毛迎新 譚榮榮 王友平 陳勛 王紅娟 黃丹娟 龔自明

摘要

利用Illumina HiSeq技術(shù)，對赤壁、大悟、武漢、咸安和英山5個茶園小貫小綠葉蟬地理種群的成蟲共生細菌16S rDNAV4變異區(qū)進行測序，應(yīng)用Uparse和RDP Classifier等軟件統(tǒng)計和分析樣本的物種組成、豐度和多樣性。5個地區(qū)小貫小綠葉蟬成蟲的16S rDNA基因序列文庫共獲得239 645條有效tags，在97%相似閾值下將其聚類為3 403個OTUs。共注釋到41個門，116個綱，197個目，272個科，372個屬，105個種。5個樣本的共生菌在不同分類水平上的組成有所不同，其中在門水平上，主要優(yōu)勢菌為變形菌門Proteobacteria（相對豐度60.6%～97.1%）；在綱水平上，相對豐度排名前5位中共有的優(yōu)勢菌為γ變形菌綱Gammaproteobacteria和α變形菌綱Alphaproteobacteria；在屬水平上，排名前10位中5個樣本共有的優(yōu)勢菌為鹽單胞菌屬Halomonas、希瓦氏菌屬Shewanella和沃爾巴克氏體屬Wolbachia。小貫小綠葉蟬成蟲細菌的Chao指數(shù)、Ace指數(shù)、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)分別為1 065.55～2 841.89，1 130.76～2 914.90，1.07～8.63和0.18～0.99。茶園小貫小綠葉蟬成蟲共生細菌多樣性比較豐富，不同地理種群的小貫小綠葉蟬細菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性有差異。本研究結(jié)果為進一步研究細菌對小貫小綠葉蟬種群生物學(xué)的影響奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞

小貫小綠葉蟬； 細菌； 16S rDNA； 多樣性

中圖分類號：

S 433.39

文獻標識碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017347

Analysis of the bacterial diversity in adults of Empoasca （Matsumurasca）

onukii based on 16S rDNA sequences

MAO Yingxin1， TAN Rongrong1， WANG Youping2， CHEN Xun1，

WANG Hongjuan1， Huang Danjuan1， GONG Ziming1

（1. Institute of Fruits and Tea， Hubei Academy of Agricultural Sciences， Wuhan 430064， China；

2. Institute of Plant Protection， Soil and Fertilizers， Hubei Academy of Agricultural Sciences； Key Laboratory of

Integrated Pest Management of Crop Pests in Central China， Ministry of Agriculture，Wuhan 430064， China）

Abstract

The V4 regions of the 16S rDNA of symbiotic bacteria in adults of Empoasca （Matsumurasca） onukii from five geographical regions including Chibi， Dawu， Wuhan， Xianan and Yingshan were sequenced by Illumina HiSeq techniques. The numbers of operational taxonomic units （OTUs）， bacterial community， species abundance and alpha diversity in samples were analyzed by using Uparse and RDP Classifier software. The results showed that a total of 239 645 effective tags were obtained， which were clustered into 3 403 OTUs， and annotated into 41 phyla， 116 classes， 197 orders， 272 families， 372 genera， and 105 species. At the phyla level， Proteobacteria was the common dominant bacteria （relative abundance 60.6%-97.1%）. Gammaproteobacteria and Alphaproteobacteria were the commonly dominant classes in the top 5 classes of bacterial communities between the five samples. Halomonas， Shewanella and Wolbachia were the commonly dominant genera in the top 10 genera of bacterial communities. The indexes of Chao， Ace， Shannon and Simpson were 1 065.55-2 841.89， 1 130.76-2 914.90， 1.07-8.63 and 0.18-0.99， respectively. The results indicated that there are diverse bacteria in adults of E.（M.）onukii，and there are differences in the bacterial community diversity among E.（M.）onukii populations. These results provide a basis for further study of the effects of bacteria on the biology of E.（M.）onukii.

