莫飛旭 喻會(huì)平 龍友華 吳小毛 黎曉茜 李磊

摘 要：為獲得對(duì)煙蚜具有感染作用的蟲(chóng)霉菌，從貴州不同煙區(qū)采集受霉菌感染的煙蚜蟲(chóng)尸標(biāo)本進(jìn)行菌株分離，在室內(nèi)進(jìn)行感染率測(cè)定篩選獲得優(yōu)勢(shì)菌株并通過(guò)rDNA-ITS序列測(cè)定，用菌絲生長(zhǎng)速度法探索適宜蟲(chóng)霉菌生長(zhǎng)的培養(yǎng)基、溫度、光照和pH條件。結(jié)果表明，采集分離獲得16株真菌，其中，感染作用較強(qiáng)的CM-4、CM-11和CM-15，在室內(nèi)施用15 d后，對(duì)煙蚜的感染率分別達(dá)68.07%、69.80%和72.05%；通過(guò)BLAST在線比對(duì)CM-4、CM-11和CM-15 3株蟲(chóng)霉菌分別與金色毛殼菌（Chaetomium aureum）、漸狹蠟蚧菌（Lecdanicillium attenuatum）和少根根霉菌（Rhizopus arrhizus）同源性最高；CM-11和CM-15適宜在培養(yǎng)基E，CM-4適宜在培養(yǎng)基A條件下培養(yǎng)；CM-4和CM-15適宜溫度為25～30 ℃，適宜CM-4和CM-11的光照為半光照半黑暗，pH為6～7。研究表明，金色毛殼菌、漸狹蠟蚧菌和少根根霉菌對(duì)煙蚜具有較強(qiáng)的感染作用，可用于煙蚜的生物防治。

關(guān)鍵詞：煙蚜；蟲(chóng)霉菌；培養(yǎng)條件；生物防治；鑒定

中圖分類號(hào)：S435.72 文章編號(hào)：1007-5119（2018）06-0043-08 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2018.06.007

煙蚜[Myzus persicae （sulzer）]，又名桃蚜，是煙草重要的害蟲(chóng)之一，在世界范圍內(nèi)均有分布。煙蚜通過(guò)刺吸式口器吸取煙葉汁液，影響煙草正常的生理功能和生長(zhǎng)，同時(shí)煙蚜還可排泄蜜露，引起霉菌滋生，污染葉片[1]，此外，煙蚜是病毒的重要傳播媒介，可傳播CMV、PVY等病毒病，煙蚜為害可降低煙葉煙堿含量，減小煙葉面積，嚴(yán)重降低煙葉品質(zhì)，給煙草生產(chǎn)帶來(lái)巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。目前煙蚜的防治主要依賴于化學(xué)藥劑，使用不當(dāng)易引起污染等問(wèn)題，且長(zhǎng)期使用可造成煙蚜生理發(fā)生變異，產(chǎn)生可遺傳的抗藥性[3-4]。生物防治是一種清潔、綠色的防控技術(shù)，煙蚜的生物防治主要通過(guò)使用生物農(nóng)藥、釋放天敵昆蟲(chóng)等手段[5-6]，如利用瓢蟲(chóng)[7]和蚜繭蜂[8]。

蟲(chóng)霉菌是一類能寄生于害蟲(chóng)蟲(chóng)體，導(dǎo)致蟲(chóng)體感染、發(fā)病、死亡的真菌。利用蟲(chóng)霉菌防治害蟲(chóng)是一種綠色、安全的生物防治手段。目前該技術(shù)在多種害蟲(chóng)的防治上已得到廣泛使用，如白僵菌（Beauveria bassiana）防治甘薯象甲、玉米螟和馬尾松毛蟲(chóng)，綠僵菌（Metarhizium）防治金龜子等[9]。而在煙蚜方面，目前有報(bào)道的煙蚜生防蟲(chóng)霉菌包括白僵菌、綠僵菌[10-14]、球毛殼菌（Chaetomium globosum）[15-17]、蠟蚧輪枝菌（Lecanicillium lecanii）[18]、Lecanicillium longisporum[19-20]、弗氏新接霉蚜霉菌[Neozygites fresenii （Nowakowski）][21]、耳霉菌（Conidiobolus major）[22]和青霉菌（Paecilomyces sp.）[23-26]。但目前尚無(wú)一種被廣泛應(yīng)用于煙蚜防控的蟲(chóng)霉菌，限制這一技術(shù)發(fā)展的主要因素包括煙蚜蟲(chóng)霉菌菌種資源較少、致病力弱且培養(yǎng)難度大，此外蟲(chóng)霉菌對(duì)田間環(huán)境條件的適應(yīng)性較差。基于此種情況，本試驗(yàn)從貴州不同煙區(qū)采集、分離和篩選對(duì)煙蚜具有較強(qiáng)致病力的生防優(yōu)勢(shì)蟲(chóng)霉菌，以豐富煙蚜蟲(chóng)霉菌菌種資源，并通過(guò)室內(nèi)培養(yǎng)條件的初篩，為田間適用條件研究奠定基礎(chǔ)。以期為煙蚜蟲(chóng)霉菌的研究與開(kāi)發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地點(diǎn)與材料

