/min 離心15 min，每1 mL上清液中滴加0.5 mL Salkowski 試劑，室溫黑暗條件下顯色2 h 后，于530 nm處測(cè)定吸光度值(OD值)。以空白培養(yǎng)基作為對(duì)照，并以標(biāo)品IAA(上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司生產(chǎn))對(duì)應(yīng)的OD值制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算IAA產(chǎn)量(mg/L)。

1.2.5 盆栽試驗(yàn) 選擇籽粒飽滿大豆種子浸泡于質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%的HgCl2溶液中5 min，無(wú)菌dH2O沖洗5次后并于室內(nèi)晾干[12-13]。大豆催芽2 d后，取長(zhǎng)勢(shì)相同的豆芽植入紙杯中，每杯裝基質(zhì)70 g，每杯種植3株，并噴灑無(wú)菌水，各紙杯均放置于室外并在自然光照下培養(yǎng)，每天用無(wú)菌水噴灑1次。試驗(yàn)分別設(shè)接種單一促生菌株處理、接種菌株Y-01與Y-02混合菌液(兩種菌株經(jīng)培養(yǎng)后按照1∶1體積比混合而成)處理以及無(wú)菌水對(duì)照處理(CK)。取經(jīng)培養(yǎng)且OD600 nm=2.0的菌懸液(含菌量2×109mL-1)離心，將獲得的菌體細(xì)胞用生理鹽水洗滌3次后備用。待豆苗長(zhǎng)出2片真葉后，取配制好的各處理菌液0.2 mL，稀釋至20 mL，進(jìn)行灌根處理，常規(guī)管理，處理30 d，測(cè)量各處理大豆植株的各種形態(tài)學(xué)參數(shù)(包括株高、根長(zhǎng)、莖長(zhǎng)、莖直徑、大豆果實(shí)鮮質(zhì)量)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.6 大田試驗(yàn) 大田試驗(yàn)分別設(shè)接種單一促生菌株處理、接種菌株Y-01與Y-02混合菌液(兩種菌株經(jīng)培養(yǎng)后按照1∶1體積比混合而成)處理以及無(wú)菌水對(duì)照處理(CK)，不同處理隨機(jī)排列，每處理3次重復(fù)，每小區(qū)20 m2，共栽培番茄160株。取經(jīng)培養(yǎng)且OD600 nm=2.0菌懸液(含菌量2×109mL-1)離心，將獲得的菌體細(xì)胞用生理鹽水洗滌3次，取配制好的各處理菌液1 mL，稀釋至100 mL，對(duì)長(zhǎng)出2片真葉的番茄進(jìn)行灌根處理，CK用無(wú)菌水進(jìn)行根灌。分別于接種后15 d測(cè)量莖長(zhǎng)、葉長(zhǎng)、葉綠素含量以及60 d莖長(zhǎng)、葉綠素含量、果實(shí)數(shù)量[14-16]，其中葉綠素含量用SPAD值表示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用Excel 2013進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 秋海棠促生菌菌株的篩選

用3種配方不同的培養(yǎng)基，從秋海棠根部和莖部共分離、純化出22株菌株，從中篩選出11株具有解磷、產(chǎn)IAA、固氮等促生特性或抑制病原菌生長(zhǎng)能力較強(qiáng)的菌株，這些菌株的編號(hào)及相關(guān)信息如表1所示。由表1可見(jiàn)，11株菌株中，有10株具有產(chǎn)IAA能力，占分離總菌株數(shù)的45.45%；2株解磷菌株；3株具有固氮活性；5株具有抑制指示病原菌活性。其中菌株Y-01和P-10兼具解磷、產(chǎn)IAA性能，菌株N-02兼具固氮、產(chǎn)IAA性能。

2.2 秋海棠促生菌的抑菌能力

由2.1節(jié)可知,篩選獲得了5株具有抑制病原真菌能力的菌株，分別是P-03、P-06、P-09、P-15、P-16。采用平板對(duì)峙法測(cè)定以上5株促生菌體外抑菌情況，結(jié)果如表2所示。表2表明，這5株秋海棠促生菌對(duì)一種或多種指示菌具有抑菌活性，占分離菌株總數(shù)的45.5%。其中， P-16對(duì)4種供試病原真菌、P-15對(duì)3種供試病原真菌均表現(xiàn)出較廣的抑菌譜，且僅菌株P(guān)-16對(duì)西瓜枯萎病菌具有抑菌活性。菌株P(guān)-15和P-16對(duì)番茄灰霉病菌均具有抑菌活性，但抑菌能力差異不顯著。對(duì)玉米大斑病菌表現(xiàn)出抑菌活性的菌株分別是P-09、P-15和P-16，其中菌株P(guān)-15抑菌活性最高，抑菌圈直徑達(dá)(4.10±0.26) cm，三者間差異顯著。除菌株P(guān)-09外，其他測(cè)試菌株對(duì)棉花枯萎病菌均具有抑菌活性，其中P-06對(duì)棉花枯萎病菌的抑菌效果最強(qiáng)，其抑菌圈直徑可達(dá)(6.40±0.16) cm，顯著高于其他測(cè)試菌株。以上說(shuō)明秋海棠促生菌中存在豐富的抗菌資源。

