董薇

摘要 綜述了DNA條碼、分子標(biāo)記、液相色譜技術(shù)等分子生物技術(shù)在金銀花中的應(yīng)用，并簡(jiǎn)述了金銀花組培快繁技術(shù)、金銀花功能基因克隆情況，為更深入地開展金銀花研究奠定理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞 金銀花；組培快繁技術(shù)；分子生物技術(shù)；基因克隆

中圖分類號(hào) S567.7+9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2018）02-0015-04

Abstract The application of molecular biology techniques such as DNA barcodes，molecular markers and liquid chromatography techniques in Lonicera japonica was reviewed.The rapid propagation of Lonicera japonica tissue culture and the cloning of functional genes of Lonicera japonica were briefly described，which lays a theoretical foundation for the further study of Lonicera japonica.

Key words Lonicera japonica；Rapid propagation technology of tissue culture； Molecular biology technology；Gene cloning

金銀花（Lonicera japonica）為忍冬科忍冬屬多年生半常綠藤本植物[1]。金銀花的干燥花蕾或初開的花，具有清熱解毒、涼散風(fēng)熱的功效，為常用的大宗中藥材。中國各省均有分布，種植區(qū)域主要集中在山東、陜西、河南、河北、湖北、江西、廣東等地。分子生物手段在金銀花中的應(yīng)用雖然較晚，但已經(jīng)在金銀花快繁、金銀花鑒定等方面取得了顯著成果。為今后更深入地開展金銀花研究，筆者對(duì)分子技術(shù)在金銀花研究中取得的進(jìn)展進(jìn)行了綜述。

1 金銀花組培快繁技術(shù)

脫毒和離體快繁是植物組織培養(yǎng)應(yīng)用最多、最廣泛和最有效的一個(gè)方面。脫毒苗具有無雜菌、適應(yīng)能力較強(qiáng)、繁育較快、質(zhì)量?jī)?yōu)、抗性好等優(yōu)點(diǎn)。近年來，金銀花脫毒快繁、工廠化育苗有很大的發(fā)展。金銀花不同部位的外植體在金銀花組培快繁中均有應(yīng)用，但誘導(dǎo)率不同，幼葉最易誘導(dǎo)愈傷組織[2]，易滅菌且萌發(fā)力強(qiáng)的當(dāng)年嫩枝也可以成功誘導(dǎo)[3-5]，外植體木質(zhì)化和半木質(zhì)化莖段以4～6 mm為宜，未木質(zhì)化和頂芽莖段的大小以操作方便為宜[6]，頂芽通過誘導(dǎo)生芽、增殖培養(yǎng)、誘導(dǎo)生根，也可以得到金銀花幼苗[7-8]。

誘導(dǎo)增殖培養(yǎng)基一般是以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加激素種類有6-BA、2，4-D、NAA、IBA、IAA、KT等，誘導(dǎo)幼葉愈傷使用MS+2，4-D 2.0 mg/L+KT 0.5 mg/L[2]，誘導(dǎo)頂芽外植體愈傷組織選擇最優(yōu)培養(yǎng)基配方為MS+1.0 mg/L 6-BA+0.02 mg/L NAA[3]。楊冬業(yè)等[5]使用MS+6-BA 2.0 mg/L+IBA 0.01～0.05 mg/L進(jìn)行不定芽的誘導(dǎo)，誘導(dǎo)率為100%；MS+6-BA 1.0 mg/L+IBA 0.01～0.05 mg/L 適合繼代壯苗培養(yǎng)；1/2 MS+IBA 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L 適合金銀花的生根誘導(dǎo)培養(yǎng)。王文靜等[7]研究發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)紅金銀花頂芽生芽培養(yǎng)基為MS+KT 1.0 mg/L+6-BA 2.0 mg/L+α-NAA 0.1 mg/L，增殖培養(yǎng)基為MS+KT 1.5 mg/L+6-BA 1.5 mg/L+α-NAA 0.3 mg/L，生根培養(yǎng)基為1/2 MS+α-NAA 2.0 mg/L + IAA 0.15～0.20 mg/L。劉敏杰[8]分析得出，以金銀花的芽尖誘導(dǎo)叢生芽培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L，增殖培養(yǎng)為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L，生根培養(yǎng)基為1/2MS+IBA 3.0 mg/L+0.15%活性炭培養(yǎng)基。趙先海等[4]研究表明，適合誘導(dǎo)的培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.5 mg/L +NAA 0.1 mg/L；較好的增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L，芽健壯整齊，增殖系數(shù)可達(dá)4.5左右；較好的生根培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0.2 mg/L+IBA 0.4 mg/L，生根率達(dá)90%以上。任斌[9]以金銀花試管苗帶腋芽莖段為外植體，研究指出金銀花經(jīng)腋芽擴(kuò)繁的最佳培養(yǎng)基為B5+NAA 0.05 mg/L+BA 2.0 mg/L+GA 31.0 mg/L，繁殖系數(shù)達(dá)4.1；另外研究萘乙酸（NAA）、吲哚丁酸（IBA）和多效唑（MET）對(duì)組培苗生根的影響，不同濃度的激素配比對(duì)組培苗根系指標(biāo)影響不同，結(jié)果表明，生根率、主根數(shù)、須根數(shù)為統(tǒng)計(jì)指標(biāo)最佳培養(yǎng)基配比中激素濃度差別很大[10]。

