郁樺 王青 常萍 席丹瑩 賀陽(yáng) 靳若寧 甘露 王玉瑩 程光宇

摘要 [目的]研究牛初乳凍干粉（LBC）及其產(chǎn)品中胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGFs）和神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）含量變化。[方法]采用冷凍干燥工藝制備泌乳1～7 d的LBC和常乳凍干粉（LM），用酶聯(lián)免疫分析法測(cè)定IGFs和NGF含量。[結(jié)果]泌乳第1天的LBC中IGF-Ⅰ、Ⅱ和NGF含量最高，分別為3 277.1、2 179.5和31.5 ng/g，并隨泌乳期逐漸下降，至第7天時(shí)接近LM水平。泌乳第1～3天的IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ平均含量分別為2 874.5和1 704.7 ng/g，均是LM中的8.1倍。泌乳第1～3天的NGF平均含量是24.8 ng/g，是LM的20.7倍。3種牛初乳保健食品中IGF-Ⅱ和NGF含量分別為539.9～1 064.3和7.6～12.0 ng/g，均顯著高于LM和2種市售奶粉。牛初乳產(chǎn)品1號(hào)中游離IGF-Ⅰ含量是LM中的7.1倍，它占總IGF-Ⅰ的85.8%。[結(jié)論] IGFs和NGF含量在泌乳第1～7天的LBC中呈下降趨勢(shì)，至第7天時(shí)接近LM水平；泌乳第1～3 天的LBC中IGFs含量達(dá)到μg/g級(jí)水平。牛初乳保健食品較常乳凍干粉和奶粉含有更多的IGFs和NGF。

關(guān)鍵詞 牛初乳凍干粉；牛初乳產(chǎn)品；類胰島素生長(zhǎng)因子；神經(jīng)生長(zhǎng)因子；酶聯(lián)免疫分析法

中圖分類號(hào) TS207.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2018）13-0174-03

Determination and Changes of Insulinlike Growth Factors and Nerve Growth Factor in Lyophilized Bovine Colostrums and Bovine Colostrums Products

YU Hua1，WANG Qing1，CHANG Ping2 et al （1.Jiangsu TMG nature Biological Engineering Co.，Ltd.，Nanjing，Jiangsu 210046； 2.Nanjing Normal University Zhongbei College，Nanjing，Jiangsu 210023）

Abstract [Objective] The changes of contents of insulinlike growth factors （IGFs） and nerve growth factor （NGF） in lyophilized bovine colostrums （LBC） and their contents in bovine colostrums products were studied.[ Method ] Bovine colostrums from the first day to seventh day postpartum and milk were prepared into LBC and lyophilized milk （LM） by the freezedrying technology，the contents of IGFs，NGF were analysed by enzymelinked immunoassay.[ Rusult ]The highest concentration of IGFⅠ（3 277.1 ng/g），IGFⅡ（2 179.5 ng/g） and NGF（31.5 ng/g） were found in the first day LBC.Their concentration rapidly decreased in 1-7 days LBC and close to LM level in 7 days.The IGFⅠ and IGFⅡ average concentrations of 1-3 days LBC were 2 874.5 ng/g and 1 704.7 ng/g，and its contents were 8.1 times of LM.The NGF average concentration of 1-3 days LBC was 24.8 ng/g，and was 20.7 times of LM.The IGFⅡ and NGF contents of three bovine colostrums healthcare food were 539.9～1 064.3 ng/g and 7.6～12.0 ng/g，respectively，and were significantly higher than LM and two market milk powder.The concentration of free IGFI in No.1 bovine colostrum products was 7.1 times of LM，and it accounted for 85.8% of total IGFⅠ.[ Conclusion] The IGFs and NGF concentrations appeared a rapidly decreasing trend in LBC of 1-7 days postpartum and their concentrations close to LM level in LBC of 7 day postpartum.The higher IGFs levels were found in 1-3 days LBC and reached μg/g level.Bovine colostrum health foods contain higher IGFs and NGF levels than that of LM and milk powder.