Key words

Empoasca （Matsumurasca） onukii； bacterium； 16S rDNA； diversity

昆蟲攜帶共生菌是一種普遍存在的自然現(xiàn)象。在長期的協(xié)同進化過程中，昆蟲與其內(nèi)共生菌之間形成了穩(wěn)定的互惠共生關(guān)系[1]。昆蟲為共生菌提供穩(wěn)定的生存環(huán)境，共生菌在昆蟲生命活動中起著重要的作用，如為宿主昆蟲提供必需的營養(yǎng)物質(zhì)，維持宿主昆蟲的正常生長發(fā)育[2]，增強宿主對病原微生物、天敵等生物脅迫的抵御能力[34]，提高宿主的生殖力及雌性比例[5]，調(diào)節(jié)宿主昆蟲對環(huán)境和寄主植物的適應(yīng)性等[67]。共生菌對宿主昆蟲有著重要的生物學(xué)和生態(tài)學(xué)意義，因此，有關(guān)內(nèi)共生菌的多樣性與功能研究也備受關(guān)注。

小貫小綠葉蟬 Empoasca （Matsumurasca） onukii 是我國茶區(qū)普遍發(fā)生的重要害蟲，主要以成蟲和若蟲刺吸為害茶樹嫩莖、嫩葉，雌蟲產(chǎn)卵會給嫩莖造成機械損傷，嚴重影響茶葉產(chǎn)量和品質(zhì)。該葉蟬原屬林木中的一種非適生性害蟲，當茶樹向山區(qū)、半山區(qū)發(fā)展時侵入茶園，并很快蔓延發(fā)展成為茶園最主要的優(yōu)勢蟲種[8]，在該蟲定殖、擴散和暴發(fā)的過程中某些內(nèi)共生菌可能就起著重要的作用。但目前我國還沒有小貫小綠葉蟬內(nèi)共生菌種類、功能研究的相關(guān)報道。為此，本研究利用16S rDNA基因文庫技術(shù)和Illumina HiSeq測序技術(shù)，對來自湖北不同茶園的小貫小綠葉蟬內(nèi)共生細菌群落結(jié)構(gòu)及其多樣性進行了檢測分析，以期為進一步研究內(nèi)共生菌對小貫小綠葉蟬生物學(xué)、生態(tài)學(xué)的影響奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試蟲來源及DNA提取

2015年6月，從湖北省英山縣、咸安區(qū)、赤壁市、大悟縣和武漢市茶園分別采集小貫小綠葉蟬成蟲，每個樣點100頭。采樣茶園的具體地點、地理坐標以及種植的茶樹品種等詳見表1。設(shè)置5個不同地理種群的樣本，即英山種群（YS）、咸安種群（XA）、赤壁種群（CB）、大悟種群（DW）和武漢種群（WH），每個種群隨機選取50頭成蟲，用75%乙醇表面消毒90 s，滅菌水清洗5次后，用上海生物工程有限公司生產(chǎn)的細菌基因組DNA提取試劑盒對樣本的基因組DNA進行提取。

1.2 16S rDNA的擴增

以提取的基因組DNA為模板，采用細菌16S rDNA通用引物515F（5′GTGCCAGCMGCCGCGGTAA3′） 和 806R（5′GGACTACHVGGGTWTCTAAT3′）擴增V4片段。PCR反應(yīng)體系為30 μL：Phusion Master Mix（2×）15 μL，引物（2 μmol/L）3 μL， gDNA（1 ng/μL）10 μL，ddH2O 2 μL。PCR條件：98℃預(yù)變性1 min；98℃ 10 s， 50℃ 30 s， 72℃ 30 s，30個循環(huán)；72℃ 5 min。

1.3 PCR產(chǎn)物的純化

PCR產(chǎn)物使用2%瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，切取的目的條帶，使用Qiagen QIAquick PCR Purification Kit膠回收試劑盒回收純化產(chǎn)物，方法參照試劑盒說明書。

1.4 文庫構(gòu)建及高通量測序

回收的目的片段，用TruSeq DNA PCRFree Sample Preparation Kit建庫試劑盒進行文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit定量試劑盒PCR定量，文庫合格后，使用Hiseq2500 PE250進行上機測序。

1.5 測序數(shù)據(jù)處理

采用Illumina HiSeq 測序平臺得到的原始數(shù)據(jù)（raw PE），存在一定比例的干擾數(shù)據(jù)（dirty data），為了使信息分析的結(jié)果更加準確、可靠，首先要進行拼接和質(zhì)控，得到clean tags，再進行嵌合體過濾，得到最終用于后續(xù)分析的有效數(shù)據(jù)（effective tags）。

