張永盟，張姍姍，袁明，趙衛(wèi)星，鮑永華，楊萬才

(1 新鄉(xiāng)醫(yī)學院基礎(chǔ)醫(yī)學院，河南新鄉(xiāng)453003；2 濟寧醫(yī)學院精準醫(yī)學研究院)

細胞間隙連接是普遍存在于細胞間的膜通道結(jié)構(gòu)，由相鄰細胞膜上的兩個連接子相互連接而成。每個連接子由6個相同的連接蛋白亞單位構(gòu)成，每個亞單位即為細胞間隙連接蛋白(Cx)。Cx是一類同源四次跨膜結(jié)構(gòu)蛋白家族，具有傳遞細胞信息、協(xié)調(diào)新陳代謝、控制細胞增殖和分化以及維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定等多種生理功能[1]；其功能在不同的器官或組織具有特異性。Cx29是Cx家族成員之一，我們通過對大數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，其可能與結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展有一定相關(guān)性，但具體機制尚不清楚。本研究觀察了結(jié)直腸癌組織Cx29表達變化，現(xiàn)分析其與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料 選擇濟寧醫(yī)學院精準醫(yī)學研究院標本庫收集的2012～2014年結(jié)直腸組織蠟塊標本48例份，其中43例份包含結(jié)直腸癌組織、癌旁正常組織和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織，5例份包含結(jié)直腸癌組織和癌旁正常組織。標本來源患者男22例、女26例，年齡39～85歲、中位年齡68歲，結(jié)腸癌22例、直腸癌26例；腫瘤形態(tài)：隆起型5例，潰瘍型41例，浸潤型2例；浸潤深度：未浸透漿膜層20例，浸透漿膜層28例；組織分化程度：高中分化38例，低未分化10例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移43例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移5例。

1.2 Cx29表達檢測

1.2.1 組織芯片構(gòu)建 將48例份組織蠟塊切成厚度為4 μm切片。切片經(jīng)60 ℃烘箱烤片1 h，行HE染色。顯微鏡下標出每張切片對應(yīng)的結(jié)直腸癌組織、癌旁正常組織或轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織，同時在蠟塊上圈出其對應(yīng)位置。將組織蠟塊送武漢谷歌生物科技有限公司制成組織芯片蠟塊，然后對其切片，再將切片轉(zhuǎn)移至載玻片上制成組織芯片。為方便統(tǒng)計分析，將同一患者結(jié)直腸癌組織、癌旁正常組織或轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織依次標記位置。

1.2.2 免疫組化染色 采用SABC法。將上述制作的組織芯片于60 ℃烘箱中烤片1 h，經(jīng)二甲苯和梯度乙醇脫蠟水化，蒸鍋中加熱0.01 mol枸櫞酸鈉緩沖液至95 ℃左右，放入組織芯片加熱5 min進行抗原熱修復(fù)，自然冷卻至室溫；PBS漂洗5 min×3次，滴加3%過氧化氫室溫孵育30 min；PBS漂洗5 min×3次，山羊血清室溫封閉30 min，加入兔抗人Cx29單克隆抗體(1∶100)，4 ℃孵育過夜；取出保濕盒晾至室溫，PBS漂洗5 min×3次，加入生物素標記的山羊抗兔二抗(1∶200)室溫孵育60 min；PBS漂洗5 min×3次，加入SABC室溫孵育60 min；PBS漂洗5 min×3次，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，PBS返藍，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封固。免疫組化染色過程中癌旁正常組織6例份、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織2例份丟失，共獲取結(jié)直腸癌組織48例份、癌旁正常組織42例份、轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織41例份。

1.2.3 Cx29表達判定 Cx29陽性染色定位于細胞膜和細胞質(zhì)，呈淡黃色、黃色或棕褐色。根據(jù)染色強度對Cx29表達進行判定：淡黃色為1分，低表達；黃色為2分，中表達；棕褐色為3分，高表達。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織、癌旁正常組織和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織Cx29表達比較 見表1。

表1 不同組織類型Cx29表達比較[例(%)]