金銀花的組織培養(yǎng)中，防止組織褐變是培養(yǎng)成功的關(guān)鍵技術(shù)之一。王鵬等[6]研究表明，0.1% Vc和0.3%活性炭在紅金銀花的組織培養(yǎng)中可有效地防止外植體組織褐化；2 mg/L 6-BA 易引發(fā)褐變，2 mg/L KT 和2 mg/L α-NAA 對(duì)組織褐變影響與對(duì)照相比差異不大；采用仿自然氣候（20 ℃-1 500 lx-4 h-85%→25 ℃-2 000 lx-8 h-85%→20 ℃-1 500 lx-4 h-85%→18 ℃-0 lx-8 h-85%）培養(yǎng)可有效抑制褐變的發(fā)生。

2 分子生物技術(shù)在金銀花鑒定中的應(yīng)用

2.1 DNA條碼在金銀花鑒定中的應(yīng)用

DNA分子鑒定技術(shù)用于物種鑒定具有準(zhǔn)確可靠、重復(fù)性高等優(yōu)點(diǎn)。以ITS2為主體的中藥材DNA條形碼鑒定新方法體系和數(shù)據(jù)庫平臺(tái)已獲準(zhǔn)納入《中華人民共和國藥典》。宋雯舒等[11]提取金銀花、山銀花對(duì)照藥材及河北和山東產(chǎn)地金銀花樣品DNA，檢測(cè)DNA濃度和純度，采用基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）方法的DNA分子標(biāo)記技術(shù)鑒別樣品。崔志偉等[12]研究ITS2和psb A-trn H作為鑒定金銀花不同品種的優(yōu)勢(shì)條形碼組合，不同品種金銀花ITS2和psb A-trn H序列的擴(kuò)增成功率為100%，測(cè)序成功率分別為72.7%、91.0%，且兩者均存在較多的變異位點(diǎn)。胡凱等[13]探討B(tài)ar-HRM聯(lián)用技術(shù)在金銀花及山銀花藥材鑒別中的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)利用psb A -trn H 序列設(shè)計(jì)引物，HRM 曲線能夠區(qū)分不同的金銀花和山銀花藥材品種，Bar-HRM能在金銀花類藥材混合物中檢測(cè)出低至5%的山銀花樣品，說明Bar-HRM在金銀花及山銀花藥材品種的分類、鑒別上具有可靠的分辨能力，適用于金銀花及山銀藥材摻混的快速鑒定，能夠?qū)崿F(xiàn)一管式閉合分析。

