李美英 金志強 楊小亮 賈彩虹 夏啟玉 郭靜遠 賀萍萍 徐碧玉

摘 要 通過簡并引物和降落PCR方法結合RACE（rapid amplification of cDNA end）技術在香蕉果實cDNA文庫中獲得2個14-3-3基因，分別命名為Ma14-3-3d和Ma14-3-3h，把Ma14-3-3d和Ma14-3-3h與Ma14-3-3a、Ma14-3-3c、Ma14-3-3e、Ma14-3-3i進行多重序列比對和同源性比較。結果表明：Ma14-3-3d和Ma14-3-3h與Ma14-3-3a、Ma14-3-3c、Ma14-3-3e、Ma14-3-3i具有較高的同源性，同時具有一定的差異性。遺傳進化分析結果表明，Ma14-3-3d與Ma14-3-3a、Ma14-3-3c、Ma14-3-3e、Ma14-3-3i同屬于non-ε類14-3-3基因，Ma14-3-3h屬于ε類14-3-3基因。RT-PCR分析結果表明，Ma14-3-3d和Ma14-3-3h在香蕉不同器官中差異表達， Ma14-3-3d在香蕉的根、莖、葉、花和果中均有表達，且在莖、葉和花中的表達量高于根和果；Ma14-3-3h在根、花和果中的表達量較高，而在莖和葉中的表達量較低。qRT-PCR分析結果表明，Ma14-3-3d基因的表達明顯受乙烯的誘導，而Ma14-3-3h在正常成熟、乙烯處理與1-MCP處理的果實中表達量均很低，與果實成熟的相關性不明顯。推測Ma14-3-3d可能與香蕉果實成熟密切相關，可能參與乙烯調(diào)控果實成熟過程中的生物合成與信號轉(zhuǎn)導。

關鍵詞 香蕉；Ma14-3-3d；Ma14-3-3h；成熟；表達分析

中圖分類號 S668.1 文獻標識碼 A

Abstract Two cDNAs homologous with 14-3-3 protein genes were obtained by screening cDNA library of banana fruit by degenerate primer， landing PCR and RACE （rapid amplification of cDNA ends） approaches， and they were designated as Ma14-3-3d and Ma14-3-3h， respectively. Multiple alignment and homology comparison of deduced amino acid sequences of Ma14-3-3d and Ma14-3-3h together with Ma14-3-3a， Ma14-3-3c， Ma14-3-3e， and Ma14-3-3i revealed that they shared high similarity and specificity. Phylogenetic analysis showed that Ma14-3-3d with Ma14-3-3a， Ma14-3-3c， Ma14-3-3e， and Ma14-3-3i belonged to the non-ε group 14-3-3 genes， while Ma14-3-3h was classed into the ε group. Expression analysis showed that Ma14-3-3d and Ma14-3-3h were differentially expressed in different organs of banana as determined by RT-PCR （reverse transcriptase-polymerase chain reaction）， Ma14-3-3d was expressed in roots， stems， leaves， flowers and fruits of banana， and its expression in stems， leaves and flowers was higher than that in roots and fruits； the expression of Ma14-3-3h in roots， flowers and fruits was higher， and its expression in stems and leaves was low. Expression of Ma14-3-3d was obviously induced by ethylene as determined by qRT-PCR analysis， while the expression of Ma14-3-3h in ethylene treated and 1-MCP treated fruits was very low， its correlation with fruit ripening was not obvious. It is speculated that Ma14-3-3d may be closely related to the physiological process of ripening of banana fruit， and may be involved in ethylene biosynthesis， regulation of fruit ripening and signal transduction.

Key words banana； Ma14-3-3d； Ma14-3-3h； ripening； expression analysis

doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.05.012

香蕉是一種典型的呼吸躍變型果實，隨著呼吸躍變的發(fā)生，果皮和果肉發(fā)生著復雜而又迅速的生理和生化變化，這些變化直接影響香蕉果實的品質(zhì)、風味和貨架期，從而影響了香蕉的商品價值[1]。近年來香蕉采后成熟的機制研究取得了巨大進展，這為人們更好地調(diào)控果實采后成熟技術措施提供了理論依據(jù)。

