羅國廠 楊 坦 張春玉 吳新杰 熊 平

(南陽醫(yī)學高等?？茖W校 南陽 473000)

很多法醫(yī)實踐工作中，法醫(yī)工作者不僅僅要解決死者年齡、死者身份、死亡原因、死亡性質以及致死手段等問題，還有死后間隔時間(postmortem interval, PMI)的估計。死后間隔時間在刑事案件和意外死亡案件中非常重要，準確評估PMI為案件偵破提供重要線索。因此，推斷PMI一直是法醫(yī)學者研究的重要課題之一[1～2]。

脫氧核糖核酸(Deoxyribonucleic acid, DNA)是生物體細胞中的遺傳物質，每個細胞的DNA結構和含量相當穩(wěn)定，一般情況下，每個細胞核的DNA含量不變。但是，機體死亡后，細胞核DNA會發(fā)生降解，且DNA降解的速度在一定時間內存在一定的規(guī)律，因此對DNA進行定量檢測來推斷死亡時間是一種有效的方法。組織切片經過特殊染色(Feulgen染色)后可以利用圖像分析技術特異性測定DNA灰度值，用已知定量細胞(淋巴細胞)DNA含量做對照，從而得到細胞DNA含量[1]。

組織芯片也稱組織微陣列(tissue microarray,TMA)技術，是在一個玻片上包含多個組織，一起切片、一起染色，具有平行、高通量等優(yōu)點[3]，用組織微陣列技術對多個組織進行處理，可以獲得大量的數據資料，節(jié)約了組織材料，而且實驗條件一致可減小實驗誤差，用于推斷PMI具有不可比擬的優(yōu)越性。

圖像分析技術(Image analysis technology ，IAT)是用已知組織含量的前提下，利用計算機技術對特殊染色的組織進行對比，實現定量分析。

IAT結合TMA研究機體死后組織細胞DNA變化，樣本量大，條件一致性、可比性增強，為準確推斷PMI成為可能。

1 材料與方法

1.1 材料

取雄性健康新西蘭兔39只(每只重量在2.5～3.0kg)，隨機分為13組，每組3只，隨機在動物房散養(yǎng)。實驗環(huán)境溫度控制在20～25℃，每組3只，開始實驗前首先稱重，根據不同個體重量，用20%烏拉坦靜脈麻醉，頸動脈放血死，在死后每隔4h解剖一組，取實驗需要的組織，10%甲醛固定。

選取人體離體組織(明確離體時間)，20～25℃保存，間隔4h，在離體0h、4h、8h、12h、16h、20h、24h、28h、32h、36h、40h、44h、48h分別取0.5×0.5cm肌肉組織，10%甲醛固定。

1.2 方法

1.2.1常規(guī)組織蠟塊制作，HE染色后了解取材情況，初步了解細胞細胞核變化

選取各個不同時間段的組織，按照常規(guī)石蠟切片制作要求制作蠟塊，切片、HE染色，顯微鏡下觀察細胞核變化情況，評估蠟塊質量，選取典型部位。

1.2.2兩組織芯片的制作[3]及Feulgen染色

芯片各個位點排列：組織標本在組織芯片上按照時間點順序排列，第一個設計為空白點，便于識別，從左到右按時間順序，依次為離體0h、4h、8h、12h、16h、20h、24h、28h、32h、36h、40h、44h、48h的組織(共3組)。

芯片制備：將熔化石蠟制作的空白蠟塊,設計6×7點組織列陣、打孔，在各時間點供體蠟塊上標記所需靶點，45℃烘10min，取樣器鉆取靶點組織，逐個取出組織芯，放入預先設計的陣列模塊中，將制成組織芯片倒置，55℃，30min，輕壓模塊排平。

切片、Feulgen染色[1](1M HCl 、60℃下水解將DNA分子中嘌呤堿基與去氧核糖之間的糖苷鍵打斷，嘌呤脫下，去氧核糖C-1位置釋放醛基與席夫試劑反應顯紫紅色，只有DNA才具有這種專一的反應)、脫水、透明、封固。

1.2.3圖像分析、數據采集

Feulgen染色后的組織芯片的DNA顯紫紅色，在550nm的光波照射吸收光最強，所測積分光密度與細胞的DNA含量成正比，圖像采集使用(560±10)nm的濾光片，每個芯片的觀察視野設定測量范圍、利用濾光片減背底、每個細胞進行分割(明確范圍)、濾波、對一些聚焦不清和重疊的細胞進行刪除，全部設定完畢后開始自動測量，所得數據以人淋巴細胞核作對照，計算細胞DNA含量平均值，每個芯片位點測量細胞數不少于50個[1]。

