張 曼，韓 飛

(楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院 動物工程學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

禽流感(avian influenza，AI)和新城疫(newcastle disease，ND)作為世界動物衛(wèi)生組織認(rèn)定的A類疾病，是對養(yǎng)禽業(yè)造成嚴(yán)重危害的兩種傳染病[1-2]。禽流感的病原禽流感病毒(avian influenza virus，AIV)為單股負(fù)鏈RNA病毒，由8個獨(dú)立的RNA節(jié)段組成，AIV亞型眾多，變異頻繁，至今已有15個HA亞型和9個NA亞型[3-5]。新城疫的病原新城疫病毒(newcastle disease virus，NDV)由衣殼蛋白包裹單股負(fù)鏈RNA組成，外披脂蛋白囊膜[1,6]。近年來隨著我國禽類養(yǎng)殖的迅速發(fā)展，AI和ND持續(xù)暴發(fā)，給禽類養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，而且1997年香港禽流感感染人事件和2013年3月禽流感病毒新亞型H7N9的出現(xiàn)，引起嚴(yán)重的社會和公共衛(wèi)生問題[2,4]。在我國ND雖得到了一定程度的控制，但非典型ND仍時有發(fā)生，由此引起的生產(chǎn)性能降低等問題日益凸顯。NDV不同分離株的毒力差異很大，感染雞群的發(fā)病率、死亡率、臨床癥狀、病理變化也不盡相同，這給診斷工作帶來新的挑戰(zhàn)，目前AI和ND已經(jīng)嚴(yán)重地影響了各國的禽類養(yǎng)殖及貿(mào)易[6-7]。

2015年6月以來，我國多數(shù)省份的雞群爆發(fā)安卡拉病(angrara disease)，臨床癥狀為突然倒地，出現(xiàn)呼吸道癥狀，甩鼻、呼吸加快，排黃色稀糞，有神經(jīng)癥狀，剖檢可見心包積液、肝臟腫大。該病主要發(fā)生于20日齡的肉雞，發(fā)病后1周左右為死亡高峰，死亡率可達(dá)20%～80%。安卡拉病有心包積液的特征，但同時也有法氏囊炎和包涵體肝炎所表現(xiàn)的臨床癥狀[8-10]。禽腺病毒(fowl adenovirus，F(xiàn)AV)是一種無囊膜的雙鏈DNA病毒，可分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ群，其中Ⅰ群FAV中C種FAV-4是安卡拉病的病原，俗稱安卡拉病毒(angrara disease virus)[11-12]。

禽流感、新城疫和安卡拉病發(fā)病急，死亡率高，危害大，且臨床癥狀相似，都會出現(xiàn)呼吸道癥狀，因此對其病原AIV、NDV和FAV-4做出快速的鑒別檢測，對養(yǎng)殖業(yè)和公共衛(wèi)生都具有重要的意義[13-15]。對于病毒性疫病的診斷一般采用病原分離鑒定和血清學(xué)方法，但這些方法存在操作復(fù)雜、費(fèi)時費(fèi)力、敏感性較差等缺點(diǎn)，特別是當(dāng)雞群混合感染多種病原時，應(yīng)用常規(guī)方法難以進(jìn)行早期快速檢測和鑒別診斷[1,16-17]。為此，本研究參考國內(nèi)外AIV、NDV和FAV-4相關(guān)的PCR檢測方法[2,6,9]，根據(jù)高保守、高特異的AIV的M基因序列、NDV的F基因、FAV-4型腺病毒的Hexon基因序列設(shè)計引物，采用病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒可一次性提取病毒的DNA和RNA混合物，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(對FAV-4 DNA無影響)和PCR，建立了AIV、NDV和FAV-4的多重PCR檢測方法，旨在一次性檢測出AIV、NDV和FAV-4，為禽流感、新城疫和安卡拉病的快速鑒別及診斷提供方法支持。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 病毒、細(xì)菌和細(xì)胞株 雞新城疫LoSata株、傳染性支氣管炎病毒(infectious bronchitis virus，IBV)H120株、傳染性法氏囊病病毒(infectious bursal disease virus，IBDV)B87株以及雞痘病毒(fowl pox virus，F(xiàn)PV)Quail Adapted株活疫苗，購自山東綠都生物科技有限公司;雞馬立克病病毒(marker’s disease virus，MDV)FC-126株活疫苗，購自哈藥集團(tuán)生物疫苗有限公司;H9N2亞型AIV和FAV-4尿囊液，由陜西楊凌職業(yè)技術(shù)學(xué)院動物工程學(xué)院實(shí)驗(yàn)室鑒定保存。