1.6 共生細菌鑒定與多樣性分析

利用Uparse 軟件（Uparse v7.0.1001）[9] 對所有樣品的全部有效數(shù)據(jù)進行聚類，以97%的一致性（identity）將序列聚類成為操作分類單元OTUs （operational taxonomic units），篩選OTUs中出現(xiàn)頻數(shù)最高的序列作為OTUs的代表序列。用RDP Classifier （Version 2.2， http：∥sourceforge.net/projects/rdpclassifier/）方法與GreenGene數(shù)據(jù)庫（http：∥greengenes.lbl.gov/cgibin/nphindex.cgi）對OTUs代表序列進行物種注釋分析，在不同分類水平上統(tǒng)計各樣本的群落組成。并對 OTUs 進行豐度、多樣性指數(shù)分析。選取Chao和Ace指數(shù)反映微生物豐富度，用Simpson和Shannon指數(shù)反映微生物多樣性。

2 結(jié)果與分析

2.1 序列拼接和組裝

小貫小綠葉蟬成蟲的16S rDNA序列文庫共獲得了239 645條有效tags，以97%的一致性作為相似性的閾值將序列聚類為3 403個OTUs。其中，赤壁小貫小綠葉蟬種群共有54 060條有效tags，聚類為2 633個OTUs；大悟種群共有45 165條有效tags，聚類為2 370個OTUs；武漢種群共有35 062條有效tags，聚類為1 108個OTUs；咸安種群共有71 534條有效tags，聚類為1 065個OTUs；英山種群共有33 824條有效tags，聚類為2 109個OTUs（表2）。

2.2 小貫小綠葉蟬內(nèi)共生細菌種類及其豐度

根據(jù)OTUs的注釋結(jié)果，5個不同地理種群樣本合并后的總樣本共鑒定獲得41個門，116個綱，197個目，272個科，372個屬，105個種；其中赤壁種群鑒定出37個門，101個綱，170個目，243個科，340個屬，91個種；大悟種群鑒定出32個門，100個綱，165個目，237個科，301個屬，81個種；武漢種群鑒定出27個門，86個綱，130個目，183個科，202個屬，45個種；咸安種群鑒定出28個門，84個綱，73個目，167個科，187個屬，48個種；英山種群鑒定出36個門，103個綱，162個目，232個科，281個屬，82個種（表3）。

在門分類水平上（圖1），小貫小綠葉蟬成蟲共生細菌的16S rDNA基因序列共注釋到了酸桿菌門Acidobacteria、放線菌門Actinobacteria、擬桿菌門Bacteroidetes、綠彎菌門Chloroflexi、藍細菌門Cyanobacteria、厚壁菌門Firmicutes、芽單胞菌門Gemmatimonadetes、變形菌門Proteobacteria和疣微菌門 Verrucomicrobia等41個門。5個地理種群樣本共生菌的優(yōu)勢菌門均為變形菌門。但不同樣本共生菌的門的類別及相對豐度有所不同，如排名前5位的門中，赤壁樣本依次為變形菌門（61.7%）（括號中的數(shù)值為相對豐度，下同）、厚壁菌門（11.3%）、放線菌門（7.4%）、擬桿菌門（5.5%）和酸桿菌門（2.4%）；大悟樣本依次為變形菌門（71.8%）、放線菌門（6.6%）、擬桿菌門（5.1%）、厚壁菌門（4.6%）和藍細菌門（3.2%）；武漢樣本依次為變形菌門（84.6%）、藍細菌門（8.3%）、放線菌門（1.9%）、擬桿菌門（1.1%）和厚壁菌門（1.1%）；咸安樣本依次為變形菌門（97.1%）、厚壁菌門（0.9%）、放線菌門（0.4%）、擬桿菌門（0.3%）和酸桿菌門（0.2%）；英山樣本依次為變形菌門（60.6%）、厚壁菌門（14.1%）、擬桿菌門（6.0%）、放線菌門（5.4%）和酸桿菌門（3.1%）。

在綱分類水平上（表4），共注釋了γ變形菌綱Gammaproteobacteria、α變形菌綱Alphaproteobacteria、梭菌綱Clostridia、β變形菌綱Betaproteobacteria、放線菌綱Actinobacteria、芽胞桿菌綱Bacilli、擬桿菌綱Bacteroidia、δ變形菌綱Deltaproteobacteria、黃桿菌綱Flavobacteriia、芽單孢菌綱Gemmatimonadetes、嗜熱油菌綱Thermoleophilia等116個綱。在相對豐度排名前5位的菌綱中，5個樣本共有的為γ變形菌綱和α變形菌綱，屬于優(yōu)勢菌，二者之和在5個樣本中的占比分別為，赤壁53.2%，大悟57.4%，武漢83.3%，咸安96.8%，英山53.9%。

