宋敏娜 姚婷婷 潘騰飛 蒲小龍 張迪 謝冬梅 潘東明

摘 要 基于紅肉蜜柚RNA-seq數(shù)據(jù)庫，篩選出50個ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族基因，其中包含11條PDR型基因。對11條柚PDR基因進行命名和生物信息學(xué)分析。同源性分析結(jié)果表明：CmPDR11-2編碼的氨基酸序列與擬南芥中轉(zhuǎn)運百草枯除草劑的AtPDR11基因同源性最高，達(dá)69.25%，利用RT-PCR技術(shù)克隆得到CmPDR11-2的ORF序列。該序列長度為4 371 bp，編碼一個含有1 456個氨基酸的蛋白質(zhì)，分子量165.138 03 ku，該蛋白屬于穩(wěn)定的親水性蛋白，無信號肽，具有12個跨膜結(jié)構(gòu)，定位于細(xì)胞膜。實時熒光定量PCR結(jié)果表明，草甘膦除草劑脅迫處理條件下，1～15 d處理組柚葉的CmPDR11-2基因相對表達(dá)量呈整體上升趨勢，且均高于對照組，反應(yīng)迅速且持久，這表明CmPDR11-2基因表達(dá)與紅肉蜜柚耐草甘膦有關(guān)。

關(guān)鍵詞 紅肉蜜柚；PDR；CmPDR11-2；克?。粚崟r熒光定量PCR

中圖分類號 S682 文獻標(biāo)識碼 A

Abstract Based on the RNA-seq database of ‘Hongrou miyou50 ABC transporter family genes were screened， including 11 PDR type genes. The nomenclature and bioinformatics analysis of 11 pomelo PDR genes were carried out. Homology analysis showed that the amino acid sequence encoded by CmPDR11-2 had the highest homology （69.25%） with the AtPDR11 gene that transports paraquat herbicides in Arabidopsis. The ORF of PDR gene was named as CmPDR11-2， which was a full-length of 4 371 bp， encoding a 1 456 amino acids with molecular weight 165.138 03 ku. The protein was stably hydrophilic， without signal peptide， with 12 transmembrane structure located in cell membrane. The results of real-time fluorescence quantitative PCR analysis showed that under the condition of glyphosate herbicide stress， the relative expression of CmPDR11-2 in the leaves treated with glyphosate for 1–15 days showed an overall upward trend， both of which were higher than the control， and the reaction was rapid and durable. This indicated that the expression of CmPDR11-2 gene was related to ‘Hong rou mi you glyphosate tolerance.

Keywords Citrus maxima ‘Hongrou miyou； PDR； CmPDR11-2； cloning； real-time fluorescence quantitative PCR

DOI 10.3969/j.issn.1000-2561.2018.09.012

植物ABC轉(zhuǎn)運蛋白又稱腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白（ATP-binding cassette transporters— ABC轉(zhuǎn)運蛋白），是目前已知最大、功能最廣泛的蛋白家族[1]，存在于植物細(xì)胞的質(zhì)膜、液泡、線粒體和過氧化物酶體中[2]，參與植物細(xì)胞生命活動的多種過程，影響產(chǎn)量和品質(zhì)形成[3]。根據(jù)HAGO系統(tǒng)（基于越橘轉(zhuǎn)錄組測序的PDR轉(zhuǎn)運蛋白基因的發(fā)掘及其表達(dá)分析）命名法，植物ABC轉(zhuǎn)運蛋白基因分為八大亞族：ABCA、ABCB、ABCC、ABCD、ABCE、ABCF、ABCG和ABCH[4]，不過目前在植物中未發(fā)現(xiàn)ABCH亞家族成員[5]，在擬南芥中，Kang等[6]將更簡單的ABC轉(zhuǎn)運蛋白命名為細(xì)菌型的ABCI家族。其中ABCG是最大的亞族，包含WBC（White-brown complex homologue）和PDR（Pleiotropic drug resistance）2種類型[7]。水生植物浮萍SpTUR2是第一個被鑒定的PDR基因[8]，隨后研究人員分別在擬南芥中鑒定出15個PDR轉(zhuǎn)運蛋白基因，水稻中鑒定出23個[9]，越橘中鑒定出21個[10]，近年來隨著基因克隆技術(shù)的發(fā)展，小麥、苜蓿和大豆等PDR基因也被克隆和鑒定出[11-14]。研究發(fā)現(xiàn)，PDR蛋白家族在植物生長素的極性轉(zhuǎn)運、脂質(zhì)的降解、外源毒素的解毒、植物抗病和氣孔的功能調(diào)節(jié)等一系列過程中都發(fā)揮作用，因而備受人們關(guān)注[15]。