1.1.1 試驗(yàn)地點(diǎn) 貴州大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全實(shí)驗(yàn)室，貴州大學(xué)作物保護(hù)研究所。

1.1.2 供試材料 供試煙草：畢納1號(hào)，2015—2016年栽培于貴州大學(xué)作物保護(hù)研究所試驗(yàn)溫棚內(nèi)；供試煙蚜：當(dāng)年培育于畢納1號(hào)煙葉上的健康煙蚜。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 蟲(chóng)霉菌采集與分離 蟲(chóng)霉菌采集：分別從貴州省畢節(jié)、遵義、六盤(pán)水、安順和黔西南煙區(qū)采集受蟲(chóng)霉菌感染的煙蚜，其特征為已死煙蚜的蟲(chóng)尸上長(zhǎng)有菌絲，顏色一般為白色、灰色、黑色和黃色。蟲(chóng)霉菌分離：將受感染的煙蚜粘在含有PDA的培養(yǎng)皿蓋內(nèi)中央，將培養(yǎng)皿置于28 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)7 d，待PDA上長(zhǎng)出菌落后，根據(jù)顏色和長(zhǎng)勢(shì)不同，將菌株進(jìn)行純化培養(yǎng)。

1.2.2 菌懸液制作 將純化后的菌株挑到PDA平板上置于25 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)7 d，用打孔器取0.5 cm菌餅至含有150 mL不加瓊脂的PD液體培養(yǎng)基的三角瓶?jī)?nèi)，將三角瓶置于25 ℃恒溫震蕩箱內(nèi)培養(yǎng)5 d備用。

1.2.3 優(yōu)勢(shì)蟲(chóng)霉菌的篩選 挑30頭大小相似的健康無(wú)翅煙蚜置于15 cm×15 cm的煙葉背面，將煙葉置于培養(yǎng)皿內(nèi)保濕培養(yǎng)。將菌懸液用紗布過(guò)濾掉菌絲后，噴施于煙葉和蚜蟲(chóng)體上，噴至煙葉滴水。每個(gè)處理3次重復(fù)，并設(shè)置CK對(duì)照（噴施無(wú)菌水）。觀察3 d和7 d后煙蚜蟲(chóng)尸是否長(zhǎng)出霉菌來(lái)判斷是否被感染（正常死亡的煙蚜，后期蟲(chóng)尸變黑色干扁，無(wú)霉菌）。從感染的蟲(chóng)尸中按照步驟1.2.1進(jìn)行霉菌分離，確認(rèn)感染前施用的菌株與感染后分離所得的菌株是否一致。

對(duì)具有感染作用的菌株進(jìn)行感染力測(cè)定：在室內(nèi)盆栽煙苗，待5葉時(shí)將30頭大小相似的健康無(wú)翅煙蚜接到煙葉背部，室溫下培育15 d。在將具有感染作用菌株菌懸液用紗布過(guò)濾掉菌絲后，噴施于煙葉和蚜蟲(chóng)體上，噴至煙葉滴水。每個(gè)處理3次重復(fù)，并設(shè)置CK對(duì)照（噴施無(wú)菌水）。調(diào)查7 d、11 d和15 d后煙蚜的感染率。

感染率=感染蟲(chóng)口數(shù)/蟲(chóng)口總數(shù)×100%

1.2.4 蟲(chóng)霉菌的鑒定 采用Biomiga公司的Fungle gDNA Kit提取試劑盒提取DNA，選用ITS4/ITS5引物進(jìn)行ITS基因片段擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，并將獲得的序列在NCBI中BLAST軟件進(jìn)行同源性比對(duì)。

1.2.5 蟲(chóng)霉菌適宜培養(yǎng)基的篩選 用表1中的培養(yǎng)基在28 ℃下對(duì)篩選得出的優(yōu)勢(shì)蟲(chóng)霉菌進(jìn)行培養(yǎng)，每種培養(yǎng)基設(shè)3次重復(fù)，用“十字交叉法”每隔24 h測(cè)量蟲(chóng)霉菌菌落直徑，并計(jì)算菌絲生長(zhǎng)速度。