注：與癌旁正常組織比較，*P<0.05。

2.2 結(jié)直腸癌組織Cx29表達與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 見表2。

表2 結(jié)直腸癌組織Cx29表達與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

3 討論

結(jié)直腸癌是最常見的、嚴重威脅人類健康的惡性腫瘤之一。據(jù)2015年中國癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率和病死率均居所有惡性腫瘤的第五位[2]。隨著經(jīng)濟的發(fā)展，人們生活方式以及飲食結(jié)構(gòu)的改變，結(jié)直腸癌的發(fā)病率和病死率均有顯著上升趨勢。腫瘤形成是一個長期的過程，需要經(jīng)歷多個階段，涉及多種基因。近年來通過人類基因組計劃研究了解人類基因組后，能夠從基因水平上認識疾病，繼而從根本上治療或預(yù)防人類疾病。故腫瘤發(fā)生、發(fā)展的分子機制及靶向治療備受關(guān)注。為了提高結(jié)直腸癌患者的臨床治療效果和生存期，探尋特異的分子靶標指導(dǎo)臨床決策就顯得尤為重要。

Cx幾乎存在于哺乳動物的所有組織和細胞中，現(xiàn)已知其家族中至少有21位成員，其基因序列具有高度同源性，通常以不同的組合方式或不同的組合存在于不同組織和細胞中[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，6個多方形的Cx組成1個半通道，2個半通道相互對接形成1個親水性孔道；而形成的半通道可以是相同的，也可以是不同的，2個半通道對接到一起，形成相同的通道(同質(zhì)連接)或不同的通道(異質(zhì)連接)[4]。這些通道能直接參與細胞內(nèi)外信息傳遞，如細胞內(nèi)代謝產(chǎn)物、第二信使以及電信號等[5]。目前已證實，在腫瘤和轉(zhuǎn)化細胞中普遍存在細胞間隙連接功能缺陷和Cx表達異常。Cx在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上可聚集合成功能型六聚連接小體[6]。亞細胞分離研究和免疫定位研究表明，Cx通過高爾基體到達細胞膜[7～9]。除此之外，Cx在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)合成，高爾基體加工修飾后進入細胞質(zhì)中，經(jīng)轉(zhuǎn)運小體到達細胞膜[10]。目前關(guān)于Cx家族成員Cx26、Cx32、Cx43等與腫瘤的關(guān)系已有較深入研究[11]。Cx43在前列腺癌進展的不同時期作用不同，前列腺癌早期Cx43表達缺失可促進腫瘤進展，而在晚期骨轉(zhuǎn)移過程中Cx43表達可增強腫瘤細胞的侵襲力和附著力，這種現(xiàn)象在體內(nèi)外實驗均得到驗證[12]。在乳腺癌中同樣發(fā)現(xiàn)Cx43表達可促進腫瘤細胞遷移[13]。而在肝細胞癌中Cx32可通過Snail介導(dǎo)的EMT信號通路來抑制肝癌細胞侵襲[14]。現(xiàn)已證實，Cx43與結(jié)直腸癌、乳腺癌及前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展和患者預(yù)后有關(guān)[15～19]。Cx29定位于人類染色體7q22.1，由279個氨基酸組成，分子量為31.299 kD。有研究發(fā)現(xiàn)，Cx29基因突變可導(dǎo)致Cx在細胞質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中表達增高，從而促進非綜合征型耳聾的發(fā)生[20]。亦有報道，Cx29蛋白并沒有形成功能性間隙蛋白通道，而是增強HeLa細胞中能量釋放[21]。但Cx29與腫瘤的關(guān)系，特別是與結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，國內(nèi)外鮮見報道。

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織及轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)組織Cx29高表達明顯高于癌旁正常組織，結(jié)直腸癌組織Cx29高表達與腫瘤組織分化程度有關(guān)，提示Cx29高表達可能促進結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展。本研究同期分析了人類蛋白圖譜數(shù)據(jù)庫、美國癌癥基因圖譜TCGA中438例結(jié)直腸癌患者臨床資料，其中Cx29低表達者138例、Cx29高表達者300例，在長達12年的隨訪中，Cx29高表達者生存時間明顯短于Cx29低表達者，說明Cx29表達變化有可能作為結(jié)直腸癌患者預(yù)后判斷的生物學標志物。但由于本研究未對患者進行隨訪觀察，這個結(jié)論尚需進一步驗證。

綜上所述，結(jié)直腸癌組織Cx29高表達，其表達變化與腫瘤組織分化程度有關(guān)。但目前對Cx29的具體作用機制尚不清楚，今后還需要進一步深入研究。

參考文獻：

[1] Spicer SS, Schulte BA. The fine structure of spiral ligament cells relates to ion return to the stria and varies with place-frequency[J]. Hear Res, 1996,100(1-2):80-100.

