李 玉，王 杰，權(quán) 麗*，向 玫

1.甘肅省白龍江林業(yè)管理局林業(yè)科學(xué)研究所，甘肅 蘭州 730046； 2.甘肅白龍江森林生態(tài)系統(tǒng)國家定位觀測研究站，甘肅 舟曲 746300

近年來有關(guān)高溫脅迫對(duì)植物傷害的研究表明,高溫引起植物體內(nèi)活性氧水平升高,從而直接或間接啟動(dòng)膜脂過氧化作用,導(dǎo)致膜傷害和破壞,嚴(yán)重時(shí)造成細(xì)胞死亡[1]。植物內(nèi)源保護(hù)系統(tǒng)的抗氧化能力及生物膜的穩(wěn)定性是決定植物對(duì)逆境脅迫響應(yīng)特征的關(guān)鍵因素[2]。大量研究證實(shí),植物在高溫脅迫下體內(nèi)活性氧積累超過正常水平，超氧化物歧化酶( SOD) 、過氧化物酶( POD) 等抗氧化酶由于底物濃度增加而被誘導(dǎo)合成,用以抵御和清除活性氧，防止膜脂過氧化，增強(qiáng)植物的自我保護(hù)能力[3]。許多研究表明,高溫首先破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu), 致使細(xì)胞內(nèi)溶物外滲,細(xì)胞膜的熱穩(wěn)定性即高溫脅迫下細(xì)胞的電導(dǎo)率直接反映植物的耐熱程度[4]；膜酯過氧化作用是導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)破壞,引起植株損傷甚至死亡的重要原因, 植物體內(nèi)過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)等細(xì)胞膜保護(hù)酶與植物的耐熱性有關(guān),可以作為耐熱性篩選指標(biāo)[5]。另有研究指出,植物體內(nèi)脯氨酸水平與抗逆性有關(guān)[6]。檸條是黃土高原地區(qū)重要的灌木樹種，具有廣泛的適應(yīng)性和很強(qiáng)的抗逆性，是營造水土保持林、防風(fēng)固沙林、薪炭林和飼料林的優(yōu)良樹種[7]。目前,有關(guān)檸條熱適應(yīng)機(jī)理研究報(bào)道很少，本研究對(duì)檸條枝條進(jìn)行了高溫脅迫，通過測定不同溫度處理下檸條的相關(guān)抗氧化指標(biāo)，研究檸條抗氧化系統(tǒng)對(duì)高溫逆境的響應(yīng),以揭示檸條的抗氧化保護(hù)特性和機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 樣地概況

蘭州市北山的九州臺(tái)，地理位置為35°58′54″～36°11′20″N，103°12′47″～103°58′09″E ，海拔2066. 8 m。該地區(qū)屬于黃土高原半干旱地區(qū)，土壤為黃土母質(zhì)上發(fā)育起來的灰鈣土，有機(jī)質(zhì)含量0.5%～1.5%左右，pH 8～9。氣候干燥少雨,年均降水在320 mm左右,年平均蒸發(fā)量 1 468 mm，是降水量的4.4倍, 年平均日照時(shí)數(shù) 2 607.6 h；無霜期185 d～200 d；年平均風(fēng)速僅為0.94 m·s-1，坡度22°～43°[8]。土壤以淡灰鈣土為主，顆粒較粗，溝坡分布有紅膠泥和紅沙土，pH值8.0～9.0[9]。受水分條件制約，該區(qū)自然植被生長稀疏,主要物種有荒漠錦雞兒(Caraganaroborovskyi.)、芨芨草(Ach-natherumsplendens)、紅砂等。人工栽培植物種主要以檸條(Caraganakorshinkii)、白刺(Nitrariasibirica)、紫穗槐(Amorphafruticosa)、檉柳(Tamarixaustrongolica)、刺槐(Robiniapsrudoacia.)、油松(Pinustabulaeformis)等為主。

1.2 材料及處理

在蘭州市北山的九州臺(tái),選取在同一地點(diǎn),生長良好的檸條植株，采種時(shí)間段為早晨9:00～10:00,將采好的檸條枝條快速處理后,放入冰盒中,帶回實(shí)驗(yàn)室,將檸條枝條浸泡在水中，以室溫為對(duì)照，在人工氣候箱內(nèi)，設(shè)定30℃、35℃、40℃、45℃為高溫處理溫度，分別處理2h后,采集葉片進(jìn)行生理指標(biāo)的測定。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 丙二醛含量的測定