2.2 分子標(biāo)記在金銀花鑒定中的應(yīng)用

利用簡(jiǎn)單有效的方法鑒定藥用植物種及其變種一直是中藥材鑒定首先要解決的問題。EST-SSR多態(tài)位點(diǎn)多，信息量大，遺傳變異信息豐富，并且檢測(cè)快速、穩(wěn)定，常用來鑒定藥材品種。蔣超等[14]通過生物信息學(xué)手段對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的忍冬及其變種紅白忍冬（L.japonica var. chinensis Thunb.）EST序列進(jìn)行分析，共獲得3 705條忍冬EST-SSRs，2 818條紅白忍冬 EST-SSRs；分析結(jié)果表明，金銀花及其變種紅白忍冬主要SSR重復(fù)為二核苷酸，其次為三核苷酸，主要重復(fù)基序類型為AG/TC和GAG/TCT；通過同源比對(duì)，在忍冬及其變種中共篩選出87對(duì)重復(fù)次數(shù)具有差異的EST-SSR；選出15對(duì)堿基數(shù)差異大于6的EST-SSR進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明其中的13對(duì)引物在52份金銀花類藥用植物中具有有效擴(kuò)增產(chǎn)物，且引物Jp.ssr4、Jp.ssr64及Jp.ssr65可用于忍冬及其變種、山銀花原植物的鑒別。徐石勇等[15]以金銀花及其常見變種為材料，利用SSR標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建分子指紋圖譜，并用于遺傳多樣性分析；選擇25個(gè)SSR位點(diǎn)用于多態(tài)性分析，其中3個(gè)位點(diǎn)具有較強(qiáng)多態(tài)性，并構(gòu)建基于Excel格式的金銀花SSR指紋圖譜，包括3對(duì)引物在6個(gè)供試材料中擴(kuò)增到的18條多態(tài)性條帶信息；應(yīng)用該指紋圖譜對(duì)金銀花及其變種的遺傳多樣性進(jìn)行分析，結(jié)果表明，金銀花與山銀花之間遺傳距離較遠(yuǎn)，僅0.28；應(yīng)用該指紋圖譜對(duì)87個(gè)市售金銀花進(jìn)行分析，能夠區(qū)分出河北、山東、河南等地的金銀花品種。

ISSR分子標(biāo)記能夠靈敏地揭示2個(gè)親緣關(guān)系十分相近個(gè)體之間的差異，可以應(yīng)用于金銀花樣品間遺傳多樣性分析，分析金銀花種內(nèi)不同地域或不同植物來源的材料間存在的遺傳差異，為金銀花的種質(zhì)資源鑒定、遺傳關(guān)系分析及栽培育種提供分子生物學(xué)依據(jù)。王湘瑩等[16]采用ISSR標(biāo)記技術(shù)從100個(gè)引物中篩選出10個(gè)重復(fù)性高、擴(kuò)增效果好的引物，對(duì)23個(gè)金銀花品種的樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，23個(gè)金銀花品種間的遺傳相似系數(shù)為0.471 3～0.100 0，平均遺傳相似數(shù)為0.629 9，平均基因多樣度（He）和Shannon多樣性指數(shù)分別是0.379 3和0.556 3，表明品種間的遺傳基礎(chǔ)較寬及遺傳多樣性較高；聚類分析（UPGMA）表明，23個(gè)供試金銀花品種劃分為忍冬、美國忍冬、灰氈毛忍冬3大類。韓琳娜等[17]應(yīng)用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)三大道地產(chǎn)區(qū)的27個(gè)金銀花原植物種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多態(tài)性、相似性和聚類分析，篩選出16個(gè)多態(tài)性引物，獲得344條帶，多態(tài)性比率為88.4%；遺傳相似系數(shù)為0.50～0.90；聚類分析表明，27個(gè)品種被分為2個(gè)類群。孫稚穎等[18]對(duì)采自金銀花主產(chǎn)區(qū)的18農(nóng)家品種及野生忍冬和近緣種灰氈毛忍冬共計(jì)36個(gè)樣品進(jìn)行ISSR-PCR分析，采用NTSYS-pc軟件計(jì)算金銀花不同農(nóng)家品種及近緣種間的Jaccard遺傳相似系數(shù)，按非加權(quán)配對(duì)算術(shù)平均法（UPGMA）建立所研究類群的系統(tǒng)聚類圖；使用12條引物共擴(kuò)增出129個(gè)條帶，其中多態(tài)帶為114條，占總擴(kuò)增條帶數(shù)的88.37%；從聚類分析圖可以看出，金銀花不同樣本首先聚在一起，表明是一自然類群；野生忍冬與栽培品種具有明顯的遺傳差異；主產(chǎn)區(qū)傳統(tǒng)品系毛花系列遺傳相對(duì)較穩(wěn)定，而雞爪花系列品種繁雜，遺傳變異大；新品種九豐一號(hào)已獨(dú)立成一穩(wěn)定品種。