因為乙烯對果實成熟具有重要的調(diào)控作用，近年來與乙烯生物合成密切相關的酶基因如ACC合成酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylate synthetase，ACS）基因家族及ACC氧化酶（ACC oxidase，ACO）基因在香蕉果實中已被分離，研究證明MA-ACS1和MA-ACO1是與香蕉果實成熟密切相關的2個主要基因，對果實成熟過程中的乙烯生物合成起著直接的調(diào)控作用[2-4]。為了更深入研究香蕉果實采后成熟乙烯的生物合成調(diào)控機制，一些與果實成熟相關的轉(zhuǎn)錄因子CONSTANS（CO）[5]、MADS-box[6]被分離，與淀粉分解、糖的合成及細胞壁降解的一些酶基因，如α-淀粉酶（alpha-amylase）基因[7]、蔗糖磷酸合成酶基因[8]和果膠酶（Pectate lyase）基因[9]等也被分離，這些基因與香蕉果實成熟及乙烯生物合成的關系已被詳細分析。

14-3-3蛋白是在真核生物體內(nèi)廣泛存在的一種高度保守的多基因家族蛋白，以同源或異源的杯狀二聚體形式存在，通過接頭或支架與發(fā)生磷酸化的多種目標靶蛋白的相應結構域發(fā)生相互作用，包括激酶、轉(zhuǎn)錄因子、結構蛋白、離子通道蛋白和病原菌反應相關蛋白，參與調(diào)控真核生物的許多生命活動過程，包括生長發(fā)育、囊泡穿梭運輸、主要代謝過程、細胞周期循環(huán)、細胞調(diào)亡和生物及非生物脅迫反應以及許多激素的信號轉(zhuǎn)導過程[10-14]。近年來，許多研究結果表明14-3-3蛋白與乙烯的生物合成密切相關，擬南芥14-3-3 psi基因在冷害刺激作用表達量升高，進一步的研究發(fā)現(xiàn)14-3-3蛋白通過調(diào)控乙烯生物合成酶的活性來控制內(nèi)源乙烯的生物合成[15]，最近的研究結果發(fā)現(xiàn)擬南芥中的14-3-3蛋白可與3種結構型的ACS相互作用，可對植物體內(nèi)內(nèi)源乙烯的生物合成進行精細調(diào)控，從而調(diào)控著植物體內(nèi)的多種生理過程[14-16]。前期的研究結果表明3個香蕉的14-3-3蛋白基因的表達與果實采后成熟密切相關，并受外源乙烯的強烈誘導[17]。

為進一步深入了解14-3-3蛋白對香蕉果實采后成熟的調(diào)控作用，本研究對通過簡并引物結合降落PCR方法獲得的2個14-3-3蛋白基因序列進行初步生物信息學分析，通過RT-PCR方法分析Ma14-3-3d和Ma14-3-3h在香蕉（Musa acuminata L. AAA group cv. Brizilian）不同器官中的表達水平，進一步運用qRT-PCR技術分析2個基因在香蕉果實采后不同時期、不同處理的表達變化。此結果為進一步研究香蕉14-3-3蛋白對果實成熟的調(diào)控機制提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

香蕉種植于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院熱帶生物技術研究所澄邁基地，并進行正常管理。香蕉的根、莖、葉、花采自同一植株，果實飽滿度為七成，采自與根、莖、葉和花生長發(fā)育一致的其它植株。采集的材料在液氮中快速冷凍并保存在-80℃冰箱中，用于RNA的提取。

1.2 方法

1.2.1 試驗設計 選取生長發(fā)育一致的3株植株，于開花60 d后果實成熟度為七成時進行采收，運回實驗室，挑選大小一致、無機械傷害和病害的單果，在0.1%次氯酸鈉溶液里表面消毒10 min，將消毒后的果實均勻分為3組分別進行3種處理：正常成熟、乙烯誘導及1-MCP（1-Methylcyclopropene， 1-MCP）處理。正常處理的果實置于22 ℃恒溫條件下使其自然成熟；乙烯誘導果實首先放在一個密閉的容器內(nèi)，并注射入100 μL/L的乙烯，22 ℃放置18 h后，開蓋，放在22 ℃恒溫條件下成熟；1-MCP抑制處理的果實首先用1 μL/L的1-MCP溶液在密閉的保鮮盒內(nèi)處理24 h，然后取出在22 ℃恒溫條件下成熟。每個處理選取45個果實。香蕉果實成熟不同階段根據(jù)顏色變化可分為7個不同時期：全綠期（full green，F(xiàn)G）、黃色斑點期（trace yellow，TY）、綠多于黃色期（more green than yellow，MG）、黃多于綠色期（more yellow than green，MY）、綠色斑點期（green tip，GT）、全黃期（full yellow，F(xiàn)Y）、全黃并有黑色斑點期（yellow flecked with brown spots，YB）[18]。按照成熟度劃分的方法對不同處理的果實進行詳細的觀察，根據(jù)果實顏色的變化來確定果實的成熟度并進行取樣。材料在液氮中快速冷凍并保存在-80 ℃冰箱中用于提取RNA。所有樣品均至少進行3次重復取樣。