MDA含量測定采用TBA法[10]，取0.5 g植物樣品(葉)，加5 mL5%TCA，研磨后所得勻漿在 3 000 r·min-1下離心10 min。取上清液2 mL，加2 mL0.67%TBA，混合后在100℃水浴上煮沸30 min，冷卻后再離心一次。分別測定上清液在450 nm、532 nm和600 nm處的吸光度值，按下式計(jì)算MDA的含量：

C/μmol/L=6.45(OD532-OD600)-0.56OD450

式中OD532、OD600、OD450分別代表450 nm、532 nm和600 nm波長下的吸光度值。

1.3.2 超氧化物歧化酶(SOD)酶活性測定

0.5 g鮮材料加0.05 mol·L-1(pH7.8)磷酸緩沖液研磨,勻漿在 1 000 r·min-1冷凍離心20 min,取上清液進(jìn)行酶活性測定。

SOD活性測定參照鄒琦的方法[11]。取3支試管，1支為遮光對(duì)照管，1支為照光對(duì)照管，剩余1支為測試管。分別加入1.5 ml0.05 mol·L-1(pH值7.8)磷酸緩沖液，0.3 ml130 mmol·L-1甲硫氨酸，0.3 ml750 μmol·L-1NBT，0.3 ml100 mmol·L-1EDTA-Na2，0.3 ml 20 μmol·L-1核黃素，0.5 ml蒸餾水。兩支對(duì)照管加入0.05 ml(pH值7.8)磷酸緩沖液，測試管中加0.05 ml酶提取液，立即對(duì)遮光對(duì)照管遮光處理，將照光對(duì)照管，測試管輕輕搖勻，在 4 000 lx下照光30 min 進(jìn)行光化還原。以遮光對(duì)照管為對(duì)照，測定其它兩管的OD560。重復(fù)3次。已知SOD活性單位以抑制NBT光化還原的50%為一個(gè)酶活性單位表示，按下式計(jì)算SOD活性。

SOD總活性=((ACK-AE)×V)/(1/2×ACK×W×Vt)

式中:SOD總活性以鮮重酶單位每克表示；ACK為照光對(duì)照管的吸光度；AE為樣品管的吸光度:V為樣品液總體積,ml；Vt為測定時(shí)樣品用量,ml；W為樣鮮重,g。

1.3.3 過氧化物酶(POD)活性的測定

采用愈創(chuàng)木酚法測定POD活性[12]。稱取0.3g新鮮材料，放入預(yù)冷研缽中，加5ml(pH=6.5)磷酸緩沖液冰浴下研磨成漿。將勻漿全部轉(zhuǎn)入離心管，于 3 000 r·min-1冷凍離心10 min，上清液為POD粗酶液，低溫保存。

配H2O2，蒸餾水調(diào)零(對(duì)照)，向比色杯中加0.1 ml測定液，2.6 ml0.3%愈創(chuàng)木酚，將比色杯放入比色槽，加0.3 ml0.6% H2O2，立即開始計(jì)時(shí)啟動(dòng)反應(yīng)，自動(dòng)計(jì)時(shí)設(shè)2 min,波長為470 nm,記錄470 nm下2 min內(nèi)的吸光度值的變化。重復(fù)3次。結(jié)果計(jì)算，以每分鐘內(nèi)△OD470增加1為1個(gè)酶活性單位：

POD活性=[(△OD470/min×提取液總體積)/測定時(shí)用酶液體積]/取樣質(zhì)量

1.3.4 抗壞血酸(ASA)含量的測定

利用比色法進(jìn)行測定[13]，取0.25 g鮮葉+1.5 ml2%草酸，研磨勻漿，加少許1%草酸，轉(zhuǎn)入25 ml容量瓶，用1%草酸沖洗研缽數(shù)次，再給上述溶液中加入0.25 ml 30%硫酸鋅，搖動(dòng)，再加0.25 ml 15%亞鐵氰化鈉，用1%草酸定容至25 ml,抽慮，濾液為待測液。經(jīng)過測定繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查AsA含量。用如下公式計(jì)算AsA含量：

AsA含量(mg/gFW)=[(查得的AsA含量×提取液總體積/測定用的體積)/1 000]/樣重=[(查得的AsA含量×50/4)/1 000] /0.5=查得的AsA含量×25/1 000

