張濤 孫婷 黃靈勇 徐艷 王東凱

（1沈陽(yáng)藥科大學(xué) 遼寧 本溪 117004）

（2沈陽(yáng)沃森藥物研究所 遼寧 沈陽(yáng) 110016）

異福片是利福平和異煙肼組成的固定劑量復(fù)方制劑（Fixed Dose Combination,FDC），由賽諾菲-安萬(wàn)特公司于上世紀(jì)研發(fā)。該品種現(xiàn)收載于國(guó)際藥典、英國(guó)藥典、中國(guó)藥典等，已列入預(yù)認(rèn)證（Prequalification Program, PQ）品種目錄。本課題是中國(guó)衛(wèi)生部-蓋茨基金會(huì)結(jié)核病防治項(xiàng)目中“中國(guó)抗結(jié)核FDC藥品的質(zhì)量保證”子項(xiàng)目的一部分。本課題參照ICH指導(dǎo)原則開展了分析方法驗(yàn)證和降解雜質(zhì)研究，為制藥企業(yè)開展高端仿制藥雜質(zhì)研究提供參考依據(jù)。

1.儀器與材料

1.1 儀器和設(shè)備

Agilent1200型高效液相色譜儀（配有在線脫氣機(jī)、四元泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、UV檢測(cè)器和Chemstation工作站，美國(guó)Agilent公司），高純水機(jī)，微孔濾膜及過濾裝置。

1.2 試劑和試藥

利福平對(duì)照品（批號(hào)：L0J351，USP），異煙肼對(duì)照品（批號(hào)：10G205，USP），衛(wèi)非寧Rifinah（規(guī)格：福平300mg/異煙肼150mg；批號(hào)：A1462；諾菲-安萬(wàn)特公司意大利工廠生產(chǎn)），利福平原料藥（漯河南街村藥業(yè)集團(tuán)制藥有限公司生產(chǎn)），異福片（規(guī)格：利福平300mg/異煙肼150mg；批號(hào)：130501YF、130502YF和130601YF；華北制藥股份有限公司生產(chǎn)，高密度聚乙烯瓶、鋁塑鋁封口簽），醌式利福平對(duì)照品（批號(hào)：130413-201104，純度94.6%，中國(guó)食品藥品檢定研究院），甲醇為色譜純，磷酸二氫鉀和乙酸為分析純，水為超純水。

2.方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

稀釋液：取甲醇和pH7.0磷酸鹽緩沖液適量，按體積比4∶6混合后備用。

供試品溶液：取待測(cè)樣品20片，研細(xì)。取該粉末適量，使含利福平約40mg，精密稱定，加入200mL稀釋液中充分振搖，濾過，即得。

對(duì)照溶液：精密量取供試品溶液5mL，置100mL量瓶中，加稀釋液定容，充分振搖，即得。

對(duì)照品溶液：精密稱取利福平對(duì)照品適量，置于50mL量瓶中，加入稀釋液溶解并制成每1mL中約含0.2mg利福平的溶液，作為利福平對(duì)照品溶液。精密稱取異煙肼對(duì)照品適量，置于50mL量瓶中，加入稀釋液溶解并制成每1mL中約含0.1 mg異煙肼溶液，作為異煙肼對(duì)照品溶液。

2.2 色譜條件

色譜柱：Agilent C18柱（25cm×4.6mm，5μm）；流動(dòng)相：甲醇-pH7.0磷酸鹽緩沖液（6∶4）；流速1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm；進(jìn)樣量：20μl。

測(cè)定過程：溶液臨用現(xiàn)配，避光操作。HPLC系統(tǒng)適用性試驗(yàn)通過后，取上述對(duì)照溶液和供試品溶液，依次注入液相色譜儀，記錄色譜圖。按主成分自身對(duì)照法以保留時(shí)間對(duì)各雜質(zhì)定位、以峰面積計(jì)算各雜質(zhì)的量，即得。色譜圖上，面積小于0.02倍主成分峰的色譜峰（0.1%）和相對(duì)保留時(shí)間小于0.23的色譜峰忽略不計(jì)。[2]