我國是世界上柚類生產(chǎn)面積最大的國家，柚子營養(yǎng)價值豐富，品種多，可以迎合不同人的口味需求，具有重要的農(nóng)業(yè)價值和經(jīng)濟價值。雜草是柑橘類果樹種植過程中的大敵，因雜草造成的減產(chǎn)一般達(dá)10%～20%，嚴(yán)重時達(dá)50%以上[16]。面對瘋長的雜草，化學(xué)除草劑如草甘膦因其方便、省事、省工，成為許多柑橘果農(nóng)的首選。草甘膦能直接殺死雜草的根系，但如果長期施用除草劑，會降低土壤有效Fe和Zn的含量，并抑制柑橘對Fe和Zn的吸收。草甘膦在清除雜草的同時，也影響到了柑橘樹體的生長，主要表現(xiàn)為抑制蛋白質(zhì)的合成[17]，而且若由于操作不當(dāng)或噴藥時產(chǎn)生大量的藥霧隨風(fēng)漂移，可由果樹葉片直接吸收并傳導(dǎo)到根系，造成果樹傷根及土壤污染板結(jié)，根系吸水吸肥能力減弱甚至消失，出現(xiàn)嚴(yán)重敗根黃葉，甚至枯死[18]。所以為保證果實產(chǎn)量和品質(zhì)，在柚子生產(chǎn)過程中，應(yīng)盡量降低草甘膦造成的不良影響。

在擬南芥已鑒定的15個PDR轉(zhuǎn)運蛋白中，發(fā)現(xiàn)AtPDR11可以運輸百草枯除草劑[19]。2010和2012年分別有研究表明ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族與草甘膦抗性相關(guān)[20-21]。依據(jù)本實驗室建立的紅肉蜜柚汁胞不同發(fā)育期的RNA-seq數(shù)據(jù)庫，篩選出11條PDR轉(zhuǎn)運蛋白基因，對這11條柚PDR基因進行命名和生物信息學(xué)分析。同源性分析結(jié)果表明，CmPDR11-2編碼的氨基酸序列與擬南芥中轉(zhuǎn)運百草枯除草劑的AtPDR11基因同源性最高，達(dá)69.25%，草甘膦和百草枯都是滅生性除草劑，均只有接觸綠色組織后才有殺傷作用，兩者都能干擾葉綠素的合成和影響植物光合作用[22-23]，故推測CmPDR11-2有可能具有轉(zhuǎn)運草甘膦除草劑的功能。本研究利用RT-PCR技術(shù)從紅肉蜜柚葉片中克隆得到CmPDR11-2的ORF序列，采用實時熒光定量技術(shù)檢測草甘膦除草劑脅迫下CmPDR11-2在柚葉中的表達(dá)特性，以深入探究PDR轉(zhuǎn)運蛋白在蜜柚的外源毒素的解毒過程中的作用，對利用蜜柚中ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族基因進行耐草甘膦除草劑的品質(zhì)改良具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗材料為福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院田間實驗室種植的八年生的紅肉蜜柚的葉片。

1.2 方法

1.2.1 材料處理 選取長勢一致、外形接近的2株紅肉蜜柚植株，再分別選取長勢一致的主枝，對其中一株葉片噴灑純凈水，以做對照；另一株噴灑草甘膦。使用量為葉面開始滴水為止。為了營造脅迫環(huán)境，草甘膦使用量為正常生產(chǎn)用藥的兩倍，并加入1%的吐溫20。取處理前和處理后1、2、4、8 d和直至外觀出現(xiàn)明顯差異的第15 d共6次樣品，每個時間點取3個生物重復(fù)，洗凈表面后液氮速凍，存于80 ℃冰箱。