生長(zhǎng)速度（cm/h）=菌落直徑（cm）/培養(yǎng)時(shí)間（h）

1.2.6 蟲(chóng)霉菌適宜溫度條件的篩選 用PDA培養(yǎng)基在10、15、20、25、30、35 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中對(duì)蟲(chóng)霉菌進(jìn)行培養(yǎng)。每種溫度條件設(shè)3次重復(fù)，并每隔24 h測(cè)量蟲(chóng)霉菌菌落直徑，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)速度。

1.2.7 蟲(chóng)霉菌適宜光照條件的篩選 設(shè)置全光照、全黑暗、12 h光照12 h黑暗的光照條件且溫度為28 ℃恒溫的培養(yǎng)條件，用PDA培養(yǎng)基對(duì)蟲(chóng)霉菌進(jìn)行培養(yǎng)。每種光照條件設(shè)3次重復(fù)，每隔24 h測(cè)量蟲(chóng)霉菌菌落直徑，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)速度。

1.2.8 蟲(chóng)霉菌適宜pH條件的篩選 將蟲(chóng)霉菌置于PDA平板上培養(yǎng)7 d，配制pH值分別3、4、5、6、7、8、9、10的PDA液體培養(yǎng)基各150 mL于三角瓶?jī)?nèi)，將平板上的蟲(chóng)霉菌用打孔器取直徑0.5 cm的菌餅（CK為無(wú)菌PDA小塊），將菌餅分別放入不同pH值的液體培養(yǎng)基中，每個(gè)pH處理設(shè)3次重復(fù)，三角瓶封口后，置于28 ℃恒溫和150 r/min的震蕩箱中培養(yǎng)5 d。5 d后，將三角瓶?jī)?nèi)的菌液用紗布進(jìn)行過(guò)濾，后將裝有濾渣的紗布置于80 ℃的烘箱內(nèi)烘干8 h，取出烘干后帶有濾渣的紗布進(jìn)行稱量，計(jì)算出平均菌株干物質(zhì)重量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2007和Dps 7.05數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncans新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié) 果

2.1 蟲(chóng)霉菌的采集、分離與篩選

2015—2016年間從貴州省畢節(jié)市、遵義市、六盤(pán)水市、安順市和黔西南州煙區(qū)共采集得感染煙蚜標(biāo)本11個(gè)，分離獲得真菌菌株16株，按照采集順序標(biāo)記為CM-1、CM-2、CM-3…CM-16。通過(guò)感染作用測(cè)定發(fā)現(xiàn)（表2），施用菌懸液3 d后僅有CM-4、CM-6、CM-9、CM-11和CM-15具有感染作用，7 d后CM-4、CM-5、CM-6、CM-9、CM-11、CM-14和CM-15等7株菌株對(duì)煙蚜具有感染作用，其他菌株均無(wú)感染作用。

將具有感染作用的7株菌株進(jìn)行感染力測(cè)定。

結(jié)果如表3所示，隨施用時(shí)間的延長(zhǎng)，各菌株處理對(duì)煙蚜的感染率不斷增大。施用菌懸液7 d后，所 有菌株對(duì)煙蚜的感染率均大于15%，其中菌株 CM-11的感染率達(dá)到22.62%。11 d后菌株CM-11 的感染率達(dá)到56.15%，高于其他菌株處理，菌株 CM-15次之，達(dá)52.33%，其次為CM-4為51.34%， 該3株菌株感染率顯著高于其他處理。15 d菌株 CM-15、CM-11和CM-4對(duì)煙蚜的感染率分別達(dá)到 了72.05%、69.80%和68.07%，均顯著高于其他菌 株，且同CK相比差異極顯著。試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株CM-4、CM-11和CM-15為感染力較強(qiáng)，是具有較高生防潛力的優(yōu)勢(shì)蟲(chóng)霉菌。

2.2 優(yōu)勢(shì)蟲(chóng)霉菌的鑒定

蟲(chóng)霉菌CM-4、CM-11和CM-15在PDA平板上的菌落形態(tài)分別如圖1A、圖1B和圖1C所示。CM-4

菌絲體呈金黃色，培養(yǎng)基因菌體產(chǎn)生滲出物而變?yōu)樽霞t色，菌落背面呈暗紫色，如圖1D所示，其孢子呈舟形、紡錘形或卵形，灰褐色，大小為9～12 μm×