在目分類水平上（表5），5個樣本共注釋到了197個目，其中赤壁樣本的共生細菌主要有海洋螺菌目（24.0%）、梭菌目（9.0%）、放線菌目（5.5%）、根瘤菌目（5.4%）和鞘脂單胞菌目（4.5%）；大悟樣本的共生細菌主要有海洋螺菌目（27.2%）、交替單胞菌目（7.4%）、普羅卡桿菌目（6.0%）、放線菌目（4.7%）、伯克氏菌目（4.6%）；武漢樣本的共生細菌主要有腸桿菌目（69.9%）、假單胞菌目（3.9%）、氣單胞菌目（2.8%）、放線菌目（1.4%）；咸安樣本的共生細菌主要有立克次氏體目（92.7%）、海洋螺菌目（1.6%）、梭菌目（0.6%）、交替單胞菌目（0.5%）、假單胞菌目（0.5%）；英山樣本的共生細菌主要有海洋螺菌目（11.1%）、梭菌目（8.6%）、立克次氏體目（7.6%）、紅細菌目（7.0%）、交替單胞菌目（5.3%）。在相對豐度排名前10位的優(yōu)勢菌目中，5個樣本共有的為海洋螺菌目、放線菌目、根瘤菌目和鞘脂單胞菌目（表5）。

在科分類水平上（表6），共注釋到了272個科，主要有鹽單胞菌科、鞘脂單胞菌科、腸桿菌科、希瓦氏菌科、黃單胞菌科、立克次氏體科、毛螺菌科、假單胞菌科、瘤胃菌科、普羅卡桿菌科、叢毛單胞菌科等。在相對豐度排名前10位的科中，5個樣本共有的為鹽單胞菌科、鞘脂單胞菌科、希瓦氏菌科、腸桿菌科、黃單胞菌科。但不同樣本的共生菌在科的類別和豐度上有所不同，如相對豐度排名前5位的科中，赤壁樣本中豐度最高的為鹽單胞菌科（23.8%），隨后依次為鞘脂單胞菌科（4.1%）、毛螺菌科（4.0%）、希瓦氏菌科（3.2%）和假單胞菌科（2.9%）；大悟樣本中豐度最高的為鹽單胞菌科（27.1%），隨后依次為希瓦氏菌科（7.0%）、普羅卡桿菌科（6.0%）、鞘脂單胞菌科（3.7%）和叢毛單胞菌科（3.1%）；武漢樣本中豐度最高的為腸桿菌科（69.8%），隨后依次為假單胞菌科（3.5%）、氣單胞菌科（2.6%）、鞘脂單胞菌科（1.1%）和鹽單胞菌科（1.0%）；英山樣本中豐度由高到低依次為鹽單胞菌科（10.8%）、紅細菌科（6.9%）、海洋細菌科（6.9%）、毛螺菌科（4.0%）和希瓦氏菌科（3.2%）；而咸安樣本中立克次氏體科相對豐度最高（92.6%），隨后依次為鹽單胞菌科（1.6%）、希瓦氏菌科（0.5%）、假單胞菌科（0.4%）和腸桿菌科（0.4%）。

在屬分類水平上（表7），共注釋到了372個屬。在相對豐度排名前10的菌屬中，5個樣本共有的為鹽單胞菌屬、希瓦氏菌屬、沃爾巴克氏體屬。不同樣本的優(yōu)勢菌屬有所不同，赤壁、大悟和英山樣本的優(yōu)勢屬為鹽單胞菌屬（23.8%、27.1%和8.8%），武漢樣本的優(yōu)勢屬為泛菌屬（61.2%），咸安樣本的優(yōu)勢屬則為沃爾巴克氏體屬（92.6%）。初步分析認為，5個地理種群小貫小綠葉蟬采樣時間都在6月份，寄主植物主要是‘福鼎大白茶樹品種，造成共生菌群落結(jié)構(gòu)差異的原因可能與環(huán)境因素有關(guān)。

