張洪坤等
摘要 ?[目的]以多成分含量為指標(biāo),掌握半枝蓮不同采收期質(zhì)量變化規(guī)律,確定半枝蓮藥材的最佳采收期。[方法]采用紫外-可見分光光度法測定不同采收期半枝蓮中總黃酮含量,高效液相色譜法同時(shí)測定野黃芩苷、野黃芩素、木犀草素、芹菜素等多成分的含量,并以水溶性、醇溶性浸出物為評(píng)價(jià)指標(biāo)。[結(jié)果]不同采收期總黃酮、野黃芩苷的含量從大到小依次為7月、9月、5月,不同生長期含量從大到小依次為開花期、開花前、果實(shí)期。其他多成分指標(biāo)中,野黃芩苷及浸出物含量均以7月開花期采收的半枝蓮最高,而木犀草素、芹菜素含量則表現(xiàn)不同的規(guī)律。[結(jié)論]不同采收期半枝蓮中質(zhì)量差異明顯,建議應(yīng)以7月開花期為半枝蓮最佳采收期。
關(guān)鍵詞 ??半枝蓮;采收期;多成分
中圖分類號(hào)R282.4文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A文章編號(hào)0517-6611(2018)36-0172-04
半枝蓮(Scutellaria barbata D.Don)為唇形科黃芩屬植物的干燥全草[1],夏、秋兩季莖葉茂盛時(shí)采挖,味辛、苦,寒,歸肺、肝、腎經(jīng),具有清熱解毒、化瘀利尿的功效。近代藥理學(xué)研究表明,半枝蓮具有抗腫瘤、抗病原、抑菌、解熱、保肝等活性,臨床用于治療各種癌癥、肝炎、疔瘡腫毒、咽喉腫痛、跌撲傷痛、水腫、黃疸、毒蛇咬傷等,療效確切[2-5]。半枝蓮生于海拔2 000 m以下的水田邊和溪邊或濕潤草地上[6],為多年生草本,一次種植可連續(xù)采收,一年可收割3~4次[7]。為掌握不同采收期半枝蓮質(zhì)量變化規(guī)律,筆者以半枝蓮藥材中野黃芩苷等多成分含量為指標(biāo),監(jiān)測不同采收期質(zhì)量變化情況,以期為半枝蓮最佳采收期的確定提供試驗(yàn)依據(jù)。
1材料與方法
1.1材料
1.1.1試材。半枝蓮分別于2017年5、7、9月期間采自安徽壽縣半枝蓮基地,均經(jīng)廣州香雪制藥股份有限公司連林生高級(jí)工程師鑒定為唇形科黃芩屬半枝蓮(Scutellaria barbata D.Don)的干燥地上部分。采樣時(shí)要求所有樣品均從同一種植區(qū)域采集,共分三茬采樣,盡量保證每批樣品均勻。不同采收期(開花前、開花中、結(jié)果期)視半枝蓮生長情況而定(開花前及結(jié)果期采樣時(shí)間大約間隔7 d,分別采收2批次,開花期即采收時(shí)每隔4 d采收,開花期共采收5批次)。并對(duì)每批次樣品進(jìn)行統(tǒng)一方法加工,加工方式如下:收獲時(shí)用刀齊地割取全株,除去雜草、泥沙及枯萎的枝葉等雜質(zhì),將鮮品半枝蓮均勻平鋪,曬干或陰干至水分合格即可(≤13.0%)。
1.1.2儀器。RHP-100型高速多功能粉碎機(jī)(浙江永康市榮浩工貿(mào)有限公司);XS204型電子天平(d=0.1 mg,Mettler Toledo);電熱套(500 mL,海寧市新華醫(yī)療器械廠);HWS-26型電熱恒溫水浴鍋(上海一恒科學(xué)儀器有限公司);DHG-9245A電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司);TU-1901雙光束紫外可見分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限責(zé)任公司);Agilent-1200型高效液相色譜儀;YMC Hydrosphere C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)。
1.1.3試劑。甲醇(色譜純,Merck);甲醇(AR,170212-1,西隴科學(xué)股份有限公司);無水乙醇(AR,161004-1,西隴科學(xué)股份有限公司);石油醚(60~90 ℃)(AR,20160801-2,廣州化學(xué)試劑廠);磷酸(色譜純,阿拉?。?醋酸(AR,20150601-2,廣州化學(xué)試劑廠);野黃芩苷(110842-201508,中國食品藥品檢定研究院,含量以91.3%計(jì));野黃芩素(MUST-1602204,成都曼斯特生物科技有限公司);木犀草素(111520-201605,中國食品藥品檢定研究院,含量以99.6%計(jì));芹菜素(MUST-1606130,成都曼斯特生物科技有限公司)。