Key words Lyophilized bovine colostrums；Bovine colostrums products；Insulinlike growth factors；Nerve growth factor；Enzymelinked immunoassay

牛初乳是指奶牛分娩后7 d 內(nèi)所分泌的乳汁，它不僅含有人體必需的蛋白質(zhì)、氨基酸、維生素和礦物質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外，還含有大量調(diào)節(jié)人體生理機(jī)能的生物活性物質(zhì)，如免疫因子、生長(zhǎng)因子等，它具備免疫調(diào)節(jié)[1]、預(yù)防肝損傷[2]、改善睡眠[3]、抗衰老[4]、促進(jìn)小鼠神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育[5]、降血糖[6]等多項(xiàng)保健功能。最近的研究還表明，牛初乳對(duì)腦出血大鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用[7]，牛初乳制備物能誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞增殖，阻礙嚙齒動(dòng)物 Ⅰ 型糖尿病的發(fā)展[8]，牛初乳還能緩解輪狀病毒引起的小鼠腹瀉癥狀[9]，在腸道炎癥和感染的體外模型中具有消炎和抗菌活性[10]。牛初乳具有的這些生理功能與它所含的多種生長(zhǎng)因子密切相關(guān)，它是除人初乳外唯一富含生長(zhǎng)因子和免疫因子的天然食物[11]。2000年，牛初乳被美國(guó)食品科技協(xié)會(huì)（IEF）列為21世紀(jì)最佳發(fā)展前景的非草藥類天然健康食品，現(xiàn)已成為新一代功能性食品資源庫(kù)[12]。目前對(duì)牛初乳中一些生長(zhǎng)因子的研究主要集中在胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅰ IGF-Ⅰ，對(duì)于胰島素樣生長(zhǎng)因子-Ⅱ IGF-Ⅱ和神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF）鮮有報(bào)道[13-14]，所用研究樣品都是液態(tài)初乳，對(duì)牛初乳加工成制劑或產(chǎn)品后的生長(zhǎng)因子的含量和動(dòng)態(tài)變化鮮見(jiàn)報(bào)道。筆者采用冷凍干燥技術(shù)制備1～7 d的牛初乳凍干粉，探討牛初乳凍干粉中胰島素樣生長(zhǎng)因子（IGFs）和NGF含量變化規(guī)律，并比較幾種牛初乳產(chǎn)品中IGFs和NGF含量，旨在為牛初乳產(chǎn)品的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供理論和試驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

采集3頭奶牛分娩后1～7 d的牛初乳各500 mL冷藏備用。牛常乳為市售純牛奶（100%純牛奶，南京衛(wèi)崗乳業(yè)有限公司）。牛初乳產(chǎn)品為國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理局批準(zhǔn)的保健食品，牛初乳保健食品1號(hào)（簡(jiǎn)稱產(chǎn)品1號(hào)，生產(chǎn)批號(hào)20160811，免疫球蛋白含量≥20%）由江蘇天美健大自然生物工程有限公司提供；牛初乳保健食品2號(hào)和3號(hào)（簡(jiǎn)稱產(chǎn)品2號(hào)和產(chǎn)品3號(hào)，生產(chǎn)批號(hào)分別為20160714和20160916，免疫球蛋白含量為17%左右）為2種市售牛初乳保健食品。脫脂和全脂奶粉為內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)。 IGF- I、IGF-Ⅱ及NGF的 ELISA試劑盒購(gòu)于南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器 GT1型冷凍干燥機(jī)（德國(guó)SRK系統(tǒng)技術(shù)有限公司）；Optimax PN-100 智能型超速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Beckman coulter）；Z36HK型高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)Herml）；EV300型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo fisher）；RT-6000型酶標(biāo)分析儀（深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司）；DK-8D電熱恒溫水浴箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 牛初乳凍干粉（LBC）和常乳凍干粉（LM）的制備。牛初乳和常乳經(jīng)4 000 r/min冷凍離心30 min脫脂，脫脂乳于-80 ℃冰箱凍結(jié)后，移至冷凍干燥機(jī)內(nèi)，在高真空度下進(jìn)行冷凍干燥，加工成LBC和LM，分裝后于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ樣品制備與含量測(cè)定。將試驗(yàn)樣品用生理鹽水配制成150 mg/mL溶液，用玻璃勻漿器勻漿，于12 000 r/min 離心20 min （4 ℃），取上清液調(diào)pH至4.6，攪拌30 min，離心除酪蛋白得乳清。將乳清pH調(diào)至6.4左右，10 000 r/min 離心15 min，取部分上清液分別測(cè)定游離IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ，剩余上清液按云振宇[15]方法測(cè)定總IGF-Ⅰ。結(jié)合態(tài)IGF-Ⅰ=總IGF-Ⅰ- 游離態(tài)IGF-Ⅰ。IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ測(cè)定采用ELISA法，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3.3 NGF樣品制備與含量測(cè)定。將試驗(yàn)樣品用預(yù)冷生理鹽水配制成150 mg/mL溶液，用玻璃勻漿器于冰浴中勻漿，于25 000 r/min 冷凍離心60 min[16]，取上清液立即用于NGF含量測(cè)定。NGF測(cè)定采用ELISA法，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.4 數(shù)據(jù)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采集后用SPSS10.0軟件分析，用方差分析法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同泌乳時(shí)間的牛初乳凍干粉中IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ和NGF含量動(dòng)態(tài)變化

