吳安忠，程崖芝，巫升鑫，劉國(guó)坤，張紹升，肖順

1 福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福建福州倉(cāng)山區(qū)上下店路15號(hào) 350002；2 福建省煙草公司煙草科學(xué)研究所，福建福州北環(huán)中路133號(hào) 350003

煙草鐮刀菌根腐病在福建省煙區(qū)發(fā)生普遍，據(jù)報(bào)道其病原菌有尖鐮刀菌（F. oxysporum）、茄病鐮刀菌（F. solani）和半裸鐮刀菌（F. semitectum）[1]。2003年Skovgaard K等人對(duì)豌豆根腐病的病原菌進(jìn)行鑒定并發(fā)現(xiàn)了新種共享鐮刀菌（F. communeSkovgaard,O'Donnell et Nirenberg），F(xiàn). commun可引起白松、道格拉斯冷杉、康乃馨、玉米、胡蘿卜、大麥等作物根腐病[2]。此后，相繼從辣根、森林苗圃、番茄、花旗松、大豆[2]等植物根腐病的病株上發(fā)現(xiàn)F. commune[3-8]。我國(guó)學(xué)者將在湖北、廣東、湖南、福建等地分離到的荸薺枯萎病和荷花腐敗病病原菌鑒定為F. commune[9]。以上報(bào)道表明F. commune是一種有廣泛地理分布和寄主范圍的植物根腐病病原菌。F. commune和F. oxysporum形態(tài)特征極為相似，Stewart J E等人通過(guò)對(duì)共享鐮刀菌的翻譯延伸因子（EF-1a）、線(xiàn)粒體小亞基（mtSSU）和rDNA基因內(nèi)間隔區(qū)（IGS）等基因片段的單基因或多基因序列系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，明確了共享鐮刀菌為尖孢鐮刀菌姊妹種（sister taxon），將共享鐮刀菌從尖孢鐮刀菌復(fù)合種（F. oxysporumspecies complex，F(xiàn)OSC）中分出來(lái)[2-4]。為進(jìn)一步明確福建省三明煙區(qū)的煙草根腐病病原種類(lèi)，本研究于2015—2017年在福建省三明市煙區(qū)采集和分離煙草根腐病病原菌，通過(guò)形態(tài)學(xué)鑒定、基因內(nèi)間隔區(qū)（rDNA-IGS）序列系統(tǒng)發(fā)育分析、種特異性引物分子鑒定以及接種試驗(yàn)，對(duì)煙草鐮刀菌根腐病的病原進(jìn)行鑒定和致病性測(cè)定，以期為病害診斷、防治提供理論依據(jù)，促進(jìn)煙葉產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 采樣和病原菌分離

2015—2017年在福建省三明市煙區(qū)采集患煙草根腐病的成株期煙株，在實(shí)驗(yàn)室采用病組織分離法進(jìn)行病原菌分離，方法為：將煙草病株用流水洗凈，吸水紙吸干水分后從根莖部病健交界處切取皮層韌皮部組織。病組織移入70 %酒精中浸泡3～5 s，轉(zhuǎn)入0.1 %升汞溶液中表面消毒3～5 min，無(wú)菌水洗滌3次，滅菌吸水紙吸干水分后移至含氯霉素PDA培養(yǎng)基中（培養(yǎng)基氯霉素濃度為：0.25 g/L），置于25±3 ℃的培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)；待長(zhǎng)出真菌菌落后挑取菌絲和孢子，繼續(xù)純化顯微鏡檢為鐮刀菌的菌落，采用PDA平板稀釋純化法獲得鐮刀菌單孢菌株，用于形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定。