RAPD分子標(biāo)記已經(jīng)在作物品種或種子純度鑒定方面廣泛應(yīng)用，這種檢測(cè)方法簡(jiǎn)便快速，但是存在條帶穩(wěn)定性差、飾演重復(fù)性低等問題[19-22]。為了保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性，可以采取保證反應(yīng)條件一致，多次重復(fù)每個(gè)引物，放棄重復(fù)性低的模糊條帶，統(tǒng)計(jì)穩(wěn)定出現(xiàn)、重復(fù)性高的條帶并進(jìn)行遺傳分析。王一斐等[19]利用RAPD分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)膠東地區(qū)31個(gè)金銀花品種的遺傳多樣性及遺傳關(guān)系進(jìn)行研究，聚類分析結(jié)果表明，31個(gè)金銀花品種可以分為兩大類：采自昆崳山太白頂?shù)慕疸y花品種為一類，其余30個(gè)金銀花品種為一類；從遺傳距離來看，采自昆崳山太白頂?shù)钠贩N與中醫(yī)世家引進(jìn)金銀花品種大毛花遺傳距離最遠(yuǎn)，為2.507；采自龍口蘭高鎮(zhèn)馬藺塂（Ⅱ）與中醫(yī)世家引進(jìn)金銀花品種四季豐遺傳距離最近，為0.020；不同金銀花種源間具有較高的遺傳多樣性，不同金銀花種源間的遺傳關(guān)系與地理分布有一定的相關(guān)性。

2.3 液相色譜技術(shù)在金銀花鑒定中的應(yīng)用

高效液相色譜（HPLC）法具有分離效率高、速度快、靈敏度高、穩(wěn)定性和可重復(fù)性好、流動(dòng)相選擇性廣、檢測(cè)器種類多、色譜柱可反復(fù)使用等特點(diǎn)，現(xiàn)已成為研究中藥指紋圖譜的重要手段之一。趙君峰等[23-24]采用HPLC法測(cè)定10個(gè)不同商品來源的金銀花樣品，建立川渝地區(qū)金銀花藥材甲醇溶解部分的HPLC指紋圖譜；色譜條件為C18柱，甲醇-1%磷酸為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)237 nm，體積流量1.0 mL/min，柱溫30 ℃；該方法能夠很好地分離川渝地區(qū)金銀花的主要成分；不同產(chǎn)地金銀花藥材指紋圖譜相似度較好，建立了含有11個(gè)特征指紋峰的川渝地區(qū)金銀花標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。楊欣欣等[25]采用指紋圖譜技術(shù)對(duì)不同產(chǎn)地金銀花藥材進(jìn)行分析比較，采用Agilent TC-C18色譜柱，流動(dòng)相為0.5%冰醋酸水溶液（A）-乙腈（B）梯度洗脫，波長(zhǎng)為327 nm，對(duì)14種不同產(chǎn)地金銀花藥材進(jìn)行測(cè)定，建立金銀花藥材指紋圖譜，并確定14種不同產(chǎn)地金銀花藥材的18個(gè)共有峰，且14種金銀花藥材的指紋圖譜相似度為0.9以上；不同產(chǎn)地金銀花藥材的指紋圖譜存在明顯差異，又存在一定程度的相關(guān)性。何兵等[26]以綠原酸為參照物建立金銀花HPLC指紋圖譜，同時(shí)以斜率校正法建立綠原酸與其余8個(gè)成分（新綠原酸、隱綠原酸、當(dāng)藥苷、蘆丁、木犀草苷、異綠原酸B、異綠原酸A、異綠原酸C）的相對(duì)校正因子，計(jì)算其含量，實(shí)現(xiàn)一測(cè)多評(píng)；同時(shí)采用外標(biāo)法測(cè)定該9個(gè)成分的含量，并比較二者的差異；建立了金銀花HPLC特征指紋圖譜共有模式，標(biāo)定了21個(gè)共有峰，指認(rèn)了其中9個(gè)共有峰，20批金銀花的相似度為0.959～0.997；20批金銀花中9個(gè)成分的計(jì)算值與實(shí)測(cè)值間無顯著差異；驗(yàn)證了一測(cè)多評(píng)法的準(zhǔn)確性和可行性。黃海燕等[27]通過指紋圖譜比較金銀花和山銀花的質(zhì)量，對(duì)50批樣品進(jìn)行指紋圖譜分析，木犀草苷分析系統(tǒng)說明金銀花與山銀花有共同的有效成分物質(zhì)基礎(chǔ)，該系統(tǒng)指紋圖譜不能區(qū)別具體品種；皂苷分析系統(tǒng)中不同品種的指紋圖譜有較明顯的區(qū)別，可用于金銀花與山銀花具體品種的鑒別參考。宋雯舒等[11]以綠原酸、木犀草苷、灰氈毛忍冬皂苷乙為指標(biāo)成分，利用HPLC測(cè)定指標(biāo)成分含量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，河北和山東產(chǎn)地金銀花中綠原酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.1%～3.3%，河北、山東產(chǎn)地金銀花中木犀草苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.049%～0.050%、0.069%～0.078%。