1.3.5 檸條葉片中脯氨酸含量的測定

參照李合生的方法，采用茚三酮比色法測定[10]。稱取待測植物葉片0.25 g，加入5 mL3%的磺基水楊酸溶液，在沸水浴中提取10 min，吸取2 mL提取液加入2 mL冰醋酸及2 mL酸性茚三酮試劑，在沸水浴中加熱30 min，溶液即呈紅色。然后加入4 mL甲苯，搖蕩30 s，靜置片刻，取上層液至10 mL離心管中，在 3 000 r·min-1下離心5 min。用吸管輕輕吸取上層脯氨酸紅色甲苯溶液于比色杯中，以甲苯為空白對(duì)照，在分光光度計(jì)上520 nm波長處比色，求得吸光度值。根據(jù)回歸方程計(jì)算出(從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出)2 ml測定液中脯氨酸的濃度(μg·mL-1)，根據(jù)公式計(jì)算出脯氨酸含量(μg·g-1)。計(jì)算公式為：

脯氨酸含量=(X×5/2)/(鮮樣重)。

式中：X為測定液中脯氨酸的濃度。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel和SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用單因素方差分析(one-Way ANOVA)檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的顯著性差異(P<0.01)。

2 結(jié)果與分析

2.1 高溫脅迫下檸條葉片MDA含量的變化

丙二醛(MDA)是膜質(zhì)過氧化作用的主要產(chǎn)物之一，也是細(xì)胞膜被破壞的標(biāo)志物質(zhì)[14]。其含量可以表示膜脂過氧化的程度和植物對(duì)逆境條件反映的強(qiáng)弱[15]。膜脂過氧化是高溫對(duì)植物細(xì)胞膜造成傷害的原初機(jī)制，高溫導(dǎo)致葉片細(xì)胞膜脂過氧化增強(qiáng)。

圖1表明，隨著高溫脅迫的加劇，MDA含量持續(xù)增加，膜脂過氧化程度加劇, 30℃、35℃、40℃、45℃處理的MDA含量分別是對(duì)照的1.12倍、1.40倍、1.58倍和1.68 倍。

圖1 不同溫度脅迫下檸條葉片內(nèi)MDA含量的變化

表1 MDA單因子方差分析表

經(jīng)方差分析，由表1知各高溫脅迫處理的MDA與對(duì)照值相比，P=0.000，P<0.01,差異均達(dá)極顯著水平。說明短時(shí)間的高溫脅迫促進(jìn)了植物MDA含量的持續(xù)積累，細(xì)胞表面膜質(zhì)過氧化程度加強(qiáng)，這和尹堅(jiān)貴等[16]的結(jié)論相同。

2.2 高溫脅迫對(duì)檸條葉片超氧化物歧化酶(SOD)活性的影響

SOD是植物體內(nèi)清除活性氧自由基的關(guān)鍵酶，在保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷過程中具有十分重要的作用[17]。

由圖2可以看出，隨處理溫度的升高，檸條葉片的SOD活性迅速上升，35℃時(shí)達(dá)最大值，而后呈下降趨勢(shì)。表2可知各處理檸條SOD活性均與對(duì)照存在極顯著差異( P<0.01)。說明檸條SOD酶對(duì)逆境能做出快速反應(yīng)，但當(dāng)脅迫增加到一定程度時(shí)，活性開始持續(xù)下降。

圖2 不同溫度脅迫下檸條葉片內(nèi)SOD活性的變化

表2 SOD單因子方差分析表

2.3 高溫脅迫對(duì)檸條葉片過氧化物酶(POD)活性的影響

POD是植物對(duì)膜脂過氧化的酶促防御系統(tǒng)中重要的保護(hù)酶，POD在保護(hù)酶系統(tǒng)中主要是起到酶促降解H2O2的作用，從而使植物抵抗在逆境脅迫下代謝過程產(chǎn)生的有害物質(zhì)對(duì)細(xì)胞的傷害，表現(xiàn)出一定的抗逆性，其酶活性與植物抗旱性呈一定的相關(guān)性[18]。多數(shù)人已研究表明，抗旱性強(qiáng)的植物在高溫脅迫下，POD保護(hù)酶系統(tǒng)仍能維持較高的活性水平，防止了因高溫產(chǎn)生的毒害物質(zhì)如活性氧自由基的積累，減輕了由膜脂過氧化所引起的膜傷害，從而增加了植物的抗旱能力[19]。