由圖1可知，在泌乳第1～2 天的LBC中IGF-Ⅰ含量較高，隨后快速下降，在泌乳第5～7天時(shí)下降趨于平穩(wěn)，與Shinnichi等[17]、劉海燕等[18]報(bào)道的牛初乳中IGF-Ⅰ含量動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)一致。IGF-Ⅱ和NGF含量在1～7 d泌乳期內(nèi)都呈下降趨勢(shì)，在泌乳第1天的LBC中它們含量最高，隨后在第2～4天快速下降，至第5～7天下降趨于平穩(wěn)。加工后的LBC與液態(tài)牛初乳中IGF-Ⅰ 含量呈現(xiàn)相似的動(dòng)態(tài)變化趨勢(shì)，說(shuō)明冷凍干燥加工過(guò)程對(duì)這些生長(zhǎng)因子含量未產(chǎn)生明顯影響。

2.2 牛初乳凍干粉和常乳凍干粉中IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ和NGF含量比較

由表1可知，LBC中IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ和NGF含量在泌乳第1天最高，分別是LM的9.2、10.3和262倍，LBC中IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ平均含量在泌乳第1～3天分別為2 874.5和1 704.7 ng/g，均為L(zhǎng)M中的8.1倍，其中，泌乳第1天的IGF-Ⅰ含量為3 277.1 ng/g（3.3 μg/g），與Elfstrand 等[19]報(bào)道的凍干初乳濃縮粉含量（5.0 μg/g）接近。泌乳第1～3 天的NGF平均含量是24.8 ng/g，是LM中的20.7倍。泌乳第1～7 天的LBC中IGF-Ⅰ、泌乳第1～6天的LBC中IGF-Ⅱ和NGF含量都顯著高于LM中（P<005）。可見(jiàn)，LBC中的IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ和NGF含量遠(yuǎn)高于LM中，特別是在泌乳3 d 以內(nèi)的LBC中含量更高。

2.3 牛初乳產(chǎn)品及乳制品中IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ和NGF含量比較

幾種牛初乳保健食品及乳制品的IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ和NGF含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2、3。與LM相比，產(chǎn)品1號(hào)的總IGF-Ⅰ 和游離態(tài)IGF-Ⅰ含量均極顯著高于LM（P<0.01）。產(chǎn)品1號(hào)的游離態(tài)IGF-Ⅰ含量是LM中的7.1倍，它占總IGF-Ⅰ的85.8%，LM中結(jié)合態(tài)IGF-Ⅰ占總IGF-Ⅰ的60.4%。3種牛初乳保健食品的IGF-Ⅱ和NGF含量顯著高于LM和2種市售奶粉（P<0.05），其中，產(chǎn)品1號(hào)的IGF-Ⅱ和NGF含量顯著高于產(chǎn)品2號(hào)和產(chǎn)品3號(hào)（P<0.05）。牛初乳產(chǎn)品，特別是產(chǎn)品1號(hào)中含有較高的IGF-Ⅱ和NGF含量。

3 結(jié)論

筆者研究了泌乳第1～7天的LBC中IGFs和NGF含量動(dòng)態(tài)變化，并測(cè)定了幾種牛初乳保健食品中IGFs和NGF含量。在泌乳第1天的LBC中IGFs和NGF含量最高，在第1～7天的LBC中它們含量呈下降趨勢(shì)，第7天時(shí)它們含量已經(jīng)接近LM水平。泌乳第1～3天的LBC中IGFs含量達(dá)μg/g級(jí)水平，泌乳第1～3天的LBC中NGF平均含量是248 ng/g，可見(jiàn)，泌乳3 d 以內(nèi)的LBC中IGFs和NGF含量遠(yuǎn)高于LM水平，具有很好的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。3種市售牛初乳 保健食品IGF-Ⅱ和NGF含量顯著高于LM和2種市售奶粉，其中，產(chǎn)品1號(hào)的IGF-Ⅱ和NGF含量高于產(chǎn)品2號(hào)和產(chǎn)品3號(hào)，產(chǎn)品1號(hào)的IGF-Ⅰ以游離態(tài)為主，占總IGF-Ⅰ的85.8%。

目前對(duì)牛初乳生長(zhǎng)因子的研究報(bào)道都是液態(tài)牛初乳，筆者將其制備成LBC，對(duì)其IGFs和NGF含量變化規(guī)律進(jìn)行研究，可為牛初乳類產(chǎn)品的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

安徽農(nóng)業(yè)科學(xué) 2018年

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