曾茜 陳旭 劉璞玉 楊仁德 朱森林 杜慕云

摘 要 植物內(nèi)生真菌作為獲取生物防治材料的一個潛在且龐大的優(yōu)質(zhì)資源庫，極具開發(fā)應(yīng)用潛力。采用平板對峙法，對已有的137株小白及內(nèi)生真菌進(jìn)行塊莖腐爛病菌菌絲生長的拮抗活性篩選，并以6種常見農(nóng)業(yè)病原菌作為靶標(biāo)菌完成抗菌譜測定，初步獲得抗病能力較強(qiáng)的2株內(nèi)生真菌：菌株GZFJ021和GZLG033。

關(guān)鍵詞 小白及；內(nèi)生真菌；塊莖腐爛??；拮抗作用

中圖分類號：Q939.96 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2018.1.002

白及又名箬蘭、連及草和甘根等，隸屬于單子葉植物綱蘭科白及屬，為多年生草本植物。以干燥塊莖入藥，形狀不規(guī)則，多有數(shù)個爪狀分枝，質(zhì)地堅硬，柔韌性好。其性微寒，味苦，歸肺、胃、肝經(jīng)，具有收斂止血、消腫生肌的作用，常用于治療咯血、外傷出血、瘡瘍腫毒、皮膚皸裂等病癥[1]。白及作為貴州省珍貴的中藥材品種之一，不僅具有獨特的藥用和觀賞價值，還被廣泛應(yīng)用于食品、化工等領(lǐng)域，可開發(fā)利用的潛力巨大[2-3]。據(jù)報道，目前共發(fā)現(xiàn)4種白及屬植物分布在我國境內(nèi)，其中貴州有3種（白及、黃花白及和小白及），以小白及野生資源較為珍稀[4]。

近年來，隨著白及人工種植規(guī)模擴(kuò)大和連續(xù)種植，加上生態(tài)環(huán)境變化等因素的影響，導(dǎo)致病蟲害頻頻發(fā)生，尤其在高溫高濕條件下，白及易受病原微生物的侵染而出現(xiàn)根腐病、葉褐斑病、灰霉病等[5]。白及作為貴州省道地藥材，市場需求量巨大，但由于病蟲害的影響，特別是塊莖腐爛病危害最為嚴(yán)重，使得產(chǎn)量和品質(zhì)有所下降，制約了白及產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展。長期的栽培實踐表明，農(nóng)藥防治白及塊莖腐爛病效果不理想，并且對環(huán)境和產(chǎn)品質(zhì)量安全均存在較大影響。筆者以前期分離獲得的137株小白及內(nèi)生真菌作為供試菌株，塊莖腐爛病病原菌立枯絲核菌QX1、尖孢鐮刀菌ZF1和ZF2作為靶標(biāo)菌，通過平板對峙法篩選抗病活性菌株，旨在為探索高效的生物防治技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

1）供試目標(biāo)菌：已分離獲得的137株小白及植物內(nèi)生真菌。

2）供試病原菌：白及塊莖腐爛病病原菌立枯絲核菌（Rhizoctonia solani，QX1）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum，ZF1、ZF2）。

供試目標(biāo)菌、供試病原菌均保存于貴陽中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生物實驗室。

1.2 主要培養(yǎng)基和儀器

1）培養(yǎng)基：為PDA培養(yǎng)基，使用馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g，加水至1 000 mL，pH值自然。

2）儀器：超凈工作臺、恒溫生化培養(yǎng)箱等。

1.3 試驗方法

1）病原拮抗菌篩選：采用平板對峙法對已有的內(nèi)生真菌進(jìn)行拮抗菌篩選試驗。在無菌條件下利用打孔器取直徑7 mm供試病原菌菌餅接種于PDA平板中央，置于26 ℃恒溫培養(yǎng)48 h后，于左右兩邊距離菌落邊緣2 cm處接入內(nèi)生真菌菌餅，無菌面朝上；同樣在上下兩面接入無菌PDA培養(yǎng)基餅作為空白對照，繼續(xù)恒溫培養(yǎng)3～5 d后測量抑菌帶大小。設(shè)3次重復(fù)，取平均值。

2）拮抗菌抗菌譜測定：同樣采用平板對峙法，利用試驗1）中獲得的拮抗菌作為目標(biāo)菌，選擇常見的6種作物病原菌進(jìn)行抗菌譜測定，分別為番茄早疫病菌F588、番茄黑斑病菌F788、水稻紋枯病菌WB、小麥赤霉病菌CM、水稻稻瘟病菌DWB和煙草黑脛病菌HJB。試驗方法同上。

3）數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析：采用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原拮抗菌篩選