1.2.2 Ma14-3-3d和Ma14-3-3h基因的克隆及生物信息學分析 利用生物信息學的方法對模式植物的14-3-3家族的同源基因進行多序列比對分析，設計簡并引物，以香蕉的不同器官RNA反轉(zhuǎn)錄的單鏈cDNA為模板，克隆14-3-3蛋白的其他家族成員。根、莖、葉和果RNA的提取方法參照改良的CTAB法，cDNA合成參照Promega的M-MLV Transcriptase反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進行。Ma14-3-3h的克隆用簡并引物，采用降落PCR程序，以香蕉果實的cDNA文庫庫液為模板獲得，所用的簡并引物序列為：P1：5′-NGARCARGCNGARMGNTAYG-3′，P2：5′-GANGTCCANARNGTNARRTTR-3′。Ma14-3-3d的克隆采用RACE技術獲得[19]。

PCR反應體系為：10×buffer 2.5 μL，Mg2+（2.5 mmol/L）1.5 μL， cDNA單鏈1 μL，上游引物（10 pmol/μL）1 μL，下游引物（10 pmol/μL）1 μL，dNTP（dA/G/C/TTP：10 mmol/L each）0.5 μL，Taq酶（5 U/μL）0.3 μL，加水至總體積25 μL。

簡并引物的降落PCR反應程序為：94 ℃變性5 min后，先進行10個循環(huán)的降落PCR反應，94 ℃變性50 s，退火溫度由60 ℃降至50 ℃，每一個循環(huán)降1 ℃，時間45 s， 72 ℃延伸45 s；再以94 ℃變性50 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，進行30個循環(huán)，72 ℃終延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)回收后連接至T-vector PMD TM-18T（TaKaRa，Dalian，China）載體，克隆后進行測序，將所獲得的序列運用NCBI Blastx （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）進行基因的同源比對分析。根據(jù)比對分析結果，采用5′RACE和3′RACE技術克隆擴增Ma14-3-3d的5′和3′末端，詳見李美英等[19]的方法。

用Vector NTI9.0軟件進行多序列比對分析，用MEGA5.01軟件的鄰位相連（Neighbor-Joining，NJ）法構建系統(tǒng)進化樹。

1.2.3 RT-PCR 分析Ma14-3-3d和Ma14-3-3h在不同器官中的表達 分別從香蕉的根、莖、葉、花和果實中提取總RNA，用Invitrogen SuperScripTM Ⅲ反轉(zhuǎn)錄酶合成單鏈cDNA，采用RT-PCR（Reverse transcriptase-polymerase chain reaction）的方法分析香蕉14-3-3蛋白各基因在不同器官中的表達情況。香蕉果實actin基因為內(nèi)參，正向引物和反向引物分別為5′-CGAGGCTCAATCAAAGA-3′和 5′-ACCAGCAAGGTCCAAAC-3′。Ma14-3-3d和Ma14-3-3h的引物序列見表1。PCR反應體系同1.2.2。PCR反應程序為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。

1.2.4 qRT-PCR分析Ma14-3-3d 和Ma14-3-3h在香蕉果實成熟不同時期的表達變化 分別從正常成熟、乙烯催熟和1-MCP抑制處理的不同時期的果實中提取總RNA，并按照1.2.3中的方法進行cDNA第一鏈的合成，在Ma14-3-3d和Ma14-3-3h的非同源區(qū)設計基因特異性引物，以香蕉的actin基因作為內(nèi)標[2]，以不同處理、果實成熟不同時期的cDNA第一鏈為模板進行qRT-PCR分析。引物序列見表1。qRT-PCR反應體系為：SYBR Premix Ex Taq（2×）（TAKARA）12.5 μL、Rox reference DyeⅡ（50×）（TAKARA）0.5 μL、10 μmol/L的引物0.75 μL，cDNA模板1 μL，然后用水補足至20 μL。每個樣品重復3次。反應程序為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性7 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸20 s，共40個循環(huán)，循環(huán)數(shù)結束后在94～56 ℃進行融解曲線分析。采用2-ΔΔΔCT相對定量方法分析基因表達量的差異。