表1 11株秋海棠促生菌的主要特性Table 1 Characteristics of 11 growth promoting strains from Begonia grandis

表2 秋海棠促生菌的體外抑菌能力Table 2 Inhibitory activity of growth promoting strains in Begonia grandis cm

注：數(shù)據(jù)為“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”。ND表示未檢測(cè)到抑菌活性。同列數(shù)據(jù)后標(biāo)不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)。下表同。

Note:Data are mean±SE.ND indicates not determined.Different lowercase letters in same column indicate significant difference (P<0.05).The same below.

2.3 秋海棠促生菌的促生能力

11株菌株的促生能力測(cè)定結(jié)果(表3)表明，不同菌株的促生能力也有差異，其中Y-01的IAA產(chǎn)量最高，達(dá)到32.63 mg/L，這暗示Y-01的促生能力可能比較強(qiáng)。菌株間的拮抗預(yù)試驗(yàn)結(jié)果顯示，Y-01和Y-02之間的拮抗性很小，故將菌株Y-01和Y-02按照1∶1體積比混合組成混合菌，進(jìn)行盆栽和大田試驗(yàn)。

表3 11株秋海棠促生菌的體外促生能力Table 3 Plant growth promoting activities of 11 the growth promoting strains in Begonia grandis

注：“+”表示變色圈直徑≤5 mm，“++”表示變色圈或溶磷圈直徑為>5 mm～≤10 mm。

Note:+.Color halo diameter(d) was ≤5 mm;++.Color halo or P dissolve circle diameter was >5 mm-≤10 mm.

2.4 秋海棠促生菌的盆栽表現(xiàn)

大豆在室外培養(yǎng)30 d后的形態(tài)學(xué)參數(shù)見(jiàn)表4。表4表明，與CK相比，接種秋海棠促生菌對(duì)大豆植株具有一定促生作用。與CK相比，接種供試11株單一促生菌后，大豆株高均顯著增加，增幅為13.4%～39.3%，其中以接種菌株P(guān)-06增幅最大。與CK相比，11株單一促生菌中，除菌株P(guān)-15對(duì)根長(zhǎng)無(wú)促生作用，P-03、P-10、P-16和Y-02對(duì)根長(zhǎng)促生作用不顯著外，其他菌株促生作用顯著，其中菌株P(guān)-12根長(zhǎng)增幅最大，為21.0%。與CK相比，接種11株單一促生菌后，大豆莖長(zhǎng)均明顯增加，增幅為3.3%～39.5%，其中P-03增幅最大；除菌株P(guān)-01外，其他菌株均顯著高于CK。11株單一促生菌中，除了P-10、P-15、N-02、Y-01外，其他菌株對(duì)大豆莖直徑均無(wú)顯著促生作用。11株單一促生菌對(duì)大豆果實(shí)鮮質(zhì)量均有顯著促生作用?？傮w而言，接種11株單一促生菌后，大豆株高、根長(zhǎng)、莖長(zhǎng)、莖直徑和果實(shí)鮮質(zhì)量的平均值均較CK明顯增加，增幅分別為27.33%，15.84%，23.46%，13.20%和22.39%。接種Y-01+Y-02混合菌的促生效應(yīng)明顯優(yōu)于單一促生菌，大豆株高、根長(zhǎng)、莖長(zhǎng)、莖直徑、果實(shí)鮮質(zhì)量較CK分別增加37.42%，25.65%，38.53%，16.42%和34.84%。

表4 不同秋海棠促生菌對(duì)大豆生長(zhǎng)的影響Table 4 Effects of different growth promoting strains of Begonia grandis on growth of soybean

2.5 秋海棠促生菌的大田表現(xiàn)

促生菌對(duì)大田番茄生長(zhǎng)影響的結(jié)果見(jiàn)表5及表6。表5表明同，灌根15 d后，與CK相比，接種11株單一促生菌后，番茄的莖長(zhǎng)、葉長(zhǎng)和葉綠素含量(除菌株P(guān)-01外)均增加。其中接種菌株P(guān)-16的番茄莖長(zhǎng)和葉長(zhǎng)增幅最大，分別為18.1%和35.6%；接種菌株P(guān)-12，番茄葉綠素含量增幅最大，為35.1%。Y-01+Y-02混合菌液對(duì)番茄植株莖長(zhǎng)和葉長(zhǎng)的促生效應(yīng)優(yōu)于CK和其他單一促生菌，莖長(zhǎng)和葉長(zhǎng)較CK分別增加了24.06%和37.10%；Y-01+Y-02混合菌液處理番茄的葉綠素含量較CK增加3.78%，除了P-01和P-06、P-09、Y-01之外，其他單一促生菌處理的葉綠素含量均顯著高于Y-01+Y-02混合菌液，可見(jiàn)混合菌所有促生指標(biāo)并非都比單一菌株好。