1.3 統(tǒng)計分析

2 結果

圖1 兔肌肉組織芯片

圖2 低倍鏡下組織芯片的一個點(兔腎臟)10×10

圖3 Feulgen染色，經過濾光處理后兔腎組織芯片視野表現10×40

2.1 兔組織細胞核DNA含量與PMI關系相關分析

時間為因變量，DNA平均含量為自變量，進行用單因素方差分析，所得相關方程式。

骨骼肌組織相關方程式為：Y=-0.0175x+6.997

肝臟組織相關方程式為：Y=-0.0208x+7.175

脾臟組織相關方程式為：Y=-0.0474x+6.641

心肌組織相關方程式為：Y=-0.0253x+7.823

腎臟組織相關方程式為：Y=-0.0415x+6.721

睪丸相關方程式為：Y=-0.0244x+8.277

腸相關方程式為：Y=-0.0506x+7.002

胃相關方程式為：Y=-0.0419x+6.242

膀胱相關方程式為：Y=-0.0279x+7.531

膽囊相關方程式為：Y=-0.0292x+6.767

氣管組織相關方程式為：Y=-0.0274x+7.857

肋軟骨相關方程式為：Y=-0.0174x+7.753

角膜相關方程式為：Y=-0.0214x+7.025

腦組織相關方程式為：Y=-0.0487x+6.951

2.2 兔各組織細胞核DNA降解的時序性分析

各個組織由于其所處機體位置、自身質地、酶含量等條件不同，所以出現平臺期的時間不一樣，其中腦組織最早、其次為腸、脾組織等。

通過比較各組織細胞核DNA降解的時序性，初步了解不同組織降解影響因素具有差異。

2.3 人體組織細胞核DNA含量與PMI相關方程式

肌肉組織細胞核DNA降解相關方程式為：Y=-0.0193x+7.896，決定系數R2=0.9005，DNA含量與PMI呈明顯的負相關。

2.4 不同組織細胞核DNA含量與PMI關系的多元回歸分析

肌肉細胞核DNA含量和PMI數據之間進行多元線性回歸分析：

Y=484.4-45.1X1-18.2X2(Y為PMI，X1為人肌肉DNA，X2為兔DNA)，決定系數R2=0.911，P=0.000。

PMI為因變量，把兔各組織DNA含量作自變量，按a=0.1引入自變量標準，進行逐步回歸分析，各因素之間有顯著差異(P<0.05)。

3 討論

自從1924年Feulgen等人建立了DNA-Feulgen染色方法以來，Feulgen染色仍是DNA定量主要染色方法之一。Feulgen染色經典顯示脫氧核糖核酸的方法具體原理是，標本經稀鹽酸水解后，DNA分子中的嘌呤堿基被解離，在核糖的一端出現了醛基。Schiff試劑中的無色品紅可與醛基反應，形成含有醌基的化合物分子, 因醌基為發(fā)色團，呈現出紫紅色，從而顯示出DNA的分布，可以鑒定DNA。

機體死亡后，溶酶體膜破裂細胞自溶，最終溶解消失[4]。在細胞自溶的過程中細胞核中的DNA在多種原因作用下逐步降解，最后完全消失。細胞DNA含量隨著PMI延長而逐漸減少，平臺期后與PMI呈時間依賴性關系，已經有多位法醫(yī)工作者的證實[1,5～7]

本實驗結果表明：組織細胞核DNA在經過一個平臺期后，含量逐漸下降，隨著PMI的延長而逐步下降，進一步驗證了以前的論述[1,5～7]。我們利用離體的人體組織和兔組織DNA降解進行比較，證實兩者具有高度相關性，證實可以利用動物組織DNA降解情況作為人體PMI研究的依據。

本次用組織芯片技術和計算機圖像分析技術來研究DNA和PMI的相關性，高通量特點可以包容大量的信息，同時大量組織在同一條件下進行測量，能保證實驗條件的一致性[1]。兩種儀器操作較簡單、方便，為將來廣泛地應用提供了可能。

參 考 文 獻

1 羅國廠,熊平.比較人和兔細胞DNA降解來推斷人死亡時間的可行性研究.衡陽:南華大學學報,2007.

2 林旭,尹雅莎,冀強.DNA定量技術在死亡時間推斷中的研究進展.法醫(yī)學雜志,2011,27(1):47～51.

3 陳杰偉,劉君,張淦梅,等.高效實用的組織芯片免疫組織化學對照體系的建立.中國組織化學與細胞化學雜志,2017,26(2):170～177.

4 羅國廠,熊平.組織芯片在推斷死亡時間中的應用探討.南華大學學報(醫(yī)學版),2006,34(5):631～633.

5 龍仁,黃安,王偉平,等.低溫下大鼠死后骨骼肌及肝組織平均ATP含量變化與PMI關系的研究.美國中華臨床醫(yī)學雜志,2005,7(3):184～185.

6 舒細記,王樹法,李艷,等.死后5～36h人腦細胞DNA降解含量的圖像分析.第三軍醫(yī)大學學報,2005,8(4):796～798.

7 熊平,郭平,張靜.組織細胞DNA降解與死亡時間的相關性的顯微拉曼光譜分析.光譜學與光譜分析,2010,30(1):1511～1515.