屈小虎，陳慧，黃玲，呂斌，金麗琴

（溫州醫(yī)科大學(xué) 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院、生命科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州 325035）

中醫(yī)之脾臟被稱作“后天之本”，氣血生化之源[1-3]。脾病則元?dú)馑ド?，各臟腑組織皆失其養(yǎng)而百病叢生[4-6]。清?沈金鰲《雜病源流犀燭?虛損癆瘵源流》云“虛者，氣血之虛。損者，臟腑之損。虛久致?lián)p，五臟皆有”[7]。脾主肌肉，人體的肌肉組織包括骨骼肌、心肌和平滑肌3種[8]，“脾病則四肢不用”，但涉及脾虛病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中心肌組織的能量代謝功能變化的研究報(bào)道較少。本研究通過(guò)構(gòu)建脾氣虛證和脾不統(tǒng)血證大鼠模型，探究脾虛證由淺及深的發(fā)生發(fā)展動(dòng)態(tài)過(guò)程與心肌組織能量代謝變化的關(guān)系，來(lái)闡明中醫(yī)脾氣虛弱，則氣血生化無(wú)源，五臟無(wú)所滋養(yǎng)，而積漸流于虛弱的理論觀點(diǎn)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)雄性SD大鼠，7～8周齡，48只，體質(zhì)量300～350 g，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK（浙）2015-0009。

1.1.2 藥物和試劑：低分子肝素鈉注射液的制備：低分子肝素鈉（吉派林，杭州九源基因工程有限公司，批號(hào)：H19990036），用0.9%的氯化鈉溶液稀釋至1 U/μL。ATP檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所。DNA提取試劑盒、RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 模型復(fù)制：將48只SD雄性大鼠隨機(jī)分為4組，分別為正常對(duì)照組、低分子肝素鈉組、脾氣虛組、脾不統(tǒng)血組，每組12只。所有大鼠實(shí)驗(yàn)前預(yù)游泳篩選，棄除游泳時(shí)間小于15 min的大鼠。造模期間，正常對(duì)照組與低分子肝素鈉組自由飲食飲水，脾氣虛組大鼠與脾不統(tǒng)血組大鼠采用游泳疲勞加飲食失節(jié)法處理，即連續(xù)每天將大鼠放于（35±2）℃水中游泳30 min，同時(shí)限制飲食（飲食1 d禁食2 d作為1個(gè)循環(huán)），連續(xù)處理14個(gè)循環(huán)（即42 d）后，觀察到大鼠出現(xiàn)明顯的食少、懶動(dòng)、形體消瘦、大便溏泄等癥狀即為脾氣虛造模成功。之后，在維持上述處理因素的基礎(chǔ)上，對(duì)低分子肝素鈉組大鼠和脾不統(tǒng)血組大鼠皮下注射低分子肝素鈉處理，即連續(xù)每天腹部皮下注射低分子肝素鈉，注射劑量為2000 U?kg-1?d-1。同時(shí)，正常對(duì)照組和脾氣虛組皮下注射相應(yīng)量的0.9%氯化鈉溶液作為對(duì)照。當(dāng)持續(xù)注射15～18 d時(shí)，2組大鼠皮下出血癥狀均有減輕甚至消失，此時(shí)，4組大鼠均隨機(jī)選出6只處死，并取出心肌組織凍存于-80 ℃冰箱中，此為造模中期。剩余大鼠繼續(xù)飼養(yǎng)并施加處理因素，當(dāng)注射30～33 d時(shí)，觀察到脾不統(tǒng)血組大鼠腹部出現(xiàn)較嚴(yán)重的不可逆皮下出血癥狀，便潛血檢測(cè)為陽(yáng)性，脾不統(tǒng)血大鼠造模成功。處死大鼠解剖并取出所需組織凍存于-80 ℃冰箱中，此為造模末期。具體造模方法參考本課題組前期的研究基礎(chǔ)[9]。

1.2.2 心肌組織ATP含量以及線粒體檸檬酸合酶[citrate（Si）-synthase，CS]和呼吸鏈復(fù)合物（Complex I、Complex II、Complex III、Complex IV）活性檢測(cè)：采用ATP檢測(cè)試劑盒測(cè)定實(shí)驗(yàn)大鼠心肌組織ATP含量，操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書進(jìn)行；CS和呼吸鏈復(fù)合物活性檢測(cè)方法參照文獻(xiàn)[10]進(jìn)行。