韓永成等[28]采用UPLC指紋圖譜方法，Agilent C18色譜柱（2.1 mm×50 mm，1.8 μm），流動(dòng)相乙腈-0.2%磷酸水，以0.4 mL/min的流速進(jìn)行梯度洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)238 nm，柱溫30 ℃；在21 min內(nèi)得到金銀花藥材的指紋圖譜，對(duì)其中5個(gè)色譜峰進(jìn)行了初步歸屬，并對(duì)14批藥材樣品進(jìn)行了分析，其相似度為0.915～0.987。UPLC指紋圖譜方法較HPLC大大縮短了分析時(shí)間。

3 金銀花功能基因克隆情況

基因克隆是分子育種的基礎(chǔ)。吳敏琳等[29]以不同產(chǎn)地及品種的金銀花為材料，通過RT-PCR法擴(kuò)增其HQT基因編碼區(qū)，直接測(cè)序，發(fā)現(xiàn)HQT基因編碼區(qū)變異包括堿基置換突變、插入/缺失突變，部分變異會(huì)引起HQT蛋白的改變，并影響綠原酸的表達(dá)量。蔣向輝等[30]采用RT-PCR和RACE技術(shù)，首次從金銀花中克隆丙酮酸激酶基因全長(zhǎng)cDNA，命名為L(zhǎng)iPkc（GenBank登錄號(hào)JQ621946.1），LiPkc基因編碼區(qū)序列全長(zhǎng)為1 533 bp，共編碼510個(gè)氨基酸；基于基因序列親緣關(guān)系分析結(jié)果顯示，LiPkc基因與煙草Pkc基因親緣關(guān)系最近，屬于雙子葉植物Pkc基因家族；蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位分析認(rèn)為L(zhǎng)iPkc在線粒體或葉綠體中發(fā)揮作用；LiPkc蛋白質(zhì)的三維空間結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，LiPkc蛋白主要由α-螺旋、不規(guī)則盤繞組成；定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，LiPkc基因在金銀花不同組織中廣泛表達(dá)，但表達(dá)水平各有差異，黃花中表達(dá)量最高。劉霞宇等[31]選取金銀花的9個(gè)候選內(nèi)參基因Lonja.ACT11、Lonja.ACT2/7、Lonja.G6PD、Lonja.GAPDH、Lonja.MTP、Lonja.TUA、Lonja.UBQ10、Lonja.EF1A、Lonja.UBC，利用q RT-PCR技術(shù)及Ge Norm、Norm Finder軟件對(duì)它們的表達(dá)穩(wěn)定性進(jìn)行分析評(píng)價(jià)，得出可選用Lonja.ACT2/7和Lonja.G6PD組合作為內(nèi)參基因。喬中全等[32]根據(jù)已知的其他物種黃酮醇合成酶cDNA保守序列設(shè)計(jì)引物，用RT-PCR技術(shù)從金銀花葉片中擴(kuò)增獲得黃酮醇合成酶基因部分cDNA序列，再用RACE技術(shù)獲得其兩端序列；序列拼接得到完整的1 248 bp的黃酮醇合成酶基因，根據(jù)獲得的序列，設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增獲得1 001 bp的開放閱讀框，編碼333個(gè)氨基酸；序列分析顯示，金銀花黃酮醇合成酶基因與煙草、馬鈴薯和桔梗的黃酮醇合成酶基因具有高度同源性。亓希武等[33]在藥用植物金銀花中克隆得到1條肌動(dòng)蛋白（Actin）基因序列，命名為L(zhǎng)j Actin （Gen Bank 登錄號(hào)：KY114518），序列比對(duì)結(jié)果表明，金銀花的Actin和其他植物的Actin在序列上高度保守；進(jìn)化分析結(jié)果表明，金銀花的Actin與擬南芥的At ACT7和水稻的Os ACT2聚為一支；RT-PCR結(jié)果顯示，Lj Actin在金銀花5個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的花中表達(dá)穩(wěn)定。汪周勇等[34]從忍冬（Lonicera japonica Thunb.）轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果中分析獲得1個(gè)Fat B基因，分別以忍冬、紅白忍冬[Lonicera japonica Thunb.var.chinensis （Wats.） Bak.]