采用平板對峙法對137株小白及內(nèi)生真菌抗病活性進(jìn)行初篩。結(jié)果共篩選出5株內(nèi)生真菌，菌株GZYS007、GZFJ021、GZFJ028、GZLG033、GZLG25對白及塊莖腐爛病病原菌立枯絲核菌QX1、尖孢鐮刀菌ZF1和ZF2的菌絲生長表現(xiàn)出較強(qiáng)抑制活性（見表1）。其中，對立枯絲核菌QX1產(chǎn)生的抑菌帶從大到小依次為：GZYS007（11.50）>GZFJ021（10.75）>GZLG033（9.75）>GZLG25（8.50）>GZFJ028（4.50）；對尖孢鐮刀菌ZF1，ZF2則分別為：GZFJ021（13.00）>GZLG033（11.00）>GZFJ028（6.75），GZFJ021（11.25）>GZLG033（10.25）>GZFJ028（9.50）>GZLG25（3.75）。綜合分析認(rèn)為，菌株GZFJ021、GZLG033和GZFJ028的抑制效果最好，可作為下一步抗菌譜篩選試驗的目標(biāo)菌株。

2.2 拮抗菌抗菌譜測定

采用相同方法對3株活性較好的白及塊莖腐爛病拮抗菌進(jìn)行抗菌譜測定試驗，結(jié)果顯示，3株內(nèi)生真菌GZFJ021、GZFJ028、GZLG033對常見農(nóng)業(yè)病原菌小麥赤霉病菌、水稻紋枯病菌、馬鈴薯晚疫病菌、煙草黑脛病菌、玉米灰斑病菌和高粱炭疽病菌能產(chǎn)生較強(qiáng)的生長抑制效果（見表2）。其中，菌株GZFJ021對6種病原菌均具有一定抑制活性，從大到小依次為：煙草黑脛病菌（14.50）>小麥赤霉病菌（14.00）>水稻紋枯病菌（12.75）>高粱炭疽病菌（10.25）>馬鈴薯晚疫病菌（6.25）>玉米灰斑病菌（5.50）；菌株GZLG033次之，對水稻紋枯病菌和玉米灰斑病菌抑制效果較強(qiáng)，分別為14.25和12.75；菌株GZFJ028相對較差，能對煙草黑脛病菌菌絲生長產(chǎn)生大小為11.25的抑菌帶。因此，內(nèi)生真菌GZFJ021和GZLG033表現(xiàn)出較廣的抗菌譜，且活性也較強(qiáng)，可作為生防菌資源儲備。

3 討論與展望

植物內(nèi)生真菌一般是指那些部分或整個生活史存在于健康植物組織和器官中，而不會對宿主產(chǎn)生侵染現(xiàn)象或明顯病害癥狀的一類真菌。它們能通過調(diào)控植物生理代謝來增強(qiáng)寄主在環(huán)境中的抗逆性、適應(yīng)性等[6]。植物內(nèi)生真菌豐富的生物多樣性造就了次生代謝產(chǎn)物的多樣性，其效用活性涵蓋了醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)及工業(yè)生產(chǎn)等多個領(lǐng)域。特別是生長于生態(tài)系統(tǒng)復(fù)雜多樣環(huán)境中的植物，其內(nèi)生真菌產(chǎn)生活性物質(zhì)的可能性更大，且效用更強(qiáng)[7]。

生物防治作為化學(xué)藥劑理想的替代方法，具有安全、生態(tài)、特異性強(qiáng)等優(yōu)勢，主要是利用有益或功能性生物及其代謝產(chǎn)物來控制有害生物種群的發(fā)生，減少危害。本研究初步篩選出2株具有白及塊莖腐爛病拮抗活性的內(nèi)生真菌，表現(xiàn)為抗菌譜廣、效用強(qiáng)，可為中藥材人工種植病害生防技術(shù)的開發(fā)提供材料基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2015.

[2] 徐中志，譚敬菊，陳翠，等.不同白及種源分析評價與利用研究[J].江西農(nóng)業(yè)學(xué)報，2011，23（1）：90-92.

[3] 何海玲，顧龔平，張衛(wèi)明.白及多糖膠涂膜保鮮櫻桃番茄的研究[J].食品科學(xué)，2007，28（4）：336-340.

[4] 和志嬌，呂麗芬，楊麗云，等.白及種質(zhì)資源遺傳多樣性的ISSR分析[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2008，21（4）：1081-1085.

[5] 曾令祥，楊琳，陳婭婭，等.貴州中藥材白及病蟲害種類的調(diào)查與綜合防治[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（7）：106-108.

[6] Tetard C， Edwards R， Catherine TJ， et al. Potential roles for microbial endophytes in herbicide tolerance in plants[J]. Pest Manag Sci， 2016， 72（2）： 203-209.

[7] 陳旭，曾茜，劉璞玉，等.貴州小白及內(nèi)生真菌多樣性與產(chǎn)抗病活性物質(zhì)菌株的篩選[J].西南農(nóng)業(yè)學(xué)報，2017，30（1）：111-117.

（責(zé)任編輯：丁志祥）