1.2.3 心肌組織線粒體DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）拷貝數(shù)檢測(cè)：采用DNA提取試劑盒進(jìn)行組織DNA提取。從PubMed系統(tǒng)查詢ND1和β-actin基因mRNA的NM號(hào)和序列，按照引物設(shè)計(jì)原則進(jìn)行設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程股份有限公司合成?；蛞镄蛄袨椋篘D1上游引物5’-GGGATGAGCCTCAAATTCAA-3’，下游引物5’-GGAGCCGCTTATTAGGAGGA-3’；β-actin上游引物5’-TGTCACCAACTGGGACGATA-3’，下游引物5’-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3’。

參照熒光定量PCR試劑盒說(shuō)明書配制熒光定量PCR體系并設(shè)定反應(yīng)條件。每組樣本按編號(hào)順序上樣，各樣本設(shè)2個(gè)復(fù)孔。使用CFX-96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性10 s；95 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，反復(fù)40個(gè)循環(huán)；95 ℃ 5 s后結(jié)束程序。導(dǎo)出最終的擴(kuò)增結(jié)果，根據(jù)公式計(jì)算各樣本線粒體DNA拷貝數(shù)的相對(duì)含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.4 心肌組織COXIV和Cyt-C蛋白表達(dá)量檢測(cè)：采用Western blot檢測(cè)目的蛋白在大鼠心肌中表達(dá)量的變化，即剪取心肌組織提取蛋白，制備樣品后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，蛋白轉(zhuǎn)膜封閉后孵育相應(yīng)抗體顯色曝光，最后用Image-J軟件灰度分析目的蛋白和內(nèi)參蛋白條帶的平均光密度并統(tǒng)計(jì)分析。

1.2.5 心肌組織COXIV和Cyt-C的mRNA表達(dá)量檢測(cè)：采用Trozol手工法提取組織RNA后，利用RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。引物合成及其序列號(hào)：從PubMed系統(tǒng)查詢目的基因mRNA的NM號(hào)和序列，按照引物設(shè)計(jì)原則進(jìn)行設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程股份有限公司合成。基因引物序列為：β-actin上游引物5’-TGTCACCAACTGGGACGATA-3’，下游引物5’-GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA-3’；Cyt-C上游引物5’-AGG TATCACCTGGGGAGAGG-3’，下游引物5’-GTCTGCCCTTTCT CCCTTCT-3’；COXIV上游引物5’-AGAAGGCCCTGAAGGAGA AG-3’，下游引物5’-ACTCATTGGTGCCCTTGTTC-3’。

參照SYBR Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）試劑盒說(shuō)明書配制熒光定量PCR體系并設(shè)定反應(yīng)條件。每組樣本按編號(hào)順序上樣，各樣本設(shè)2個(gè)復(fù)孔。使用CFX-96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性1 min；95 ℃ 10 s，58 ℃30 s，反復(fù)39個(gè)循環(huán)；95 ℃ 5 s后結(jié)束程序。導(dǎo)出最終的擴(kuò)增結(jié)果，根據(jù)公式計(jì)算各樣本mtDNA拷貝數(shù)的相對(duì)含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并用Graphpad Prism6.0軟件作圖。所有數(shù)據(jù)以±SEM表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心肌組織ATP含量變化 與正常對(duì)照組比，末期的脾氣虛組和脾不統(tǒng)血組大鼠心肌的ATP含量均顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但中期的脾氣虛組和脾不統(tǒng)血組大鼠心肌的ATP含量較正常對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與脾氣虛組比，中期和末期的脾不統(tǒng)血組大鼠心肌ATP含量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與低分子肝素鈉組比，中期和末期的脾不統(tǒng)血組大鼠心肌的ATP含量降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠不同時(shí)期心肌ATP含量（n=6，±SEM，μmol/g）

表1 各組大鼠不同時(shí)期心肌ATP含量（n=6，±SEM，μmol/g）

與正常對(duì)照組比：aP＜0.05，bP＜0.01；與低分子肝素鈉組比：cP＜0.05，dP＜0.01

2.2 心肌CS活性變化 與正常對(duì)照組比，中期和末期的脾氣虛組和脾不統(tǒng)血組大鼠心肌CS活性顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與脾氣虛組比，中期和末期的脾不統(tǒng)血組大鼠心肌CS活性有所降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與低分子肝素鈉組比，中期和末期的脾不統(tǒng)血組大鼠心肌CS活性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），見圖1。

圖1 各組大鼠不同時(shí)期心肌CS活性比較（n=6）

2.3 心肌線粒體復(fù)合物活性變化 與正常對(duì)照組比，中期的脾氣虛組和脾不統(tǒng)血組大鼠心肌組織Complex I、Complex II的活性顯著升高，脾氣虛組Complex IV及脾不統(tǒng)血組Complex III、Complex IV的活性顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），末期的脾氣虛組和脾不統(tǒng)血組大鼠心肌Complex I、Complex II、Complex III、Complex IV的活性顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與脾氣虛組比，中期的脾不統(tǒng)血組大鼠心肌Complex I的活性有所升高，而Complex III的活性有所降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而末期的脾不統(tǒng)血組心肌4種復(fù)合物活性與脾氣虛組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與低分子肝素鈉組比，中期脾不統(tǒng)血組大鼠心肌Complex I、Complex III、Complex IV活性呈降低趨勢(shì)，末期脾不統(tǒng)血組大鼠心肌Complex I、Complex IV活性呈降低趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。