、紅腺忍冬（Lonicera hypoglauca Miq.）和水忍冬（Lonicera dasystyla Rehd.）新鮮花蕾為材料，利用RT-PCR技術(shù)克隆獲得了LJFat B、LHFat B、LJCFat B、LDFat B基因的全長(zhǎng)cDNA，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，結(jié)果表明，LJFat B、LJCFat B、LHFat B 和LDFat B 與擬南芥At Fat B具有較近的親緣關(guān)系；LJFat B、LJCFat B、LHFat B和 LDFat B的核苷酸序列、蛋白特性及其二級(jí)結(jié)構(gòu)有所差異，但其蛋白均具有保守的Fat B底物結(jié)合位點(diǎn)和催化活性位點(diǎn)，且在花蕾中的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有顯著差異；因此推測(cè)LJFat B、LJCFat B、LHFat B 和 LDFat B 可能具有與At Fat B相同的生物學(xué)功能。莽草酸/奎寧酸香豆酰轉(zhuǎn)移酶（HCT）是金銀花中綠原酸合成途徑的關(guān)鍵酶。何柳等[35]利用已經(jīng)獲得的金銀花大量表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）數(shù)據(jù)，通過cDNA末端快速擴(kuò)增（RACE）技術(shù)克隆金銀花HCT（LiHCT）基因。蔣向輝等[36]采用設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并性引物和RACE克隆相結(jié)合，從金銀花中克隆了捕光葉綠素a/b結(jié)合蛋白基因全長(zhǎng)，命名為L(zhǎng)jCad（Gen Bank登錄號(hào)：JQ621945.1）；基因全長(zhǎng)為960 bp，開放閱讀框?yàn)?98 bp，其編碼265個(gè)氨基酸，基因不含內(nèi)含子，屬于光系統(tǒng)Ⅱ的Cab基因；LjCad基因受光、6-BA、GA3和NAA誘導(dǎo)表達(dá)，但是黑暗和ABA激素處理對(duì)LjCad基因的表達(dá)沒有明顯的影響。齊琳潔等[37]通過生物信息學(xué)的方法從金銀花轉(zhuǎn)錄組中獲得4個(gè)DNA去甲基化酶基因，分別為L(zhǎng)JDME1、LJDME2、LJDME3和LJDME4，并預(yù)測(cè)其編碼蛋白的理化性質(zhì)和表達(dá)模式；系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果表明，LJDME1、LJDME2聚為一類，LJDME3、LJDME4聚為一類，與擬南芥中的DME關(guān)系更為密切；基因表達(dá)分析表明，4個(gè)DNA去甲基化酶基因在變種間差異表達(dá)明顯，LJDME1、LJDME2基因表達(dá)水平在紅金銀花中高于金銀花，推測(cè)其可能參與調(diào)控金銀花活性成分積累的過程，并且4個(gè)DNA去甲基化酶基因具有組織表達(dá)特異性。

4 我國金銀花研究中的問題和建議

金銀花藥用價(jià)值和保健用途廣泛，需求量不斷增加，種植面積不斷擴(kuò)大。分子生物技術(shù)在金銀花繁殖、育種、分類、鑒定等方面的研究取得了一定進(jìn)展，尤其是鑒定方面，現(xiàn)在已擁有DNA條碼、HPLC指紋圖譜等快速、穩(wěn)定、高效的金銀花種間、種內(nèi)鑒定技術(shù)。但與其他植物相比，金銀花的分子生物研究仍處于起步階段，如金銀花快繁研究沒有一套成熟的體系，關(guān)于金銀花遺傳圖譜構(gòu)建、功能基因研究較少。在今后的金銀花研究中，一方面要在現(xiàn)有常規(guī)育種基礎(chǔ)上解決金銀花生產(chǎn)中的低產(chǎn)、染病等問題，同時(shí)分子生物輔助育種方面，如尋找綠原酸、木犀草苷緊密連鎖的分子標(biāo)記或生化標(biāo)記，克隆關(guān)鍵基因同步開展，以期更快地促進(jìn)我國金銀花科學(xué)研究的發(fā)展。

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