2.3 小貫小綠葉蟬成蟲內(nèi)共生細菌多樣性分析

用Alpha Diversity對每個樣本的多樣性進行分析（表8），Chao指數(shù)和Ace指數(shù)反映樣品中菌群的豐富度，Shannon指數(shù)反映菌群的多樣性，Simpson指數(shù)反映菌群中優(yōu)勢種的集中程度。從豐富度指數(shù)看，赤壁樣本最大，Chao指數(shù)、Ace指數(shù)分別為2 841.89和2 914.90；從多樣性指數(shù)看，英山樣本最大，Shannon指數(shù)8.63，其次為赤壁樣本，Shannon指數(shù)7.93；從優(yōu)勢度指數(shù)看，英山樣本最大，Simpson指數(shù)為0.99，咸安樣本的Simpson指數(shù)最小。綜合分析看，英山樣本和赤壁樣本相比其他樣本，具有較高的多樣性指數(shù)、豐富度指數(shù)和優(yōu)勢度指數(shù)，說明這兩個樣本中的細菌種類更豐富多樣。

3 討論

本研究采用16S rDNA V4高變區(qū)的高通量測序技術(shù)，對5個地理種群茶園小貫小綠葉蟬體內(nèi)的細菌多樣性及群落結(jié)構(gòu)組成進行了研究。共注釋鑒定獲得41個門，116個綱，197個目，272個科，372個屬，105個種。

在所鑒定獲得的41個門中，變形菌門的細菌是5個樣本共有的最主要的優(yōu)勢菌（60.6%～97.1%），這與許多昆蟲腸道中的優(yōu)勢菌相同。如直翅目的沙漠蝗Schistocerca gregaria，半翅目的豌豆蚜 Acyrthosiphon pisum，鱗翅目的茶尺蠖Ectropis obliqua、稻縱卷葉螟Cnaphalocrocis medinalis，鞘翅目的天牛Saperda vestita以及雙翅目的地中海實蠅Bactrocera minax和澤蘭實蠅Procecidochares utilis腸道優(yōu)勢菌均為變形菌門細菌[1016]。但是，5個樣本優(yōu)勢菌的組成有所不同，其中咸安樣本的優(yōu)勢菌相對簡單，僅為變形菌門（97.1%）。而另外4個樣本相對復(fù)雜，除了變形菌門以外，赤壁樣本和英山樣本的優(yōu)勢菌還有厚壁菌門、放線菌門、擬桿菌門和酸桿菌門；大悟樣本和武漢樣本的優(yōu)勢菌還包括放線菌門、擬桿菌門、厚壁菌門和藍細菌門。

在屬分類階元，相對豐度排名前10的菌屬中，鹽單胞菌屬（1.0%～27.1%）、希瓦氏菌屬（0.5%～7.0%）和沃爾巴克氏體屬（0.6%～92.6%）的細菌是5個樣本共有的優(yōu)勢菌。不同樣本的優(yōu)勢菌屬差異明顯，赤壁、大悟和英山樣本最主要的優(yōu)勢屬均為鹽單胞菌屬（23.8%、27.1%和8.8%）；武漢樣本的優(yōu)勢屬為泛菌屬（61.2%）；而咸安樣本的優(yōu)勢屬為沃爾巴克氏體屬，占比達92.6%。鹽單胞菌是一類耐鹽細菌，在鹽湖、鹽場、鹽堿地、海冰和海洋極端環(huán)境中常有分布。最近研究發(fā)現(xiàn)，在核桃舉肢蛾Atrijuglans hetaohei和桃蛀螟Dichocrocis punctiferalis幼蟲腸道中都有鹽單胞菌屬存在[17]，但其生物學(xué)功能及對宿主昆蟲的作用尚不清楚。5個地理種群小貫小綠葉蟬共有的優(yōu)勢菌沃爾巴克氏體菌Wolbachia，是一類廣泛分布于節(jié)肢動物體內(nèi)的共生菌，它不僅可以調(diào)節(jié)宿主的生殖活動，包括誘導(dǎo)細胞質(zhì)不親和、孤雌生殖和遺傳上雌性雄性化等，還能改變宿主種群適合度，增強宿主抗逆性，如感染W(wǎng)olbachia增加了黑腹果蠅Drosophila melanogaster和致倦庫蚊 Culex quinquefasciatus 對RNA病毒的抗性[18]。

本研究首次獲得了不同茶園小貫小綠葉蟬地理種群成蟲共生菌的相關(guān)信息，初步明確了不同地理種群共生菌的群落結(jié)構(gòu)和優(yōu)勢菌群，為進一步研究共生菌與小貫小綠葉蟬之間的關(guān)系提供了基礎(chǔ)信息。但這些優(yōu)勢菌群對宿主的生存、繁殖等生物學(xué)特性有哪些影響，還需要進一步深入研究。

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