1.2 形態(tài)學(xué)鑒定

根據(jù)BOOTH分類(lèi)系統(tǒng)[10]和Skovgaard K等人[2]形態(tài)學(xué)鑒定方法。

1.3 DNA序列擴(kuò)增及種特異性檢測(cè)

采用SDS裂解法提取菌株DNA[11]，引物見(jiàn)表1，分別由上海生物技術(shù)有限公司和廈門(mén)鉑尚生物有限公司合成。

用CNS1/CNL12引物[12]隨機(jī)擴(kuò)增4個(gè)分離菌株DNA的IGS區(qū)基因片段，陽(yáng)性PCR產(chǎn)物委托廈門(mén)鉑尚生物科技有限公司進(jìn)行純化、克隆和測(cè)序。菌株IGS基因序列用軟件DNAMAN（Version5.2.2，Lynnon Corporation）校對(duì)拼接后提交至GENBANK，獲得登錄號(hào)。在GENBANK數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/）下載同源性高且已知種名的鐮刀菌基因序列，用軟件Seaview 4.2.3比對(duì)其與測(cè)序所得的基因序列。比對(duì)結(jié)果數(shù)據(jù)上傳至網(wǎng)站https://www.phylo.org，采用貝葉斯法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建。

利用已報(bào)道的特異性引物efFc100F/efFc385R[13]和 FOF1/FOR1[14]進(jìn) 行F. commune、F. oxysporum種的特異分子檢測(cè)，對(duì)照菌株為實(shí)驗(yàn)室保存的香蕉枯萎病病菌尖鐮刀菌古巴專(zhuān)化型菌株（F. oxysporumf. sp.cubense）。特異性擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠（制膠時(shí)加入Gold ViewⅠ型核酸染色劑）電泳，并在凝膠成像系統(tǒng)下檢查擴(kuò)增結(jié)果和拍照。

表1 引物目錄Tab.1 Primers designed

1.4 致病性測(cè)定

1.4.1 菌株的培養(yǎng)

采用液固兩相法培養(yǎng)病原菌：選取F-04、F-18、F-19、F-28共4株菌的菌餅，每瓶（裝量為250 mL）馬鈴薯蔗糖液體培養(yǎng)基中加入3塊φ=1 cm的菌餅，150 r/min，25±3 ℃，12 h/12 h光暗的搖床中培養(yǎng)5～7 d，按質(zhì)量的5 %接種量將液體發(fā)酵液接種至固體培養(yǎng)基中（固體培養(yǎng)基基礎(chǔ)配方為：麩皮和谷殼，質(zhì)量比為7:3，混勻后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2 %蔗糖，加水調(diào)節(jié)物料含水量為20～30 %，分裝后于121 ℃，60 min間歇滅菌2次），用無(wú)菌水將接種后的固體培養(yǎng)料調(diào)節(jié)至含水量為50 %，置于25±3 ℃，12 h/12 h光暗的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7～10 d，自然風(fēng)干后用0.15 %吐溫-80溶液測(cè)定固體培養(yǎng)料的孢子數(shù)。

1.4.2 室內(nèi)接種

采用土壤接種法進(jìn)行致病性測(cè)定：將滅菌土與固體培養(yǎng)料混合成含孢量為106個(gè)/g的接種土，煙苗傷根后定植于φ為5 cm高為10 cm裝有接種土的塑料穴盤(pán)中，置于28±5 ℃的溫室中誘導(dǎo)發(fā)??；以滅菌的固體培養(yǎng)基質(zhì)拌成的接種土為對(duì)照，定期觀察發(fā)病情況。供試菌株為F-04、F-18、F-19、F-28，供試的煙草品種為云煙87、K326、TN90、翠碧一號(hào)和B08-4；每個(gè)處理30株煙苗，3次重復(fù)。

1.4.3 田間接種

選取室內(nèi)接種測(cè)得的致病力強(qiáng)的菌株F-19在歷年發(fā)病較重的病田進(jìn)行試驗(yàn)。雙相發(fā)酵后的固體培養(yǎng)料與試驗(yàn)田土（體積比為15：1）攪拌均勻制成接種土，每株約300 g于移栽時(shí)穴施。以滅菌的固體培養(yǎng)基質(zhì)與試驗(yàn)田土制成的土料為對(duì)照，同時(shí)設(shè)常規(guī)移載作為空白對(duì)照。供試煙草品種：K326、B08-4、云煙87、巖煙97、翠碧一號(hào)和革新三號(hào)，每個(gè)處理35株，3次重復(fù)。