1.2.2 柚PDR基因的篩選 基于本實驗室擁有的紅肉蜜柚汁胞不同發(fā)育期的RNA-seq數(shù)據(jù)庫，通過在KEGG Orthology中關(guān)鍵字ATP-binding cassette篩選，得到77條目的基因，接著，將這77條目的基因在NCBI和甜橙庫BLAST后，最終篩選到50條ABC轉(zhuǎn)運蛋白基因。其中ABCA亞族2條、ABCB亞族10條、ABCC亞族9條、ABCD亞族2條、ABCG亞族22條、ABCE亞族1條、ABCF亞族3條、ABCI亞族1條。其中在ABCG亞族中有11條目的PDR基因。

為進一步確定所獲得的11條序列是否確為PDR基因，在擬南芥信息資源庫（http：//www.-arabidopsis.org/）下載擬南芥15條PDR的蛋白序列，然后使用SMART和NCBI對獲得的蛋白序列進行保守結(jié)構(gòu)域分析，以其為模板，繼續(xù)分析柚PDR的保守結(jié)構(gòu)域，然后利用MEGA 5.2軟件進行系統(tǒng)進化樹的構(gòu)建，并將柚11條PDR基因與甜橙、擬南芥數(shù)據(jù)庫進行序列比對，最后結(jié)合系統(tǒng)進化樹對其進行命名。

1.2.3 柚 PDR 基因的生物信息學(xué)分析 利用ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam/）對11條柚PDR基因編碼區(qū)進行蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)進行分析；利用Plant-mPLoc（http：//www.?csbio.?sjtu.?????-edu.cn/bioinf/plant-multi/）對其進行蛋白質(zhì)亞細(xì)胞定位預(yù)測；利用SignalP 4.1（http：//www.cbs.?dtu.?-dk/services/SignalP/）進行信號肽預(yù)測；利用（http：//www.?cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）對其進行蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測；在擬南芥數(shù)據(jù)庫（http：//www.arabidopsis.org/）查找并下載AtPDR11的氨基酸序列，利用NCBI-ORFfinder （https：// www.????ncbi.?nlm.nih.?gov/orffin?der/）查找并下載11條柚PDR基因的最大ORF的氨基酸序列，并利用DNAMAN 8軟件分別與AtPDR11進行比對。

1.2.4 總RNA提取與cDNA第一條鏈的合成 RNA提取使用多糖多酚植物總RNA快速提取試劑盒，購于北京百泰克生物技術(shù)有限公司。分別提取0、1、2、4、8、15 d的對照組和處理組的葉片的RNA。依照試劑盒說明書操作。

用于RT-PCR的逆轉(zhuǎn)錄使用TRANS生物公司的TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix 試劑盒

用于qPCR的逆轉(zhuǎn)錄使用Takara生物公司的PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒。依照試劑盒說明書操作。

1.2.5 CmPDR11-2的引物設(shè)計與合成 以紅肉蜜柚轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中GLEAN10014435為模板，利用Primer Premier 5軟件設(shè)計引物克隆CmPDR 11-2全編碼區(qū)。引物序列為CmPDR11-2-F： 5′- ATGAGTATTAGAGTGGCAGATGATCTAGCAAG-3′，CmPDR11-2-R：5′-TTATCTCCTTTGGAA?G-TTGTTGATGGCATAG-3′。委托華大基因公司合成。

利用Beacon Designer 8軟件設(shè)計引物。再利用Primer-BLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.?gov/ tools/primer-blast/）進行引物特異性分析、UNA?Fold（http：//www.idtdna.com/UNAFold）對目標(biāo)序列進行二級結(jié)構(gòu)分析、Beacon Free Edition（http：// www.premierbiosoft.com/）對引物二級結(jié)構(gòu)進行分析。最后篩選出的定量引物需要滿足引物特異性好，目標(biāo)序列無二級結(jié)構(gòu)，引物無二級結(jié)構(gòu)或者自由能低。CmPDR11-2-F：5′-CTC?ATG?ACTG-CCACCATCGC-3′，CmPDR11-2-R′：5′-GGCTGCC-CTTTCACGGTAGT-3′。委托華大基因公司合成。

1.2.6 CmPDR11-2的克隆 以紅肉蜜柚葉片的cDNA為模板，進行PCR擴增。反應(yīng)體系為25 μL，其中10×TransTaq HiFi BufferⅡ2.5 μL，dNTPs（10 mmol）2 μL，上下游引物（10 μmol）各0.5 μL，模板1 μL，TransTaq HiFi DNA polymerase 0.5 μL，加水至終體積25 μL。反應(yīng)程序為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 4 min 30 s，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后電泳檢測，將目的片段回收、連接、轉(zhuǎn)化、測序。