1.1.2 待檢病料 67份病料采自某陜西省不同地區(qū)雞場的疑似禽流感、新城疫和安卡拉病雞，包括鼻黏液、肺臟、心臟、肝臟和淋巴結(jié)等。

1.1.3 主要試劑 DNA聚合酶混合物PremixTaqVersion 2.0、DL2 000 DNA Marker,購于大連寶生物有限公司；病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒和Fast Quant RT kit試劑盒,購于天根生化科技(北京)有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方 法

1.2.1 引物的設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank中登錄的AIV的M基因(GenBank登錄號：KC767262)、NDV的F基因(GenBank登錄號：KT445901.1)和FAV-4型腺病毒的Hexon基因(GenBank登錄號：AY581297.1)序列，參考國內(nèi)外相關(guān)研究[2,6,9]，應(yīng)用引物設(shè)計軟件Primer Premier 5.0設(shè)計3對引物(表1)。引物由Invitrogen公司合成，稀釋至20 μmol/L備用。

表1 PCR引物信息Table 1 Information of PCR primers

1.2.2 病毒DNA/RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄 取3支1.5 mL離心管，分別加入3種病毒液200 μL，然后分別加20 μL Proteinase K，用病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒提取AIV和NDV的RNA及FAV-4的DNA，備用。按照Fast Quant RT Kit試劑盒說明書,將AIV、NDV的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反應(yīng)體系為：核酸 2 μg，10×Fast RT Buffer 2 μL，RT Enzyme Mix 1 μL，F(xiàn)Q-RT Primer Mix 2 μL，RNase-Free ddH2O補(bǔ)至20 μL；反應(yīng)條件：42 ℃孵育15 min，95 ℃孵育 3 min。得到的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物于-20 ℃保存，備用。

1.2.3 單項(xiàng)PCR檢測 分別以反轉(zhuǎn)錄合成的AIV、NDV的cDNA及FAV-4 DNA為模板，進(jìn)行單重PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增體系為25 μL：Premix rTaqDNA聚合酶混合物12.5 μL，對應(yīng)的上、下游引物各0.5 μL (20 μmol/L)，cDNA 2 μL，去離子水9.5 μL。PCR程序：預(yù)變性94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 25 s，25個循環(huán)；最后72 ℃再延伸10 min，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%核酸瓊脂糖凝膠電泳，觀察目的條帶。

1.2.4 多重PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化 用NanoDrop2000超微量分光光度計(賽默飛世爾科技公司)測定提取的NDV、FAV-4和AIV的核酸的質(zhì)量濃度分別為76.1，95.0和87.5 ng/μL，將其統(tǒng)一稀釋為50 μg/L備用。取3種病毒核酸各1 μL，混合后作為多重PCR模板，3種病毒的上、下游引物各取1 μL，Premix rTaqDNA聚合酶混合物25 μL，去離子水補(bǔ)足至50 μL，構(gòu)建多重PCR反應(yīng)體系；PCR程序： 94預(yù)變性℃ 5 min；94 ℃ 30 s，45～53 ℃ 退火30 s，72 ℃ 25 s，25個循環(huán)；最后72 ℃再延伸10 min。對多重PCR退火溫度(45，47，49，51，53 ℃)和引物濃度(AIV、NDV、FAV-4引物濃度均設(shè)0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 μmol/L 5個梯度)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%核酸瓊脂糖凝膠電泳，觀察目的條帶，選擇最佳退火溫度和引物濃度。

1.2.5 多重PCR特異性、靈敏性和重復(fù)性試驗(yàn) 采用優(yōu)化后的條件，在反應(yīng)體系中分別加入3種病毒的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物以及3種反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物混合物作為模板，同時分別用IBV和IBDV的cDNA、FPV和MDV的DNA及滅菌雙蒸水作為模板進(jìn)行反應(yīng)，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察目的條帶，檢驗(yàn)多重PCR方法的特異性。

取上述不同質(zhì)量濃度的3種病毒的核酸，將其等體積混合后進(jìn)行51～56倍比稀釋后，采用優(yōu)化的擴(kuò)增條件進(jìn)行多重PCR擴(kuò)增，檢測多重PCR反應(yīng)的靈敏性。

應(yīng)用建立的多重PCR方法，分別對AIV、NDV、FAV-4的核酸及3個病毒核酸混合陽性樣品、IBV的cDNA、IBDV的cDNA、FPV的DNA、MDV的DNA及滅菌雙蒸水樣品各 2 份進(jìn)行檢測，重復(fù)3次，以檢測建立的多重PCR方法的重復(fù)性。

