申笑菡　宋小鋒　左燕華　任伊佳　路燈云

[摘 要]為研究資源豐富的藥源植物山楂葉提取物對金黃色葡萄球菌的抑菌活性，用濾紙片法測定三種不同山楂葉提取物對金黃色葡萄球菌的體外抑菌作用，以無菌水為陰性對照，以萬古霉素（30μg）為陽性對照。用2倍稀釋法測定其最低抑菌濃度（MIC）。結(jié)果顯示：劑量相同的山楂葉提取物對供試菌的抑菌效果由強到弱依次排列為：山楂葉乙醇純化提取物>山楂葉乙醇粗提物>山楂葉水粗提物。5mg的山楂葉乙醇純化提取物與30?g的萬古霉素相比對金黃色葡萄球菌的抑菌作用十分相近。山楂葉提取物對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度為0.625mg/mL。

[關(guān)鍵詞]山楂葉；金黃色葡萄球菌；體外抑菌作用；最低抑菌濃度

[中圖分類號]S816.73 [文獻標(biāo)識碼]A

山楂葉是薔薇科植物山里紅（Grataegus pinnatifida Bge.vanr.major N.E.Br.）或山楂（Grataegus pinnatifida Bge.）的干燥葉，夏、秋二季采收，晾干。具有活血化瘀、理氣舒絡(luò)、化濁降脂的功效。山楂葉在我們的生活中極其常見，目前對其研究報道主要集中于有效成分的提取及總黃酮活性研究上。金黃色葡萄球菌聽上去很美，其實是個“美麗殺手”，在全球由金黃色葡萄球菌引起的感染僅次于大腸桿菌?，F(xiàn)階段對金黃色葡萄球菌的耐藥性與金黃色葡萄球菌引起的免疫反應(yīng)研究較為成熟。本實驗初步探究不同山楂葉提取物對金黃色葡萄球菌及耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的體外抑菌功效作用，為該藥食同源品種的深入研究提供數(shù)據(jù)參考和實驗支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

金黃色葡萄球菌ATCC 25923（生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院保存）；耐甲氧西林金黃色葡萄球菌ATCC 43300（鄭州安圖生物工程有限公司惠贈）；萬古霉素細菌藥敏紙片（杭州濱河微生物試劑有限公司）；山楂葉水粗提物含20%總黃酮（生命科學(xué)院自制：山楂葉→水提→過濾→濃縮→干燥）；山楂葉乙醇粗提物含30%總黃酮（生命科學(xué)院自制：山楂葉→醇提→過濾→濃縮→干燥）；山楂葉乙醇純化提取物含90%總黃酮（生命科學(xué)院自制：山楂葉→醇提→過濾→濃縮→大孔樹脂純化→干燥）；MH培養(yǎng)基（杭州天和微生物試劑有限公司）；營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（杭州天和微生物試劑有限公司）；無水乙醇；生理鹽水等均為分析純試劑。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種的活化及菌懸液的制備

按無菌操作法，將斜面保存的金黃色葡萄球菌及耐甲氧西林金黃色葡萄球菌接種在相應(yīng)的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上復(fù)蘇（37℃條件下培養(yǎng)24 h），用無菌生理鹽水配制成與0.5麥?zhǔn)媳葷峁軡岫认嗤臐舛葹?.5×108CFU/mL的菌懸液。

1.2.2 山楂葉提取物紙片制備

用打孔器打出內(nèi)孔直徑為6mm的濾紙片后高壓滅菌，無菌條件下取100mg/mL的山楂葉提取物溶液50μL滴加濾紙片上并晾干。

1.2.3 不同山楂葉提取物抑菌功效研究

將活化后所制的菌懸液均勻涂布于MH培養(yǎng)基，利用濾紙片法測定山楂葉提取物的抑菌效果，每平皿貼5張濾紙片，山楂葉水粗提物紙片、山楂葉乙醇粗提物紙片、山楂葉乙醇純化提取物紙片，無菌水紙片作為陰性對照，萬古霉素紙片作為陽性對照。放入37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，每組實驗三個重復(fù)。