2.4 心肌mtDNA拷貝數(shù)變化 與正常對(duì)照組比，中期和末期的脾不統(tǒng)血組大鼠心肌mtDNA拷貝數(shù)顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但與脾氣虛組比，中期和末期的脾不統(tǒng)血組大鼠心肌mtDNA拷貝數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與低分子肝素鈉組比，中期和末期脾不統(tǒng)血組的大鼠心肌mtDNA拷貝數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖3。

圖2 各組大鼠不同時(shí)期心肌線粒體復(fù)合物活性比較（n=6）

圖3 各組大鼠不同時(shí)期心肌mtDNA拷貝數(shù)比較（n=6）

2.5 心肌組織COXIV蛋白和Cyt-C蛋白表達(dá)量變化與正常對(duì)照組比，末期的脾氣虛組大鼠心肌COXIV蛋白表達(dá)量顯著降低，中期和末期的脾不統(tǒng)血組COXIV蛋白表達(dá)量也顯著降低，中期的脾氣虛組Cyt-C蛋白表達(dá)量顯著降低，而末期的脾不統(tǒng)血組Cyt-C蛋白表達(dá)量顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與脾氣虛組比，中期和末期的脾不統(tǒng)血組大鼠心肌Cyt-C蛋白表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與低分子肝素鈉組比，中期和末期的脾不統(tǒng)血組大鼠心肌COXIV蛋白表達(dá)量均呈降低趨勢(shì)，末期脾不統(tǒng)血組大鼠心肌Cyt-C蛋白表達(dá)量呈升高趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖4。

2.6 心肌組織COXIV和Cyt-C的mRNA相對(duì)表達(dá)量變化 與正常對(duì)照組比，中期和末期的脾氣虛組和脾不統(tǒng)血組大鼠心肌COXIV的mRNA表達(dá)量顯著降低，中期的脾氣虛組Cyt-C的mRNA表達(dá)量顯著降低，末期的脾不統(tǒng)血組Cyt-C的mRNA表達(dá)量顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與脾氣虛組比，中期的脾不統(tǒng)血組Cyt-C的mRNA表達(dá)量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與低分子肝素鈉組比，中期和末期脾不統(tǒng)血組大鼠心肌COXIV的mRNA表達(dá)量呈降低趨勢(shì)，末期脾不統(tǒng)血組大鼠心肌Cyt-C的mRNA表達(dá)量呈升高趨勢(shì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見圖5。

圖4 各組大鼠不同時(shí)期心肌組織COXIV、Cyt-C的蛋白相對(duì)表達(dá)量比較（n=6）

圖5 各組大鼠不同時(shí)期心肌組織COXIV、Cyt-C的mRNA相對(duì)表達(dá)量比較（n=6）

3 討論

中醫(yī)認(rèn)為，周身之肌肉皆由脾胃所運(yùn)化水谷精微榮養(yǎng)，才能健壯豐滿[11-13]。中醫(yī)脾主肌肉，心肌組織的功能與脾臟密切相關(guān)。心臟具有推動(dòng)血液運(yùn)行的重要作用，也是能量代謝極為旺盛的組織。脾臟虛弱則肌肉消瘦，氣虛乏力，不耐勞作[14-15]，機(jī)體能量代謝出現(xiàn)障礙，細(xì)胞線粒體功能出現(xiàn)異常[16]。有學(xué)者通過(guò)研究脾氣虛證大鼠心肌線粒體變化并進(jìn)行藥物干預(yù)，發(fā)現(xiàn)脾氣虛影響心肌線粒體突變和缺失，導(dǎo)致線粒體氧化代謝相關(guān)酶活性改變[17]。中醫(yī)脾氣虛證以脾臟虛弱，脾氣耗損，運(yùn)化失常為主要特征，表現(xiàn)為少氣乏力，形體瘦弱，肢體疲乏等；脾不統(tǒng)血證是在脾氣虛基礎(chǔ)上發(fā)生的，由于脾氣虛弱，無(wú)力統(tǒng)攝血液循行脈中造成出血，臨床表現(xiàn)包括脾氣虛癥狀和皮下出血、便血等，是更為嚴(yán)重的氣虛血虛病證。本研究聯(lián)合兩種病證，通過(guò)脾氣虛發(fā)生發(fā)展形成脾不統(tǒng)血，將脾不統(tǒng)血證成模過(guò)程分為中期和末期，探討心肌組織能量代謝的變化。