1.2.7 草甘膦脅迫下CmPDR11-2基因表達(dá)分析 定量PCR使用Takara生物公司的SYBR?Premix Ex Taq?（Tli RNaseH Plus），反應(yīng)體系為15 μL：SYBR Premix Ex Taq 5 μL，cDNA模板1 μL，上下游引物各0.4 μL，水3.2 μL。模板為0、1、2、4、8、15 d時對照組和草甘膦處理組的植株葉片的cDNA。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s（預(yù)變性過程）；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s，40個循環(huán)（PCR反應(yīng)過程）；95 ℃ 5 s，60 ℃ 20 s（溶解曲線分析過程）。在耶拿Qtower2.2熒光定量儀上進行qPCR，每個樣品進行3個技術(shù)重復(fù)。內(nèi)參基因為β-Actin[24]，Actin-F：5-AGAACTATGAACTGCCTGATGGC-3，Actin- R：5-GCTTGGAGCAAGTGCTGTGATT-3。利用2CT法對CmPDR11-2在柚葉中的表達(dá)進行 分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 柚PDR基因的篩選分析

結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示，擬南芥PDR基因和柚PDR基因均具有AAA+類型的ATPase的結(jié)構(gòu)，均屬于ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族。擬南芥15條PDR基因和柚11條PDR基因的系統(tǒng)進化樹如圖1所示，結(jié)果表明柚PDR基因家族與擬南芥PDR基因家族親緣關(guān)系很近，也進一步驗證了我們篩選的結(jié)果的正確性。

柚11條PDR基因與甜橙、擬南芥數(shù)據(jù)庫進行核苷酸序列比對，每條序列擬南芥比對結(jié)果以分值從高到低列出，整理得出比對分值較高的擬南芥基因有AtPDR1、AtPDR3、AtPDR6、AtPDR7、AtPDR8、AtPDR9、AtPDR11、AtPDR12、AtPDR14等共9個，這9個基因均屬于擬南芥PDR型轉(zhuǎn)運

蛋白家族基因。在與甜橙比對結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，除CmPDR12-1與甜橙基因一致度相對較低，為82%外，其他基因與比對的甜橙基因一致度均高達(dá)100%。最終確定這11條柚PDR基因篩選正確。并對柚11條PDR基因進行命名（表1）。

2.2 柚PDR基因生物信息分析結(jié)果

蛋白質(zhì)基本理化性質(zhì)預(yù)測分析顯示（表2），柚PDR基因編碼區(qū)序列長度為3 660～4 515 bp，編碼1 219～1 504個氨基酸，編碼蛋白分子量為137.731 58～170.472 48 ku，理論等電點為6.55～ 8.99，有兩個不穩(wěn)定蛋白CmPDR9和CmPDR11-3，其余穩(wěn)定，總平均親水性除CmPDR9和CmPDR1外皆為正值，推測CmPDR9和CmPDR1為親水性蛋白，其余為疏水性蛋白。信號肽預(yù)測結(jié)果顯示柚11條PDR基因均不包含信號肽；跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示11條PDR基因均具有10個以上跨膜區(qū)；亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示11條PDR基因均定位于細(xì)胞膜。與AtPDR11氨基酸序列比對結(jié)果顯示同源性最高的是CmPDR11-2，為69.25%；最低的是CmPDR9，為45.04%。

2.3 CmPDR11-2基因克隆

CmPDR11-2克隆產(chǎn)物為一條約4 400 bp的亮帶（圖2），將其連入blunt-zero克隆載體，菌液驗證后送鉑尚生物公司測序，測序結(jié)果與紅肉蜜柚轉(zhuǎn)錄本GLEAN10014435基因編碼區(qū)序列完全一致，說明已經(jīng)完全獲得了目的基因，該基因全長為4 371 bp。

2.4 草甘膦脅迫下CmPDR11-2表達(dá)分析

處理前和處理后15 d時對照組和處理組葉子外觀進行比較，處理前兩組葉片外觀正常，處理后15 d時，對照組葉片外觀依然正常，處理組葉片明顯發(fā)黃，對比明顯（圖3）。