1.2.6 臨床樣品檢測 向1.5 mL離心管中加入臨床樣品研磨液200 μL，提取病原DNA/RNA，反轉(zhuǎn)錄(對病毒FAV-4 DNA無影響)后利用建立的多重PCR方法進(jìn)行檢測，以AIV、NDV、FAV-4核酸混合樣品作為陽性對照，ddH2O作為陰性對照[2,6,9]。采用已經(jīng)建立的單項(xiàng)PCR方法對臨床樣品進(jìn)行檢測，并將其結(jié)果與多重PCR方法結(jié)果進(jìn)行比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 NDA、FAV-4和AIV的單項(xiàng)PCR擴(kuò)增

通過單項(xiàng)PCR檢測，用瓊脂糖凝膠電泳可觀察到559 bp的NDVF基因、295 bp的FAV-4Hexon基因和229 bp的AIVM基因的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符，證明引物特異性良好(圖1)。

2.2 AIV、NDV和FAV-4多重PCR方法中引物濃度的優(yōu)化

圖2表明，AIV、NDV、FAV-4引物濃度均為0.8～1.0 μmol/L時擴(kuò)增效果較好。

M.DNA Marker DL2000；1.NDV F基因；2.FAV-4 Hexon基因；3.AIV M基因；4.ddH2OM.DNA Marker DL2000；1.NDV F gene;2.FAV-4 Hexon gene；3.AIV M gene;4.ddH2O圖1 NDV F基因、FAV-4 Hexon基因和AIV M 基因的單項(xiàng)PCR擴(kuò)增Fig.1 Single PCR amplification of NDV F gene,FAV-4 Hexon gene,AIV M gene

2.3 AIV、NDV和FAV-4多重PCR方法中退火溫度的優(yōu)化

在不同的退火溫度(45，47，49，51，53 ℃)下進(jìn)行多重PCR反應(yīng)，瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果(圖3)表明，在47 ℃時擴(kuò)增效果較好，故最終選擇47 ℃作為退火溫度。

2.4 AIV、NDV和FAV-4多重PCR方法的特異性、靈敏性和重復(fù)性檢驗(yàn)

圖4表明，AIV、NDV、FAV-4均能擴(kuò)增到相對應(yīng)的目的條帶，而IBV、IBDV、FPV、MDV及滅菌雙蒸水的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性，說明建立的多重PCR方法特異性良好。

M.DNA Marker DL2000；1～5.退火溫度 分別為45，47，49，51，53 ℃M.DNA Marker DL2000；1-5.Annealing temperatures were 45,47,49,51 and 53 ℃,respectively

AIV、NDV和FAV-4多重PCR靈敏性試驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。多重PCR靈敏性試驗(yàn)結(jié)果(圖5)表明，在NDV、FAV-4和AIV的引物濃度為1.0 μmol/L時，建立的多重PCR方法能檢測出NDV、FAV-4和AIV核酸的最大稀釋倍數(shù)均為55倍，結(jié)合1.2.4節(jié)核酸質(zhì)量濃度測定結(jié)果計算可知，該多重PCR方法能檢測出的NDV、FAV-4和AIV最低核酸質(zhì)量濃度分別為24.3，30.4 和28.0 pg/μL。

應(yīng)用建立的多重PCR方法在不同時間對同一樣品進(jìn)行3次重復(fù)檢測。結(jié)果表明，檢測結(jié)果一致，說明該方法重復(fù)性良好。

M.DNA Marker DL2000；1～6.依次為 51～56倍比稀釋的病毒核酸混合物M.DNA Marker DL2000;1-6.Different dilutions of nucleic acid mixture from 51-56圖5 AIV、NDV和FAV-4多重PCR靈敏性試驗(yàn)結(jié)果Fig.5 Sensitivity test of the multiplex PCR assay for detecting AIV,NDV and FAV-4

2.5 AIV、NDV和FAV-4多重PCR方法對臨床樣品的檢測

應(yīng)用建立的多重PCR方法,對67份采自某陜西不同地區(qū)雞場的疑似禽流感、新城疫和安卡拉病雞的鼻黏液、肺臟、心臟、肝臟和淋巴結(jié)等病料進(jìn)行檢測，對檢測結(jié)果(圖6)進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果(表2)表明，67份病料中NDV單純感染的有17份，F(xiàn)AV-4單純感染的有15份，AIV單純感染的有5份，NDV和FAV-4混合感染的有4份，AIV和FAV-4混合感染的有2份，AIV和NDV混合感染的有1份，同時感染3種病毒的1份，陰性22份。將多重PCR結(jié)果和已經(jīng)創(chuàng)建的單重PCR方法的檢測結(jié)果進(jìn)行比對，結(jié)果完全一致。