2 結果與分析

2.1 Ma14-3-3d和Ma14-3-3h的序列PCR擴增分析

采用簡并引物和降落PCR技術的擴增結果見圖1，PCR擴增產(chǎn)物大小約為650 bp。BLASTx序列分析結果表明，有2個不同的14-3-3基因的同源cDNA片段，分別命名為Ma14-3-3d和 Ma14-3-3h， 在Ma14-3-3d的基礎上進行5′RACE和3′RACE，擴增Ma14-3-3d的5′和3′末端[19]。

2.2 Ma14-3-3d和Ma14-3-3h基因序列的生物信息學分析

將Ma14-3-3d和Ma14-3-3h與先前獲得Ma14-3-3a、Ma14-3-3c、Ma14-3-3e和Ma14-3-3i的氨基酸序列進行多重序列比對，結果見圖2。Ma14-3-3d和Ma14-3-3h與Ma14-3-3a、Ma14-3-3c、Ma14-3-3e、Ma14-3-3i有很高的同源性，也有一定的差異性，結果見表2。 Ma14-3-3d和Ma14-3-3h與Ma14-3-3a、Ma14-3-3c、Ma14-3-3e、Ma14-3-3i與來自水稻和擬南芥的14-3-3基因進行遺傳進化分析，結果表明Ma14-3-3d與Ma14-3-3a、Ma14-3-3c、Ma14-3-3e和Ma14-3-3i同屬于non-ε類14-3-3基因，Ma14-3-3h屬于ε類14-3-3基因（圖3）。證明了ε和non-ε類14-3-3基因存在于香蕉中，但香蕉的14-3-3基因與其它植物相比具有相似性和差異性。

2.3 Ma14-3-3d和 Ma14-3-3h在香蕉不同組織器官的差異表達分析

運用RT-PCR分析Ma14-3-3d和Ma14-3-3h在香蕉不同器官中的差異表達，結果表明Ma14-3-3d在香蕉的根、莖、葉、花和果中均有表達，在莖、葉和花中的表達量高于在根和果中的表達；Ma14-3-3h在根、花和果中的表達量較高，而在莖和葉中的表達量較低（圖4）。

M：Marker；R：根；Rh：莖；L：葉；Fr：果實。

M： Marker； R： The product of PCR in root； Rh： The product of PCR in shoot； L： The product of PCR in leaf； Fr： The product of PCR in fruit.

2.4 Ma14-3-3d和 Ma14-3-3h在香蕉果實采后不同處理的表達分析

為了解Ma14-3-3d和Ma14-3-3h對香蕉果實成熟過程的調(diào)控作用，在香蕉采后成熟不同時期，采用qRT-PCR系統(tǒng)分析Ma14-3-3d和Ma14-3-3h在乙烯催熟誘導和1-MCP處理抑制下的表達變化。結果表明，Ma14-3-3d在正常成熟的果實FG期表達量最高，在TY期表達量驟然下降，在MG時期表達量升高，隨著果實的成熟，在正常成熟的其它階段從MY期一直到YB期表達量逐漸降低。在乙烯催熟的果實中，Ma14-3-3d表達量逐漸升高，一直到MY期表達量達到最高，此后在GT期表達量下降，在FY和YB階段表達量迅速下降。與正常成熟和乙烯處理果實的相比較，Ma14-3-3d在1-MCP處理果實的各個時期的表達均比較低，表明Ma14-3-3d基因的表達明顯受乙烯的誘導（圖5）。Ma14-3-3h在正常成熟、乙烯處理和1-MCP處理的果實中表達量均很低，在正常成熟各時期的平均表達量為1.115 8，在乙烯處理各時期的平均表達量為0.574 0，在1-MCP各時期的平均表達量為0.826 8，表達量變化無明顯的變化規(guī)律，因此Ma14-3-3h表達對乙烯的處理不明顯（圖5）?？傊琈a14-3-3d和Ma14-3-3h在香蕉果實成熟過程表達變化差異比較明顯，推測這2個基因在果實成熟過程中的作用可能不同。

3 討論

14-3-3蛋白是真核生物中廣泛存在的一類調(diào)控蛋白，通過識別多種靶蛋白的特異磷酸化序列而發(fā)生相互作用，參與調(diào)控真核生物的許多生命活動過程，且遺傳進化分析表明來源于不同物種的14-3-3蛋白具有很高的同源性[10-11， 13-14]。本研究中，通過簡并引物、降落PCR結合RACE技術克隆獲得的幾個香蕉14-3-3基因，并將推導的氨基酸序列進行了多重比對分析，結果發(fā)現(xiàn)Ma14-3-3d和Ma14-3-3h與Ma14-3-3a、Ma14-3-3c、 Ma14-3-3e、Ma14-3-3i具有相似性且又有差異性。