1.2.4 山楂葉提取物最低抑菌濃度（MIC）的測定

根據(jù)CLSI（美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會，2016），使用2倍稀釋法確定山楂葉提取物最低抑菌濃度。用2倍稀釋法將質(zhì)量濃度100mg/mL的山楂葉乙醇純化提取液稀釋至100～0.781mg/mL，8個濃度梯度，吸取各個濃度梯度的山楂葉總黃酮溶液2mL，與約18mL的無菌培養(yǎng)基（小于45℃）充分混勻，冷卻制成含樣液的平板，并進行編號，吸取金黃色葡萄球菌菌懸液50μL采用涂布法涂平板。同時以20mL不含山楂葉提取物的MH培養(yǎng)基作為陰性生長對照，吸取金黃色葡萄球菌菌懸液50μL均勻涂布于平板。37℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，觀察接種平板有無菌落生長，細菌不生長的最高稀釋度為該山楂葉提取物的MIC。

2 結(jié)果與分析

2.1 山楂葉提取物對S.aureus金葡和MRSA的抑菌作用

實驗結(jié)果通過抑菌圈直徑的大小表現(xiàn)山楂葉提取物的抑菌強度。由表1可得：劑量相同的山楂葉提取物對供試菌的抑菌效果由強到弱依次排列為：山楂葉乙醇純化提取物>山楂葉乙醇粗提物>山楂葉水粗提物。隨著山楂葉提取物總黃酮含量的增多相應(yīng)抑菌活性也有所升高。由表1及圖1、圖2可以看出5mg的山楂葉乙醇純化提取物與30μg的萬古霉素抑菌作用相當(dāng)。但山楂葉水粗提物，山楂葉乙醇粗提物與萬古霉素相比抑菌強度顯著較弱。由此可知，山楂葉乙醇純化提取物對金黃色葡萄球菌，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌有較好的抑菌效果。

2.2 山楂葉提取物MIC測定

根據(jù)表1的抑菌實驗結(jié)果，選擇對供試菌抑制效果明顯的山楂葉乙醇純化提取物作為供試樣液進行MIC測定。由表2可知，在濃度為0.313mg/mL的MH培養(yǎng)基上培養(yǎng)能生長出金黃色葡萄球菌單菌落，而在含濃度為0.625mg/mL及以上時培養(yǎng)無菌落出現(xiàn)，故可知山楂葉提取物對金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度為0.625mg/mL。

3 結(jié)論

依據(jù)山楂葉提取物的生物活性，可將其投入到醫(yī)藥、化妝品和功能性食品的應(yīng)用中，也可以提高產(chǎn)品附加值和進一步推廣山楂葉提取物新產(chǎn)品的應(yīng)用。加速推動山楂葉的資源化利用，打破長期以來出口山楂葉原料或粗提物的局面，變廢為寶。本實驗采用紙片擴散法對金黃色葡萄球菌及耐甲氧西林金黃色葡萄球菌進行體外抑菌實驗，以抑菌圈直徑作為評價指標(biāo)，探索山楂葉提取物對供試菌種的抑菌效果。結(jié)果表明，金黃色葡萄球菌對山楂葉提取物較為敏感，5mg的山楂葉乙醇純化提取物與30μg的萬古霉素抑菌作用相當(dāng)。山楂葉提取物對金黃色葡萄球菌的MIC值為0.625mg/mL。將山楂葉提取物作為生物活性原料時，既可以起到相應(yīng)的降壓、降血脂、軟化血管、增加冠狀動脈流量等藥理作用，又可兼具抑菌的作用。現(xiàn)階段由于抗生素的濫用，耐藥菌株不斷增加，出現(xiàn)逐年上升的趨勢，中藥抑菌成分較多，可作用于細菌的不同部位和繁殖的不同階段，使病原微生物不易產(chǎn)生耐藥性，因此，中醫(yī)藥預(yù)防和治療感染性疾病近年來受到越來越多的關(guān)注，從天然植物中提取抗菌成分開發(fā)新型抗菌藥會成為一個研究熱點，有很好的發(fā)展前景。

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