[2] Chen W, Zheng R, Baade PD, et al. Cancer statistics in China, 2015[J]. CA Cancer J Clin， 2016,66(2):115-132.

[3] Haefliger JA, Bruzzone R, Jenkins NA, et al. Four novel members of the connexin family of gap junction proteins. Molecular cloning, expression, and chromosome mapping[J]. J Biol Chem, 1992,267(3):2057-2064.

[4] Willecke K, Eiberger J, Degen J, et al. Structural and functional diversity of connexin genes in the mouse and human genome[J]. Biol Chem, 2002,383(5):725-737.

[5] Spicer SS, Schulte BA. Evidence for a medial K+recycling pathway from inner hair cells[J]. Hear Res, 1998,118(1-2):1-12.

[6] Falk MM, Buehler LK, Kumar NM, et al. Cell-free synthesis and assembly of connexins into functional gap junction membrane channels[J]. EMBO J, 1997,16(10):2703-2716.

[7] Musil LS, Goodenough DA. Biochemical analysis of connexin43 intracellular transport, phosphorylation, and assembly into gap junctional plaques[J]. J Cell Biol, 1991,115(5):1357-1374.

[8] Falk MM, Kumar NM, Gilula NB. Membrane insertion of gap junction connexins: polytopic channel forming membrane proteins[J]. J Cell Biol, 1994,127(2):343-355.

[9] Laird DW, Castillo M, Kasprzak L. Gap junction turnover, intracellular trafficking, and phosphorylation of connexin43 in brefeldin A-treated rat mammary tumor cells[J]. J Cell Biol, 1995,131(5):1193-1203.

[10] Naus CC, Laird DW. Implications and challenges of connexin connections to cancer[J]. Nat Rev Cancer, 2010,10(6):435-441.

[11] Radic＇ J, Kru?lin B,amija M, et al. Connexin 43 expression in primary colorectal carcinomas in patients with stage Ⅲ and Ⅳ Disease[J]. Anticancer Res, 2016,36(5):2189-2196.

[12] Lamiche C, Clarhaut J, Strale PO, et al. The gap junction protein Cx43 is involved in the bone-targeted metastatic behaviour of human prostate cancer cells[J]. Clin Exp Metastasis, 2012,29(2):111-122.

[13] Tsai CF, Cheng YK, Lu DY, et al. Inhibition of estrogen receptor reduces connexin 43 expression in breast cancers[J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2018(338):182-190.

[14] Yang Y, Zhang N, Zhu J, et al. Downregulated connexin32 promotes EMT through the Wnt/β-catenin pathway by targeting Snail expression in hepatocellular carcinoma[J]. Int J Oncol， 2017,50(6):1977-1988.

[15] Wang S, Zhang S, Zhao Z, et al. Connexin 43 enhances paclitaxel cytotoxicity in colorectal cancer cell lines[J]. Exp Ther Med, 2017,14(2):1212-1218.

[16] Wang Y, Zhang C, Zhang S, et al. Kanglaite sensitizes colorectal cancer cells to Taxol via NF-κΒ inhibition and connexin 43 upregulation[J]. Sci Rep, 2017,7(1):1280.

[17] Kańczuga-Koda L, Sulkowska M, Koda M, et al. Expression of connexin 43 in breast cancer in comparison with mammary dysplasia and the normal mammary gland[J]. Folia Morphol (Warsz), 2003,62(4):439-442.

[18] Xu N, Chen HJ, Chen SH, et al. Reduced Connexin 43 expression is associated with tumor malignant behaviors and biochemical recurrence-free survival of prostate cancer[J]. Oncotarget, 2016,7(41):67476-67484.

[19] Piwowarczyk K, Paw M, Ryszawy D, et al. Connexin43 high prostate cancer cells induce endothelial connexin43 up-regulation through the activation of intercellular ERK1/2-dependent signaling axis[J]. Eur J Cell Biol, 2017,96(4):337-346.

[20] Hong HM, Yang JJ, Su CC, et al. A novel mutation in the connexin 29 gene may contribute to nonsyndromic hearing loss[J]. Hum Genet, 2010,127(2):191-199.

[21] Liang WG, Su CC, Nian JH, et al. Human connexin30.2/31.3 (GJC3) does not form functional gap junction channels but causes enhanced ATP release in HeLa cells[J]. Cell Biochem Biophys, 2011,61(1):189-197.