實時熒光定量結(jié)果（圖4）顯示草甘膦處理后1～15 d，對照組CmPDR11-2基因相對表達(dá)量基本不變，處理組CmPDR11-2基因相對表達(dá)量成整體上升的趨勢，且處理前對照組和處理組基因相對表達(dá)量幾乎相等；草甘膦處理后第1天，處理組的基因相對表達(dá)量約為對照組的2.3倍，差異極顯著；第2～4天，處理組基因相對表達(dá)量約為對照組的4倍，差異極顯著；第8天，處理組的基因相對表達(dá)量約為對照組的5.7倍，差異極顯著；第15天，即外觀呈現(xiàn)明顯差異時，處理組基因相對表達(dá)量約為對照組的8倍，差異極顯著。

在草甘膦脅迫處理后1 d時，處理組與對照組就呈現(xiàn)極顯著差異，說明CmPDR11-2參與草甘膦脅迫響應(yīng)，且反應(yīng)迅速；至外觀出現(xiàn)明顯差異時，CmPDR11-2的相對表達(dá)量持續(xù)上升，說明該基因在參與草甘膦脅迫響應(yīng)時，反應(yīng)持久，這表明CmPDR11-2基因表達(dá)與紅肉蜜柚耐草甘膦有關(guān)。

3 討論

ABCG亞族是NBD-TMD反向序列結(jié)構(gòu)域類型的轉(zhuǎn)運子，包括PDR和WBC兩種類型，在目前發(fā)現(xiàn)的PDR基因只存在于真菌和植物中，并且是ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族中最多的一種類型。當(dāng)植物長期處于生物或非生物脅迫時，能夠形成多種組成型或誘導(dǎo)型防御反應(yīng)來適應(yīng)環(huán)境變化來維持生存。植物PDR轉(zhuǎn)運蛋白能夠通過轉(zhuǎn)運次生代謝物質(zhì)參與到植物誘導(dǎo)型防御反應(yīng)中，從而降低脅迫環(huán)境對植物造成的不利影響。隨著基因組測序技術(shù)的提高，植物中越來越多的PDR基因被發(fā)現(xiàn)與克隆，但幾乎都集中在模式植物如擬南芥或者水稻，且大部分功能還未闡明。目前，紅肉蜜柚基

因組測序工作已經(jīng)完成，但是關(guān)于ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族的研究還處在起步階段，本研究依據(jù)紅肉蜜柚基因組數(shù)據(jù)庫發(fā)掘出11條蜜柚PDR亞族基因，為蜜柚ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族的研究提供新思路，也可彌補在植物界對于ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族的研究都幾乎集中在模式植物的不足。

本研究通過CmPDR11-2基因的克隆及對草甘膦脅迫響應(yīng)表達(dá)規(guī)律分析，發(fā)現(xiàn)CmPDR11-2基因表達(dá)與紅肉蜜柚耐草甘膦有關(guān)。Tani等[25]發(fā)現(xiàn)外界環(huán)境能影響小蓬草草甘膦耐受型和草甘膦敏感型的關(guān)鍵ABC（EPSPS1、M10和M11）基因的表達(dá)，35 ℃、光照條件下，草甘膦耐受型植株的EPSPS1、M10和M11基因的表達(dá)量在不同濃度草甘膦脅迫下均高于草甘膦敏感型植株內(nèi)的表達(dá)量，其中EPSPS1在草甘膦1倍濃度、M10于8倍濃度、M11于1和8倍濃度下時差異最顯著，而在35 ℃、黑暗條件下時，EPSPS1、M10和M11基因表達(dá)量明顯降低，且差異不明顯，24 ℃、光照條件下時的結(jié)果與35 ℃、光照條件下非常相似，可見光照可影響ABC基因響應(yīng)草甘膦脅迫的機制。在擬南芥中，AtPDR11可以運輸百草枯除草劑，百草枯為速效觸殺型滅生性季胺鹽類除草劑，對葉綠體層膜破壞力極強，使光合作用和葉綠素合成很快中止，CmPDR11-2在柚11條PDR基因中與AtPDR11同源性最高，達(dá)69.25%，綜上，CmPDR11-2的耐草甘膦性很可能與光照條件有關(guān)。

但是本研究中處理組柚葉內(nèi)CmPDR11-2表達(dá)量何時回落正常表達(dá)水平應(yīng)進一步研究，且為了試驗的完善性，應(yīng)設(shè)置光照和黑暗條件，分別對不同濃度草甘膦脅迫下對照組和處理組柚葉內(nèi)CmPDR11-2的表達(dá)量情況進行分析。

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