1.2方法
1.2.1浸出物含量測定。
1.2.1.1水溶性浸出物。取各半枝蓮樣品粗粉約4 g,精密稱定,置250 mL錐形瓶中,精密加水100 mL,密塞,稱定重量,靜置1 h后,連接回流冷凝管,加熱至沸騰,并保持微沸1 h。放冷后,取下錐形瓶,密塞,再稱定重量,用水補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過,精密量取濾液25 mL,置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中、在水浴上蒸干后,于105 ℃干燥3 h,置干燥器中冷卻30 min,迅速精密稱定重量,計(jì)算供試品中水溶性浸出物的含量。
1.2.1.2醇溶性浸出物。取各半枝蓮樣品粗粉約2 g,精密稱定,置100 mL錐形瓶中,精密加稀乙醇50 mL,密塞,稱定重量,靜置1 h后,連接回流冷凝管,加熱至沸騰,并保持微沸1 h。放冷后,取下錐形瓶,密塞,再稱定重量,用稀乙醇補(bǔ)足減失的重量,搖勻,濾過,精密量取濾液25 mL,置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中、在水浴上蒸干后,于105 ℃干燥3 h,置干燥器中冷卻30 min,迅速精密稱定重量,計(jì)算供試品中醇溶性浸出物的含量。
1.2.2總黃酮含量測定。
1.2.2.1對(duì)照品溶液的制備。取野黃芩苷對(duì)照品適量,精密稱定,加甲醇制成0.2 mg/mL的溶液,即得。
1.2.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。精密量取對(duì)照品溶液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL分別置25 mL容量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻。以甲醇為空白,按照紫外-可見分光光度法(2015年版《中國藥典》 四部 通則0401),在335 nm的波長處分別測定吸光度,以吸光度為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
1.2.2.3供試品溶液的制備。取本品粉末(過3號(hào)篩)約1 g,精密稱定,置索氏提取器中,加石油醚(60~90 ℃)提取至無色,棄去醚液,藥渣揮去石油醚,加甲醇繼續(xù)提取至無色,轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,精密量取1 mL,置50 mL容量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻即得。
1.2.2.4測定法。取供試品溶液,按照“1.2.2.2”方法,自“以甲醇為空白”起,依法測定吸光度,從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出供試品溶液中野黃芩苷的重量(mg),計(jì)算,即得。
1.2.3多成分含量測定。
1.2.3.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)。色譜柱:YMC Hydrosphere C18(250 mm×4.6 mm,5μm);檢測器:UV檢測器(335 nm);以甲醇為流動(dòng)相A,以0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相B,按表1中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫;柱溫為30 ℃;流速 1 mL/min。
1.2.3.2對(duì)照品溶液的制備。精密稱取野黃芩苷、野黃芩素、木犀草素、芹菜素對(duì)照品適量,加甲醇制成每1 mL含野黃芩苷60 μg、野黃芩素4 μg、木犀草素5 μg、芹菜素8 μg的混合對(duì)照品溶液。
1.2.3.3供試品溶液的制備。精密稱取本品粉末(3號(hào)篩)0.2 g,置100 mL錐形瓶中,加70%乙醇25 mL,立即加熱回流15 min,冷卻至室溫。過濾,取濾液轉(zhuǎn)移于50 mL容量瓶中,重復(fù)提取1次,合并濾液,加70%乙醇至刻度,用0.45 μm微孔濾膜濾過,即得。