本研究結(jié)果顯示，末期脾氣虛組和脾不統(tǒng)血組大鼠心肌組織ATP含量較正常對(duì)照組顯著降低，但2組間沒有顯著差異，提示隨著脾虛證的持久，心肌線粒體能量代謝發(fā)生了異常變化，但2種脾虛證在心肌能量代謝方面并未出現(xiàn)差異。進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，脾氣虛組和脾不統(tǒng)血組大鼠心肌組織的CS活性均顯著低于正常對(duì)照組，提示脾虛證大鼠心肌CS活性存在異常變化；脾不統(tǒng)血組大鼠CS活性顯著低于脾氣虛組，提示大鼠脾氣虛證發(fā)展為脾不統(tǒng)血證，心肌CS活性降低。而從心肌線粒體呼吸鏈復(fù)合物活性的檢測(cè)結(jié)果來(lái)看，末期的脾氣虛組和脾不統(tǒng)血組大鼠的4種復(fù)合物活性顯著低于正常對(duì)照組，但2組大鼠之間沒有顯著差異，與心肌ATP含量的變化趨勢(shì)相一致，表示心肌合成ATP的能力發(fā)生了損傷，提示脾虛證中，心肌線粒體能量合成被嚴(yán)重影響，但這種影響在脾氣久虛時(shí)表現(xiàn)得較為顯著。

檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，脾不統(tǒng)血組大鼠mtDNA拷貝數(shù)較正常對(duì)照組升高，而脾氣虛組大鼠mtDNA拷貝數(shù)雖略顯升高，但較正常對(duì)照組和脾不統(tǒng)血組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示脾虛證中，心肌組織mtDNA產(chǎn)生顯著變化需要較長(zhǎng)的疾病時(shí)間。

結(jié)果顯示，中期脾不統(tǒng)血組大鼠COXIV蛋白以及脾氣虛組大鼠Cyt-C蛋白的表達(dá)量較正常對(duì)照組降低，末期脾氣虛組和脾不統(tǒng)血組大鼠COXIV蛋白表達(dá)量較正常對(duì)照組降低，脾不統(tǒng)血組大鼠Cyt-C蛋白表達(dá)量較正常對(duì)照組升高，而脾氣虛組大鼠Cyt-C蛋白表達(dá)量較正常對(duì)照組無(wú)顯著差異，提示脾虛證早期，由于線粒體呼吸鏈相關(guān)蛋白表達(dá)變化的影響，心肌線粒體合成ATP的能力下降，隨著脾虛病持久影響，脾氣虛證加重和脾不統(tǒng)血證的形成都能使心肌線粒體呼吸鏈相關(guān)蛋白發(fā)生變化，導(dǎo)致心肌線粒體合成ATP的能力持續(xù)下降，并且心肌細(xì)胞有凋亡的趨勢(shì)。同時(shí)，脾氣虛組大鼠和脾不統(tǒng)血組大鼠心肌COXIV和Cyt-C的mRNA相對(duì)表達(dá)量變化與其蛋白表達(dá)量變化趨勢(shì)基本一致，提示脾虛證大鼠心肌組織能量代謝異常存在基因表達(dá)水平的改變。

本研究通過(guò)測(cè)定脾氣虛證和脾不統(tǒng)血證大鼠心肌ATP含量、CS活性、線粒體呼吸鏈復(fù)合物活性、mtDNA拷貝數(shù)、COXIV蛋白和Cyt-C蛋白及其mRNA表達(dá)量的變化，從結(jié)果可以看出，大鼠在疾病早期發(fā)病過(guò)程中，脾氣虛證并沒有顯著影響到心肌組織能量代謝，隨著脾虛病的病程加長(zhǎng)以及脾氣虛證向脾不統(tǒng)血證的轉(zhuǎn)變，大鼠心肌組織能量代謝功能發(fā)生了障礙，ATP含量顯著降低，檸檬酸循環(huán)和氧化磷酸化相關(guān)酶活性及代謝中重要蛋白和基因的表達(dá)都發(fā)生了改變，說(shuō)明脾虛證對(duì)大鼠心肌組織是有不利影響的，而這種影響隨著脾虛證的加重而越來(lái)越明顯。脾虛病程加長(zhǎng)及脾氣虛證向脾不統(tǒng)血證的轉(zhuǎn)變，大鼠心肌組織能量代謝功能逐漸發(fā)生障礙，正是中醫(yī)脾氣虛弱，氣血生化無(wú)源，五臟無(wú)所滋養(yǎng)，而積漸流于虛弱的營(yíng)養(yǎng)與生化機(jī)制。

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