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取雜質(zhì)對(duì)照品溶液，照2.2項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果，利福平峰和醌式利福平峰的分離度大于4，系統(tǒng)適用性良好。

2.3.2 專屬性 依次注入異煙肼、利福平、醌和腙的對(duì)照品溶液，結(jié)果異煙肼出峰時(shí)間在2.5 min左右，RRT小于0.23，不干擾雜質(zhì)測(cè)定；醌、腙和利福平分離良好，互不干擾。按照異福片處方制備不含利福平的空白溶液，在2.2色譜條件下測(cè)定。結(jié)果在利福平和各雜質(zhì)出現(xiàn)的位置無(wú)色譜峰出現(xiàn)，表明溶劑和輔料對(duì)雜質(zhì)測(cè)定結(jié)果無(wú)干擾。

2.3.3 檢測(cè)限 精密稱取利福平對(duì)照品適量，定量稀釋成系列低濃度溶液，峰值信號(hào)與基線噪音比較，信噪比為3∶1時(shí)的濃度為 0.1261μg·mL-1。

2.3.4 定量限 精密稱取利福平對(duì)照品適量，定量稀釋成系列低濃度溶液，峰值信號(hào)與基線噪音比較，信噪比為10∶1時(shí)的濃度為 0.3301μg·mL-1。

2.4 樣品測(cè)定

2.4.1 異福片中雜質(zhì)實(shí)際水平 取3批異福片，照2.2色譜條件測(cè)定有關(guān)物質(zhì)。結(jié)果，異福片中平均水平大于0.1%（報(bào)告閾值）的雜質(zhì)有6個(gè)，同時(shí)也大于0.2%（鑒別閾值和界定閾值）[3]，見表。

表 異福片中實(shí)際雜質(zhì)情況Tab.Actual impurity of Rifampicin and Isoniazid Tablets

在一定條件下，制劑中的利福平可發(fā)生水解（主要形成3-甲酰利福霉素及25-去乙?；Ｆ剑┖脱趸ㄖ饕纬甚嚼Ｆ胶蚇-氧化利福平），還可與異煙肼發(fā)生化學(xué)反應(yīng)形成腙[2]。另外，利福平原料藥中還可能存在利福霉素SV。

測(cè)定利福平對(duì)照品（USP）和參比制劑（Rifinah）的有關(guān)物質(zhì)可知，利福平對(duì)照品中含有1、2、4、5號(hào)雜質(zhì)，參比制劑中含有1、4號(hào)雜質(zhì)。這些雜質(zhì)超過了鑒定閾值，可認(rèn)為經(jīng)過了安全評(píng)估。供試品中這些雜質(zhì)的平均水平?jīng)]有超過法定對(duì)照品或參比制劑的水平，是安全的。

2.4.2 強(qiáng)光照射 根據(jù)利福平原料藥遇光變質(zhì)的特性，設(shè)計(jì)試驗(yàn)考察強(qiáng)光對(duì)雜質(zhì)的影響以及包裝對(duì)產(chǎn)品的保護(hù)作用。取同一批號(hào)的異福片60片，隨機(jī)分成三份，每份20片。其中一份為裸片、一份為裸片外包裹鋁箔、一份為市售包裝，并列平鋪擺放，置光照箱內(nèi)接受冷白日光燈和近紫外燈連續(xù)照射。分別于第5天和第10天取樣，依2.2色譜條件測(cè)定有關(guān)物質(zhì)。結(jié)果，異福片裸片中醌有明顯增加，市售包裝及暗對(duì)照幾乎沒有變化。