5～6.5 μm；CM-11菌絲緊密，呈乳白色，背面呈米黃色（圖1E），經(jīng)過(guò)多種不同條件培養(yǎng)，均未發(fā)現(xiàn)該菌株產(chǎn)孢；CM-15菌絲棉絮狀，褐色，孢子球形、近球形或卵形（圖1F），直徑3.5～6 μm，為無(wú)色或淺灰色。

將序列測(cè)定所獲得的序列與GenBank中已有序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CM-4與金色毛殼菌（Chaetomium aureum）的同源性為100%，CM-11與漸狹蠟蚧菌（Lecdanicillium attenuatum）同源性為99%，CM-15與少根根霉（ Rhizopus arrhizus）同源性為100%。根據(jù)病菌形態(tài)學(xué)鑒定以及該 DNA序列在NCBI進(jìn)行同源性對(duì)比雙重結(jié)果，最終確認(rèn)優(yōu)勢(shì)蟲(chóng)霉菌菌株CM-4為金色毛殼菌，CM-11為漸狹蠟蚧菌，CM-15為少根根霉菌或稱米根霉菌。

2.3 不同培養(yǎng)基對(duì)蟲(chóng)霉菌生長(zhǎng)的影響

由圖2可以看出，菌株CM-15在各個(gè)培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速度明顯高于菌株CM-4和CM-11。不同蟲(chóng)霉菌在不同培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)速度均不相同，其中菌株CM-4在培養(yǎng)基A中的生長(zhǎng)速度顯著高于其他培養(yǎng)基，達(dá)到0.032 9 cm/h；菌株CM-11在培養(yǎng)基E中的生長(zhǎng)速度0.018 1 cm/h，高于其他培養(yǎng)基處理；菌株CM-15適應(yīng)力較強(qiáng)，在所有供試培養(yǎng)基中均保持高速生長(zhǎng)，其中在培養(yǎng)基E中的生長(zhǎng)速度最大，達(dá)0.354 2 cm/h。試驗(yàn)表明，在供試的7種培養(yǎng)基中，菌株CM-15的生長(zhǎng)力較強(qiáng)，而菌株CM-11較弱。適宜CM-4生長(zhǎng)的培養(yǎng)基為培養(yǎng)基A，而適宜CM-11和CM-15生長(zhǎng)培養(yǎng)基為培養(yǎng)基E。

2.4 不同溫度對(duì)蟲(chóng)霉菌生長(zhǎng)的影響

不同溫度條件下蟲(chóng)霉菌的生長(zhǎng)速度如圖3所示，菌株CM-4在10 ℃時(shí)生長(zhǎng)停止，當(dāng)溫度為25 ℃時(shí)

生長(zhǎng)速度達(dá)到最大，達(dá)0.018 2 cm/h；菌株CM-11在10～35 ℃條件下均能生長(zhǎng)，在溫度為25 ℃時(shí)生長(zhǎng)速度達(dá)0.010 6 cm/h，在20 ℃時(shí)達(dá)0.009 6 cm/h，兩者均顯著高于其他溫度處理；菌株CM-15在10～35 ℃條件下生長(zhǎng)速度出現(xiàn)2次峰，第1次出現(xiàn)在15 ℃時(shí)，第2次在30 ℃，該菌株在30 ℃條件下生長(zhǎng)速度達(dá)到最大的0.391 5 cm/h，其次為25 ℃時(shí)的0.298 3 cm/h。結(jié)果表明，蟲(chóng)霉菌菌株CM-4、CM-11和CM-15適宜培養(yǎng)的溫度條件分別為25～30 ℃、20～25 ℃和25～30 ℃。

2.5 不同光照條件對(duì)蟲(chóng)霉菌生長(zhǎng)的影響

如表4所示，不同光照條件下蟲(chóng)霉菌的生長(zhǎng)具有差異。其中，菌株CM-4和CM-11在12 h光照12 h黑暗下生長(zhǎng)速度達(dá)到最大分別為0.020 7 cm/h 和0.009 0 cm/h，但菌株CM-4和CM-11在不同光照條件下的生長(zhǎng)速度差異不顯著，表明CM-4和CM-11的光照條件適應(yīng)能力較強(qiáng)；菌株CM-15在不同光照條件下的生長(zhǎng)速度差異顯著，其在全黑暗條件下生長(zhǎng)速度最大，達(dá)0.281 2 cm/h。由此可見(jiàn)，菌株CM-4和CM-11可適應(yīng)不同光照條件下培養(yǎng)，而菌株CM-15適宜在全黑暗條件下培養(yǎng)。