1.4.4 調(diào)查與數(shù)據(jù)分析

接種后14 d開(kāi)始觀察并記載發(fā)病情況，病情指數(shù)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)參照《中華人民共和國(guó)煙草行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)》煙草病害分級(jí)及調(diào)查方法（GB/T23222-2008，GB/T23224-2008）略作修改。同時(shí)，選取病株按前述方法進(jìn)行病原菌的分離與鑒定。采用軟件SPSS Statistics 19.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

2015—2017年從福建省三明市煙區(qū)采集的煙草根腐病病株，分離獲得形態(tài)特征與F. commune、F.oxysporum相似的31個(gè)菌株，編號(hào)為F-01～F-31。菌株的主要形態(tài)特征描述如下：

菌落白色，氣生菌絲絨狀，可產(chǎn)生大型分生孢子和小型分生孢子（圖1A）。小型分生孢子多且假頭狀聚生于產(chǎn)孢細(xì)胞上，孢子卵形或橢圓形，大 小 4.36～11.85×2.35～3.70 μm(圖 1B)。 大 型 分生孢子美麗型，月牙形，稍彎，向兩端比較均勻的逐漸變尖，基孢足跟明顯，3～5個(gè)隔膜，大小27.19～38.06×3.45～4.21 μm；產(chǎn)孢細(xì)胞單瓶梗，短，或稍長(zhǎng)，大小 12.21～50.95×2.52～3.94 μm(圖 1C)。厚垣孢子多，球形，間生或頂生，單個(gè)或成對(duì)，直徑9.97～11.82 μm(圖 1D)。

圖1 F. commune的顯微形態(tài)特征（×400）Fig.1 Microscopic morphology characteristics of F. commune Bars=10 μm

2.2 F. commune特異性分子鑒定

用F. commune特異性引物（efFc100F/efFc385R）對(duì)分離的31個(gè)菌株和對(duì)照菌株進(jìn)行擴(kuò)增，所有分離菌株均出現(xiàn)約300 bp的特異性條帶（圖2A），而對(duì)照菌株未擴(kuò)增出特異性條帶；用F. oxysporum特異性引物（FOF1/FOR1）作進(jìn)一步的PCR驗(yàn)證，除對(duì)照菌株出現(xiàn)特異性條帶外，均未擴(kuò)增出條帶（圖2B）。結(jié)果表明，從煙草上分離得到的菌株F-01～F-31均為F. commune而不是F. oxysporum。

圖2 凝膠成像電泳圖Fig.2 Gel Electrophoresis

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

將菌株 F-04、F-18、F-19和 F-28的 IGS基因序列（其中F-19登錄號(hào)為MG674919）與7株F. commune（其中3株為荸薺枯萎病菌，登錄號(hào)分別 為 KC430670、KC436675和 KC436679；2株 荷花腐敗病菌，登錄號(hào)為KU935498和KX147074；其他2株為標(biāo)準(zhǔn)菌株，登錄號(hào)為HM057285和HM057283）、5株F. oxysporum（其中1株為香蕉專(zhuān)化型標(biāo)準(zhǔn)菌株，登錄號(hào)為FJ985480）及14株其他種鐮刀菌，共30個(gè)菌株的基因序列聚類(lèi)分析。選取F.sporotrichioides（登錄號(hào)：AJ854656）作為外群，構(gòu)建基于IGS基因的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖3）。30株鐮刀菌明顯劃分為2個(gè)大分枝，菌株F-04、F-18、F-19和F-28與其他報(bào)道的F. commune菌株聚為一類(lèi)，與F.oxysporum明顯區(qū)分，系統(tǒng)進(jìn)化分析表明所分離的這4個(gè)菌株為F. commune。