2.4.3 雜質(zhì)分析及控制 綜合以上結(jié)果，因?yàn)檩o料和異煙肼在2.2色譜條件下沒有雜質(zhì)峰，而利福平有，因此，可以確定這些雜質(zhì)都是利福平有關(guān)雜質(zhì)，或?yàn)槔Ｆ浇到猱a(chǎn)生或?yàn)槔Ｆ綆?。醌是利福平?jīng)光照或氧化的降解產(chǎn)物，易生成、增速快，生產(chǎn)中應(yīng)避光操作、保證產(chǎn)品密封性，必要時(shí)充氮。腙是利福平與異煙肼反應(yīng)的產(chǎn)物，易生成、增速快，在有水的情況下反應(yīng)更快[4]，生產(chǎn)中宜采用減少接觸、干法制粒并嚴(yán)格控制顆粒水分等措施來(lái)保證。雜質(zhì)1在高濕下增長(zhǎng)明顯，可能為利福平水解產(chǎn)物，生產(chǎn)中應(yīng)嚴(yán)格控制顆粒水分。雜質(zhì)2在高溫下增長(zhǎng)明顯，應(yīng)為利福平降解產(chǎn)物。雜質(zhì)4和5在高溫高濕及加速條件下幾乎不增長(zhǎng)，可能為利福平帶入的工藝雜質(zhì)，需完善利福平采購(gòu)標(biāo)準(zhǔn)來(lái)控制。

3.討論

3.1 在抗結(jié)核FDC的活性成分中，異煙肼為化學(xué)合成，性質(zhì)穩(wěn)定，純度高，4個(gè)特定雜質(zhì)均在0.1%以下，可以忽略。而利福平為發(fā)酵產(chǎn)物，純度較低，雜質(zhì)多，易降解和水解。因此，本研究重點(diǎn)考察了利福平的相關(guān)雜質(zhì)。

3.2 本文研究了利福平相關(guān)雜質(zhì)，確定了各雜質(zhì)的來(lái)源、檢測(cè)方法和限度要求，便于生產(chǎn)和質(zhì)量控制。其中醌和腙是最易增長(zhǎng)的兩種雜質(zhì)，需要單獨(dú)控制。

3.3 本研究證明了國(guó)產(chǎn)異福片通過優(yōu)化工藝、加強(qiáng)過程控制和提高質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，可以使其雜質(zhì)控制水平獲得提升，符合國(guó)際藥典標(biāo)準(zhǔn)。

3.4 本研究中1,2,4,5號(hào)雜質(zhì)雖然超過了ICH推薦的鑒定閾值和界定閾值，但經(jīng)過了評(píng)估，可依據(jù)“其它單個(gè)雜質(zhì)”項(xiàng)進(jìn)行控制。在這里，筆者認(rèn)為藥典中有關(guān)物質(zhì)項(xiàng)下的“其它單個(gè)雜質(zhì)”即“any other peak”，應(yīng)當(dāng)是制藥企業(yè)或上市許可持有人研究過并被批準(zhǔn)列入內(nèi)控質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的雜質(zhì)，而非任意的其它未知雜質(zhì)。其它未知雜質(zhì)仍要按照ICH Q3的原則進(jìn)行控制。

3.5 本研究中一些雜質(zhì)沒有最終確定化合物結(jié)構(gòu)，下一步將繼續(xù)對(duì)它們進(jìn)行深入研究。

【參考文獻(xiàn)】

[1]The International Pharmacopoeia(國(guó)際藥典).2017.Seventh Editon.http：//apps.who.int/phint/en/p/docf/

[2]ICH Q3B(國(guó)際人用藥品注冊(cè)與醫(yī)藥技術(shù)協(xié)調(diào)會(huì)議 Q3B新藥制劑中的雜質(zhì)).2006.第二版：70-80.

[3]李冰，姚蘭，孫曉軍.抗結(jié)核固定劑量復(fù)方制劑有關(guān)物質(zhì)的測(cè)定[J].中國(guó)醫(yī)藥工業(yè)雜志，2012，43（3）：208-211.