由圖3可以看出，隨著高溫脅迫強(qiáng)度的增加，檸條葉片的POD活性呈先升后降的變化趨勢(shì)。 30℃、35℃、40℃和45℃處理下的POD活性依次比對(duì)照增加1.96倍、3.82倍、2.11倍、1.47倍。

圖3 不同溫度脅迫下檸條葉片內(nèi)POD活性的變化

表3 POD單因子方差分析表

經(jīng)方差分析得出，各高溫處理與對(duì)照之間的POD活性差異均達(dá)極顯著水平( P<0.01) 。POD的增加可能是活性氧在短時(shí)間內(nèi)作為信號(hào)分子誘導(dǎo)酶活性的增高，但隨著處理程度的加劇，POD活性明顯下降，可能是高溫脅迫使活性氧的大量積累，超出了POD保護(hù)酶的清除能力。

2.4 高溫脅迫下檸條葉片抗壞血酸(ASA)含量的變化

由圖4可見，隨著溫度脅迫程度加重，檸條ASA的含量呈上升趨勢(shì)，45℃處理下ASA含量最高，約為對(duì)照的3.5倍。

圖4 不同溫度脅迫下檸條葉片內(nèi)ASA含量的變化

表4 POD單因子方差分析表

經(jīng)方差分析，高溫脅迫處理的ASA含量均與對(duì)照存在極顯著差異( P<0.01)，檸條在嚴(yán)重高溫脅迫下具有較高的ASA含量，說明ASA對(duì)減緩和抵御活性氧的傷害具有重要意義。

2.5 高溫脅迫下檸條葉片脯氨酸含量的變化

脯氨酸主要是以游離狀態(tài)廣泛存在于植物中, 它是水溶性最大的氨基酸, 具有較強(qiáng)的水合能力[22]。逆境脅迫下植物體內(nèi)游離脯氨酸積累是一個(gè)普遍現(xiàn)象。脯氨酸含量的大幅增加有利于水分的保持,從而減輕由于高溫引起蒸騰作用加劇而產(chǎn)生的傷害[[23]。脯氨酸在脅迫條件下可以調(diào)節(jié)滲透平衡, 維持蛋白質(zhì)、膜和亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定, 清除活性氧。

圖5表明，隨著高溫脅迫程度的加劇，脯氨酸含量持續(xù)增加，30℃、35℃、40℃和45℃處理脯氨酸含量依次比對(duì)照增加4.01倍、3.5倍、3倍、2倍。

圖5 不同溫度脅迫下檸條葉片內(nèi)脯氨酸含量的變化

表5 脯氨酸含量單因子方差分析表

經(jīng)方差分析，在不同程度的高溫脅迫處理下，P=0.02，檸條葉片脯氨酸的積累量均極顯著地高于對(duì)照(p<0.01)，且各高溫脅迫處理間的脯氨酸含量的差異也達(dá)到了極顯著水平(p<0.01)。說明脯氨酸的積累是檸條適應(yīng)高溫脅迫的一種重要機(jī)制。

3 結(jié)論與討論

在高溫的自然環(huán)境下，植物的生長發(fā)育經(jīng)常會(huì)受到高溫脅迫的影響。植物為了逃避或者抵抗這種高溫脅迫的傷害，激起或者提高了植物體內(nèi)清除活性氧、保護(hù)膜系統(tǒng)的抗氧化防御系統(tǒng)的活性[24]。該系統(tǒng)主要由抗氧化酶類和抗氧化劑類組成，前者包括過氧化物酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶、抗壞血酸過氧化物酶和谷胱甘肽還原酶等，統(tǒng)稱為細(xì)胞的保護(hù)酶系統(tǒng)；后者則包括α維生素E、抗壞血酸、谷胱甘肽、類胡蘿卜素、脯氨酸等。

當(dāng)植物處于逆境脅迫時(shí)，細(xì)胞內(nèi)氧自由基產(chǎn)生和清除的平衡會(huì)遭到破壞，積累的氧自由基首先攻擊膜系統(tǒng)，膜脂脂肪酸中的不飽和鍵被過氧化，最終形成 MDA。逆境條件下，細(xì)胞膜膜脂過氧化作用的增強(qiáng)是膜傷害的重要原因之一。高溫脅迫下，檸條葉片內(nèi)MDA含量持續(xù)增加，說明高溫使檸條膜質(zhì)過氧化水平加重，細(xì)胞膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)在一定程度上遭到破壞，高溫脅迫程度與MDA增加程度具一定相關(guān)性[25]。

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