2.6 不同pH對(duì)蟲(chóng)霉菌生長(zhǎng)的影響

如圖4所示，菌株CM-4和CM-11在pH值為7時(shí)，產(chǎn)生干物質(zhì)分別達(dá)到最大，其次為pH 6時(shí)，且二者均顯著高于其他pH處理，其中CM-11在pH為3時(shí)停止生長(zhǎng)。表明pH 6～7是菌株CM-4和CM-11的適宜培養(yǎng)酸堿條件。CM-15在pH 5時(shí)干物質(zhì)達(dá)到最大，達(dá)0.39 g，其次為6時(shí)的0.37 g，均顯著高于其他pH條件。綜上表明菌株CM-4和CM-11喜好酸堿度為中偏酸的環(huán)境條件；CM-15適宜在偏酸條件下培養(yǎng)。

3 討 論

毛殼菌屬（Chaetomium sp.）真菌中，球毛殼菌（Chaetomium globosum）對(duì)蚜蟲(chóng)等多種害蟲(chóng)具有防控作用[27]，而金色毛殼菌（Chaetomium aureum）此前多報(bào)道用于病害防控，其與辣椒疫霉病、灰霉病和黃瓜灰霉病有拮抗作用[28-30]，而用于煙蚜防治尚無(wú)相關(guān)報(bào)道；KIM等[31]曾從蚜蟲(chóng)蟲(chóng)體中分離獲得漸狹蠟蚧菌（Lecdanicillium attenuatum），并發(fā)現(xiàn)其對(duì)煙蚜、棉蚜等具有寄生致死作用，本試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證該菌株的致病力，此外，漸狹蠟蚧菌還可用于防控柑橘粉虱[32]、茶小綠葉蟬[33]和南方根結(jié)線蟲(chóng)[34]；少根根霉菌（Rhizopus arrhizus）作為醫(yī)學(xué)病原菌，可引起人體多種皮膚病[35]，因此其安全性尚需進(jìn)一步探究。

關(guān)于蟲(chóng)霉菌對(duì)蚜蟲(chóng)的致死機(jī)理，臧建成[36]認(rèn)為暗孢耳霉（C.obscurus）通過(guò)菌絲侵入蚜蟲(chóng)體內(nèi)，利用寄主體內(nèi)營(yíng)養(yǎng)進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖所致；李武高[21]等報(bào)道弗氏新接霉通過(guò)體壁穿透和機(jī)械壓力的方式殺死蚜蟲(chóng)；GURULINGAPPA等[37]發(fā)現(xiàn)蠟蚧輪枝菌（Lecanicillium lecanii）菌絲體能產(chǎn)生對(duì)棉蚜具有毒力作用的乙酸乙酯和甲醇等毒素。GLISZCZYNSK等[38]認(rèn)為將生防菌基因進(jìn)行轉(zhuǎn)化可增強(qiáng)其致病力。本試驗(yàn)尚未對(duì)篩選出的3株致病霉菌進(jìn)行相關(guān)致病因子探索。

生防蟲(chóng)霉菌使用技術(shù)的另一難點(diǎn)在于菌株的田間條件適應(yīng)性能，一般自然條件適應(yīng)力較強(qiáng)的菌株更具有開(kāi)發(fā)利用前景[39-40]。除菌株天然的適應(yīng)力外，還可通過(guò)人工馴化、基因轉(zhuǎn)化[38]或定殖于植物中[41]等措施來(lái)提高菌株適應(yīng)力，本試驗(yàn)對(duì)所獲得的3株蟲(chóng)霉菌進(jìn)行培養(yǎng)條件初篩，可為菌株適應(yīng)力及田間施用條件研究奠定基礎(chǔ)，但要確定培養(yǎng)基、溫度、光照、pH等條件的互作關(guān)系，明確適宜的培養(yǎng)條件，仍需要做進(jìn)一步的互作試驗(yàn)探究。

4 結(jié) 論

試驗(yàn)篩選獲得了金色毛殼菌（Chaetomium aureum）、漸狹蠟蚧菌（Lecdanicillium attenuatum）和少根根霉菌 （Rhizopus arrhizus） 3株對(duì)煙蚜具有較強(qiáng)致病力的生防蟲(chóng)霉菌株，其中金色毛殼菌和少根根霉對(duì)煙蚜的感染作用屬首次報(bào)道，豐富了煙蚜生防菌資源。

通過(guò)初步篩選分別獲得了適宜3株菌株生長(zhǎng)的溫度、pH和光照條件，為該菌株培養(yǎng)保存和田間施用技術(shù)研究奠定基礎(chǔ)。

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