表5 灌根15 d后不同秋海棠促生菌對(duì)番茄生長(zhǎng)的影響Table 5 Effects of different growth promoting strains of Begonia grandis on growth of tomato after 15 d root irrigation

表6表明，灌根60 d后，Y-01+Y-02混合菌液與11種單一促生菌對(duì)番茄莖長(zhǎng)、葉綠素含量和果實(shí)數(shù)量的促生效果均高于CK。其中菌株P(guān)-09處理番茄莖長(zhǎng)最高，為(206.30±1.47) cm，比CK增加了34.55%，葉綠素含量也最高，比CK增加了13.25%。此外，P-09處理番茄果實(shí)數(shù)量也較高。

表6 灌根60 d后不同秋海棠促生菌對(duì)番茄生長(zhǎng)的影響Table 6 Effects of different growth promoting strains of Begonia grondis on growth of tomato after 60 d root irrigation

3 結(jié)論與討論

在植物根際促生菌促生效應(yīng)的研究中，促生菌株的實(shí)際應(yīng)用效果非常重要，這方面已有許多報(bào)道。如段秀梅等[17]從植物根際的土壤樣品中分離篩選出2株高效解磷細(xì)菌P9和P28，研究表明，混合接種這2株解磷菌處理的玉米株高和干質(zhì)量比CK分別增加了35.5%和28.9%。Zhao等[18]通過(guò)接種促生菌使得金銀花鮮質(zhì)量增加16.48%。姚拓[19]研究表明，大多數(shù)促生菌株可以促進(jìn)燕麥的生長(zhǎng)(株高、根長(zhǎng)、根表面積和生物量)，接種聯(lián)合促生菌后，燕麥的株高和生物量分別增加35.40% 和33.70%。崔曉雙等[20]利用玉米、黃瓜、番茄3種作物的根系分泌物作為初篩培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)源，從相對(duì)應(yīng)作物的根際土壤樣品中分離篩選出了能利用根系分泌物快速生長(zhǎng)的菌株，并通過(guò)盆栽試驗(yàn)評(píng)價(jià)其促生效果，結(jié)果表明，番茄接種促生菌后，地上鮮質(zhì)量增加了38.58%～45.53%；黃瓜接種促生菌后，地上部鮮質(zhì)量增加17.49%～29.44%，且與CK有顯著差異。丁新景等[21]探討了阿氏芽孢桿菌(Bacillusaryabhattai)、彎曲芽孢桿菌(Bacillusflexus)、藤黃微球菌(Micrococcusluteus)對(duì)雪蓮生長(zhǎng)的促生作用，結(jié)果表明，接種3種促生菌后，雪蓮植株葉綠素含量、根系體積和鮮質(zhì)量、地上部鮮質(zhì)量均顯著提高。本研究的盆栽試驗(yàn)結(jié)果表明，單一促生菌和Y-01+Y-02混合菌的促生效果有差異，接種單一促生菌的效果總體低于Y-01+Y-02混合菌，Y-01+Y-02混合菌處理大豆株高、根長(zhǎng)、莖長(zhǎng)、莖直徑和鮮質(zhì)量分別較CK增加了37.42%，25.65%，38.53%，16.42%和34.84%。這是因?yàn)榇偕鶼-01與Y-02間具有協(xié)同效應(yīng)，由于植物在幼苗初期自養(yǎng)能力較差，需要吸收大量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而促生菌可調(diào)節(jié)植物幼苗初期的自養(yǎng)能力，有利于營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的積累，可為育苗壯苗提供保障，并且隨著植物促生菌的定殖，其促生作用明顯增加。

本研究的大田試驗(yàn)中，Y-01+Y-02混合菌液對(duì)灌根15 d番茄植株莖長(zhǎng)和葉長(zhǎng)的促生效果明顯，莖長(zhǎng)和葉長(zhǎng)較CK組分別增加了24.06%和37.10%；葉綠素含量較CK增加3.78%，但低于大部分單一促生菌。處理60 d后，P-09的莖長(zhǎng)、葉綠素含量、果實(shí)數(shù)量均較高，促生作用優(yōu)于Y-01+Y-02混合菌處理?？梢?jiàn)在大田中某些單一促生菌的促生作用會(huì)優(yōu)于多菌混合處理。

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