M.DNA Marker DL2000；1.陽性對照；2.陰性對照；3～20.臨床樣品M.DNA Marker DL2000;1.Positive control;2.Negative control (ddH2O);3-20.Clinical samples

病毒Virus樣品數(shù)SampleNo.所占比率/%RateAIV57.46NDV1725.37FAV-41522.39AIV+FAV-422.99NDV+FAV-445.97AIV+NDV11.49AIV+NDV+FAV-411.49陰性Negative2232.84

3 討 論

禽流感、新城疫和安卡拉病發(fā)病急，死亡率高，給雞類養(yǎng)殖造成嚴(yán)重危害，而且在臨床上易與產(chǎn)蛋下降綜合征、禽多殺性巴氏桿菌病、傳染性支氣管炎、傳染性法氏囊等病混淆[18-21]，傳統(tǒng)的臨床診斷、病毒分離培養(yǎng)和血清學(xué)診斷等方法操作復(fù)雜耗時、結(jié)果不夠準(zhǔn)確，而且AIV和Ⅰ群FAV血清型較多，新的變異株也不斷出現(xiàn)，而血清型特異性單抗制備困難，難以滿足診斷的需要[20,22-23]。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，使用PCR技術(shù)快速檢測病原微生物的研究越來越多[2,6,9]，與常規(guī)檢測技術(shù)相比，這種方法不僅縮短了檢測時間，而且節(jié)約了人力、物力，提高了工作效率，為疫情快速診斷提供了一個較好的方法，有利于及時制定應(yīng)對緊急疫情的措施。用PCR方法檢測NDV、AIV和FAV-4省時、結(jié)果特異、敏感性高，消除了常規(guī)血清學(xué)方法中非特異性因素的干擾及敏感性問題，可以直觀地從分子水平檢測到病毒核酸的存在[5-6,10]。

在多重PCR反應(yīng)中，特異性引物的設(shè)計是關(guān)鍵，應(yīng)盡量避免產(chǎn)生引物二聚體，防止因引物與不同模板之間的非特異性結(jié)合而造成非特異性擴(kuò)增，干擾結(jié)果判定。本研究設(shè)計的引物是針對AIV的M基因、NDV的F基因和FAV-4型腺病毒的Hexon基因序列，經(jīng)多次實(shí)踐改進(jìn)，最終選取了特異性最強(qiáng)的引物，避免了引物二聚體的產(chǎn)生，并且目的片段清晰，試驗(yàn)中擴(kuò)增得到的目的產(chǎn)物經(jīng)測序后比對，與NCBI上序列相似度均為100%。多重PCR的反應(yīng)參數(shù)，尤其退火溫度要適宜，因?yàn)槎嘀豍CR反應(yīng)體系中有多對引物，退火溫度過低往往會導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物出現(xiàn)，特異性不好；退火溫度太高則難以擴(kuò)增出目的條帶，因此需要進(jìn)行優(yōu)化。另外循環(huán)次數(shù)不應(yīng)過多，以利于檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，循環(huán)次數(shù)增加會導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增的機(jī)率增大。本研究中的敏感性試驗(yàn)采用測定核酸質(zhì)量濃度的方法對病毒進(jìn)行定量，該法能更直觀地表示所測病毒的含量而不是感染性。應(yīng)用建立的多重PCR方法對67份雞的病料進(jìn)行檢測，結(jié)果表明在臨床上存在多種病毒混合感染的情況，并且近來FAV-4的感染率顯著升高，需要對該病加強(qiáng)防范，防止其大流行而對禽類養(yǎng)殖造成嚴(yán)重危害。

本研究建立的多重PCR方法可直接檢測收集的雞組織病料樣品，而不需對該病原進(jìn)行分離培養(yǎng)和套式PCR反應(yīng)，速度快、簡便，這對快速診斷禽流感、新城疫和安卡拉病具有重要的臨床應(yīng)用價值。此外，本方法省去了既要提取DNA又要提取RNA的繁瑣步驟，可一次性提取病毒的DNA/RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄(反轉(zhuǎn)錄過程對FAV-4的DNA無影響)和PCR，可以同時檢測出RNA病毒(AIV和NDV)和DNA病毒(FAV-4)，僅需4 h左右就可完成對臨床樣品的檢測，特異性好，敏感性高，過程簡單，檢測方法高效可靠，因而該方法的建立對AIV、NDV、FAV-4的快速檢測具有很高的使用價值和應(yīng)用前景，對禽流感和新城疫和安卡拉病的快速鑒定及有效防治具有十分重要的意義。

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