植物的14-3-3蛋白在遺傳進化上，可分為ε類和non-ε類14-3-3，在模式植物擬南芥和水稻中，ε類14-3-3基因為AtGF11、AtGF13、AtGF10、AtGF9、AtGF12、OsGF14g和OsGF14h，non-ε類14-3-3基因包括AtGF4、AtGF1、AtGF2、AtGF8、AtGF6、AtGF3、AtGF7、AtGF5、OsGF14f、OsGF14c、OsGF14d、OsGF14b、OsGF14e和OsGF14a[10]。本研究中，把在巴西蕉中克隆到的Ma14-3-3d和Ma14-3-3h與前期研究中的Ma14-3-3a、Ma14-3-3c、Ma14-3-3e和Ma14-3-3i與模式植物擬南芥和水稻中的14-3-3基因家族成員一起構建遺傳進化樹，結果發(fā)現(xiàn)Ma14-3-3d與Ma14-3-3a、Ma14-3-3c、Ma14-3-3e和Ma14-3-3i同屬于non-ε類14-3-3蛋白基因， Ma14-3-3h屬于ε類14-3-3蛋白基因。表明ε類和non-ε類14-3-3蛋白均存在于香蕉中，香蕉14-3-3基因序列的分析可為植物14-3-3蛋白在遺傳進化方面研究提供新的資料。

植物具有應對外界不同刺激的反應能力，在應對刺激反應的過程中，某些基因的表達會發(fā)生強烈的變化。14-3-3基因家族不同成員在不同植物中的表達具有組織和器官特異性，如擬南芥的GF14 chi的啟動子在根、種子、花的各種組織和發(fā)育的果實中有很強的活性[20]，水稻的14-3-3基因家族成員在不同器官和組織中的表達水平不同[21]。多種植物中轉(zhuǎn)錄組測序結果表明，植物的14-3-3家族成員在不同組織器官呈差異表達的特性[22-24]。本研究中發(fā)現(xiàn)Ma14-3-3d和Ma14-3-3h在香蕉的根、莖、葉、花和果等器官中的表達有差異，表明Ma14-3-3d和Ma14-3-3h可能在香蕉不同器官發(fā)育中具有不同的功能。

香蕉是典型的呼吸躍變型果實，其采后成熟過程中出現(xiàn)呼吸躍變高峰，并伴有大量的乙烯產(chǎn)生，同時會引起很多生理生化變化，如淀粉轉(zhuǎn)變?yōu)樘?、多酚的降解和結構碳水化合物的酶解，這些變化都影響著果實的品質(zhì)[1]。在香蕉果實成熟過程中發(fā)生的一系列生理生化變化與采后成熟過程中的基因差異表達密切相關[1]，如ACC合成酶基因[2-4]、ACC氧化酶基因[2-4]、蔗糖磷酸合成酶基因[8]。最近的研究結果表明，乙烯生物合成的關鍵限速酶ACS受14-3-3蛋白的調(diào)控[14-16]，另外在梨和番茄果實成熟過程中發(fā)現(xiàn)14-3-3蛋白基因表達顯著升高[25-26]。為探索14-3-3蛋白基因?qū)ο憬豆麑嵆墒斓恼{(diào)控機制，本課題組前期分析了幾個14-3-3蛋白基因在香蕉果實采后不同時期和不同處理情況下的表達變化，結果表明香蕉的3個14-3-3蛋白基因（Ma14-3-3a、Ma14-3-3c和 Ma14-3-3e）在果實采后成熟過程中受乙烯的強烈誘導，與果實成熟密切相關[17]。本研究詳細分析了另外2個基因Ma14-3-3d和Ma14-3-3h在香蕉采后不同時期和不同處理情況下的表達變化，結果表明Ma14-3-3d基因的表達明顯受乙烯的誘導，而Ma14-3-3h在正常成熟、乙烯處理與1-MCP處理的果實中表達量均很低，與果實成熟的相關性不明顯。推測Ma14-3-3d可能與香蕉果實成熟相關，也可能參與乙烯調(diào)控果實成熟的生物合成與信號轉(zhuǎn)導。

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