2.4 致病性測(cè)定

室內(nèi)與田間接種試驗(yàn)結(jié)果表明，從煙草分離的F. commune菌株對(duì)煙草具有明顯的致病性，引起的病害癥狀與田間自然發(fā)病的相似（圖4）。發(fā)病的煙株生長(zhǎng)發(fā)育受阻，植株矮小，初始時(shí)僅基部大片葉片出現(xiàn)萎蔫變黃，發(fā)病后期中部葉片開(kāi)始褪綠發(fā)黃；發(fā)病煙株根部表皮腐爛、易破碎脫落，分別橫切與縱切莖部，可見(jiàn)維管束變褐，嚴(yán)重的莖基部至主根腐爛壞死，木質(zhì)部變褐變黑并沿根莖向頂端擴(kuò)展。

室內(nèi)接種結(jié)果表明（表2）：同一菌株對(duì)不同煙草品種的致病性存在差異，如接種F-19菌株的煙草品種TN90和K326的發(fā)病率和病情指數(shù)顯著高于煙草品種B08-4；不同菌株對(duì)同一品種的致病性也存在差異，如F-04菌株接種翠碧一號(hào)發(fā)病率為86.44 %，其他3個(gè)菌株接種該煙草品種的發(fā)病率分別為70.00%、83.33 %和73.33 %。田間接種結(jié)果（表3）也表明：F-19菌株對(duì)不同煙草品種致病性存在著明顯差異，B08-4無(wú)論是發(fā)病率還是病情指數(shù)均顯著高于其他煙草品種。

圖3 基于IGS基因序列構(gòu)建的BI樹(shù)Fig.3 Bayesian inference tree based on IGS gene sequence

圖4 接種F. commune煙草發(fā)病及對(duì)照煙株的癥狀Fig.4 Symptoms of inoculated tobacco plants of F. commune and of the control

對(duì)室內(nèi)和田間接種發(fā)病的煙株進(jìn)行癥狀觀察與病組織病原菌分離和鑒定，結(jié)果顯示，接種后的病株表現(xiàn)出的癥狀與煙草鐮刀菌根腐病癥狀一致，其2次分離物與接種的分離物也一致，均為共享鐮刀菌（F. commune），由此確定該菌為引起煙草根腐病的致病菌。

表2 室內(nèi)致病性測(cè)定結(jié)果Tab.2 Pathogenicity test results by greenhouse pots

表3 田間致病性測(cè)定結(jié)果Tab.3 Pathogenicity test results in field

3 討論與結(jié)論

以往研究中，鐮刀菌屬病原菌的分類(lèi)主要通過(guò)形態(tài)學(xué)手段和鑒別寄主來(lái)進(jìn)行，因此對(duì)于一些形態(tài)相近的姊妹種則難以區(qū)分，分子生物學(xué)技術(shù)及生物信息學(xué)的發(fā)展為一些易混淆如尖孢鐮刀菌復(fù)合種的準(zhǔn)確區(qū)分提供了可能。本研究分離獲得了福建省三明煙區(qū)煙草鐮刀菌根腐病的病原菌31株，通過(guò)形態(tài)特征觀察、分子生物學(xué)鑒定和致病性測(cè)定，確定該病病原菌為共享鐮刀菌F. commune。

從菌株的系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，煙草上分離的F. commune與國(guó)內(nèi)僅報(bào)道的由F. commune引起的荸薺枯萎病和荷花腐敗病病原菌屬同一種[15]；而荸薺與荷花在國(guó)內(nèi)都是以水田種植為主，福建省煙區(qū)普遍采用水稻與煙草輪作的種植方式，F(xiàn). commune是否廣泛存在于水田中并在適宜的條件下侵染煙草引起煙草根腐病，這一結(jié)果有待進(jìn)一步研究。

本研究對(duì)F. commune的致病性測(cè)定結(jié)果證實(shí)了該菌對(duì)煙草具有顯著的致病性，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)供試菌株間存在一定的致病性分化，這與以往研究[15]結(jié)果一致，這將對(duì)煙草抗鐮刀菌根腐病育種或品種篩選帶來(lái)困難。

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