1.2.3.4線性關(guān)系的考察。取混合對(duì)照品溶液,按“1.2.3.1”色譜條件,分別吸取0.5、1.0、3.0、5.0、7.0、10.0 μL注入高效液相色譜儀進(jìn)行測定。以峰面積(Y)為橫坐標(biāo)、進(jìn)樣量(X)為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,進(jìn)行線性回歸。
1.2.3.5
精密度試驗(yàn)。取混合對(duì)照品溶液,按“1.2.3.1”色譜條件,重復(fù)進(jìn)樣6次,記錄峰面積RSD。
1.2.3.6
穩(wěn)定性試驗(yàn)。取同一份供試品溶液分別于配制0、2、4、6、8、10、12、16、20、24 h進(jìn)行測定,記錄峰面積RSD。
1.2.3.7
重復(fù)性試驗(yàn)。取同一批次樣品,按“1.2.3.3”方法制備6份供試品溶液,精密進(jìn)樣10 μL,計(jì)算各多成分的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)和RSD。
1.2.3.8
加樣回收率試驗(yàn)。精密稱取同一批次已知含量的樣品0.1 g,共6份,按1∶1加入野黃芩苷、野黃芩素、木犀草素、芹菜素對(duì)照品適量,按“1.2.3.3”方法制備供試品溶液,按“1.2.3.1”色譜條件進(jìn)樣10 μL,記錄峰面積,計(jì)算加樣回收率。
1.2.3.9測定法。分別精密吸取對(duì)照品溶液與供試品溶液各10 μL,注入液相色譜儀,測定,即得。
2結(jié)果與分析
2.1方法學(xué)考察
2.1.1
對(duì)照品與樣品的高效液相色譜峰圖。從圖1可以看出,在相同的色譜條件下,樣品在對(duì)照品相同出峰時(shí)間中均有相應(yīng)一個(gè)峰出現(xiàn),且該條件下樣品中的目標(biāo)峰與相鄰峰的分離度較大,空白無干擾,說明此條件適合測定半枝蓮中野黃芩苷、野黃芩素、木犀草素和芹菜素的含量。
2.1.2線性關(guān)系的考察。以峰面積(Y)為橫坐標(biāo)、進(jìn)樣量(X)為縱坐標(biāo),分別繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,進(jìn)行線性回歸,具體結(jié)果見表2。結(jié)果表明,野黃芩苷、野黃芩素、木犀草素、芹菜素在相應(yīng)濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。
2.1.3精密度試驗(yàn)。按照“1.2.3.5”方法操作,結(jié)果發(fā)現(xiàn),野黃芩苷、野黃芩素、木犀草素和芹菜素的峰面積RSD分別為0.1%、0.1%、0.1%、0.3%,表明儀器精密度良好。
2.1.4穩(wěn)定性試驗(yàn)。按照“1.2.3.6”方法操作,結(jié)果發(fā)現(xiàn),野黃芩苷、野黃芩素、木犀草素和芹菜素的峰面積RSD分別為0.5%、2.1%、1.4%、0.8%,表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。
2.1.5重復(fù)性試驗(yàn)。按照“1.2.3.7”方法操作,結(jié)果發(fā)現(xiàn),野黃芩苷、野黃芩素、木犀草素、芹菜素的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.775%、0.035%、0.063%、0.103%,RSD分別為1.1%、2.0%、1.7%、1.3%,表明該方法重復(fù)性良好。
2.1.6加樣回收率試驗(yàn)。從表3可以看出,野黃芩苷、野黃芩素、木犀草素、芹菜素的平均加樣回收率分別為100.8%、95.3%、95.2%和92.1%,RSD分別為1.7%、1.2%、1.5%、1.4%,表明該方法回收率較好,方法可行。
注:a.對(duì)照品;b.供試品;c.空白對(duì)照;1.野黃芩苷;2.野黃芩素;3.木犀草素;4.芹菜素
Note:a.Standard;b.Sample;c.Blank control;1.Scutellarin;2.Scutellarein;3.Luteolin;4.Apigenin
2.2含量測定方法確定并驗(yàn)證后,取不同采收期半枝蓮樣品進(jìn)行各指標(biāo)含量測定,結(jié)果表明(表4),總黃酮含量均符合2015年版《中國藥典》要求,可見該產(chǎn)地采收期內(nèi)半枝蓮總黃酮含量符合要求,其中7月采收期含量顯著高于5月、9月采收期,5月與9月采收期含量差別不大,從大到小總體表現(xiàn)為7月、9月、5月;多成分含量測定中,7月、9月采收期野黃芩苷含量均顯著高于5月采收期,而野黃芩素、木犀草素含量比較中,9月采收的則明顯高于5月、7月,5月與7月間無顯著差異;而芹菜素的含量則相反,5月采收的則明顯高于7月、9月。浸出物含量比較中,無論是水溶性浸出物還是醇溶性浸出物,7月采收期與另外2者均有顯著性差異,含量顯著高于5月、9月采收期。按生長期比較,不同月份采收期中,開花期各指標(biāo)綜合含量均較開花前、結(jié)果期高,開花前與結(jié)果期則均差別不大。
3討論
半枝蓮為多年生草本,生長過程中幾乎無病害發(fā)生,易種易管,一次種植可連續(xù)采收,一年可收割3~4次,而由于2018年安徽壽縣半枝蓮基地入冬早,雨水不充足,第四茬半枝蓮生長速度放緩,長勢矮小,莖枝細(xì)小,產(chǎn)量降低,因此并未采收比較。據(jù)統(tǒng)計(jì),半枝蓮不同采收期中第一茬生長期長,枝葉最為粗壯,產(chǎn)量最高,占全年產(chǎn)量的50%。二茬產(chǎn)量占30%,三茬四茬產(chǎn)量在20%。
通過分析比較發(fā)現(xiàn),藥典規(guī)定指標(biāo)中,不同采收期總黃酮的含量從大到小總體依次為7月、9月、5月,不同生長期含量從大到小總體依次為開花期、開花前、果實(shí)期。其他多成分指標(biāo)中,野黃芩苷及浸出物含量均以7月開花期采收的半枝蓮最高,而木犀草素、芹菜素含量則表現(xiàn)不同的規(guī)律,其中木犀草素隨著月份的增加,含量明顯增高,芹菜素含量則相反,頭茬半枝蓮含量最高,但與7月采收期均差別不大。可見3個(gè)采收時(shí)間的半枝蓮以7月開花期的綜合質(zhì)量最高,該結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[8-10],這可能與植物的光照、溫度、濕度等因素有關(guān),該時(shí)期陽光、雨水均充足,莖葉最為茂盛,而不同生長期比較中,開花期期間莖葉最為茂盛,有效成分較為豐富。因此建議于各茬開花期期間采收半枝蓮。
參考文獻(xiàn)
[1] 國家藥典委員會(huì).中華人民共和國藥典:一部[S].北京:中國醫(yī)藥科技出版社,2015:118.
[2] 郭姍姍,時(shí)宇靜,高英杰,等.半枝蓮總黃酮抗副流感病毒的作用機(jī)制[J].藥學(xué)學(xué)報(bào),2009,44(12):1348-1352.
[3] 曾莉萍,林明寶,舒虹.復(fù)方半枝蓮膠囊體外抗腫瘤作用的實(shí)驗(yàn)研究[J].江西醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2006,46(3):46-48.
[4] 楊培芬,李鈞敏,邵紅.半枝蓮的次生代謝產(chǎn)物含量測定與體外抑菌活性的研究[J].四川中醫(yī),2005,23(11):35-36.
[5] 馮德富,李小沙.復(fù)方半枝蓮湯聯(lián)合阿德福韋酯治療慢性乙型肝炎療效觀察[J].實(shí)用中醫(yī)內(nèi)科雜志,2010,24(2):72-75.
[6] 南京中醫(yī)藥大學(xué).中藥大辭典·上冊(cè)[M].2版.上海:上??茖W(xué)技術(shù)出版社,2006:1079.
[7] 國家中醫(yī)藥管理局《中華本草》編委會(huì).中華本草7[M].上海:上海科學(xué)技術(shù)出版社,1999:210-212.
[8] 鄒箴蕾,吳啟南.HPLC測定不同采收時(shí)間半枝蓮中的野黃芩苷含量[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐,2005,19(2):45-46.
[9] 李潔.不同采收期半枝蓮中總黃酮含量的比較研究[J].中醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2008,14(5):99,112.
[10] 范菊娣,覃容貴,李相陵,等.不同采收期半枝蓮中黃酮含量比較[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2016,35(9):987-990.