薛松，張磊，單長(zhǎng)鳳，吳正升

(1 淮南市第一人民醫(yī)院，安徽淮南232007；2 安徽醫(yī)科大學(xué)病理學(xué)教研室)

目前對(duì)結(jié)直腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移的機(jī)制尚不完全清楚，普遍認(rèn)為是多個(gè)基因共同參與的結(jié)果[1～3]。LIM和SH3蛋白1(LASP1)是一個(gè)近年發(fā)現(xiàn)的與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白，其在肝癌、乳腺癌等腫瘤組織中過(guò)表達(dá)，并與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[4]?；|(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)是MMP家族中的重要成員，可通過(guò)降解基底膜和細(xì)胞外基質(zhì)中的Ⅳ型膠原，促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移；還可促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞遷移，加快新生血管形成，進(jìn)一步促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[5，6]。目前國(guó)內(nèi)關(guān)于LASP1、MMP-9在結(jié)直腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移中作用的研究較少。本研究觀察了結(jié)直腸癌組織LASP1、MMP-9蛋白表達(dá)變化，現(xiàn)分析二者表達(dá)的關(guān)系及其與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系，旨在探討其在結(jié)直腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用。現(xiàn)分析結(jié)果并報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2014年1月～2016年12月淮南市第一人民醫(yī)院收治的結(jié)直腸癌患者70例，男40例、女30例，年齡(64.71±9.52)歲。術(shù)前均未行任何抗腫瘤治療，術(shù)后經(jīng)組織病理檢查明確診斷。腫瘤直徑：≤5 cm 58例，>5 cm 12例；組織分化程度：高分化7例，中分化54例，低分化9例；臨床分期：Ⅰ、Ⅱ期45例，Ⅲ、Ⅳ期25例；有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移25例，無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移45例。本研究經(jīng)淮南市第一人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，患者均知情同意。

1.2 LASP1、MMP-9表達(dá)檢測(cè) 采用免疫組化EnVision兩步法。取手術(shù)切除的結(jié)直腸癌組織及其配對(duì)的癌旁正常組織(距癌組織邊緣>5 cm)，10%甲醛固定，石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片。切片常規(guī)脫蠟至水，3% H2O2去離子水孵育10 min以滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；蒸鍋中加熱0.01 mol枸櫞酸緩沖液至95 ℃，放入切片水浴15～20 min，自然冷卻至室溫；10%山羊血清封閉，分別加入LASP1(1∶500)、MMP-9(1∶200)一抗，4 ℃孵育過(guò)夜；次日加入二抗和辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素37 ℃孵育30 min；DAB顯色，蘇木素復(fù)染，樹(shù)脂封固，顯微鏡下觀察。以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對(duì)照，用已知陽(yáng)性標(biāo)本作為陽(yáng)性對(duì)照。①LASP1陽(yáng)性表達(dá)判定：LASP1陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色或棕褐色顆粒。每張切片隨機(jī)選取10個(gè)200倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，觀察細(xì)胞染色強(qiáng)度，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞所占比例。細(xì)胞染色強(qiáng)度：不著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽(yáng)性細(xì)胞所占比例：無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0分，≤10%為1分，>10%～≤50%為2分，>50%～≤75%為3分，>75%為4分。染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞所占比例得分乘積≥2分為L(zhǎng)ASP1陽(yáng)性表達(dá)[7]。②MMP-9陽(yáng)性表達(dá)判定：MMP-9陽(yáng)性表達(dá)定位于細(xì)胞質(zhì)，呈棕黃色或棕褐色顆粒。每張切片隨機(jī)選取10個(gè)200倍視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，觀察細(xì)胞染色強(qiáng)度，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞所占比例。細(xì)胞染色強(qiáng)度：不著色為0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；陽(yáng)性細(xì)胞所占比例：≤5%為0分，>5%～≤25%為1分，>25%～≤50%為2分，>50%～≤75%為3分，>75%為4分。細(xì)胞染色強(qiáng)度和陽(yáng)性細(xì)胞所占比例得分相加≥2分MMP-9陽(yáng)性表達(dá)[6]。所有切片由2名病理科醫(yī)師盲法獨(dú)立閱片，結(jié)果不一致時(shí)協(xié)商判定。

1.3 結(jié)直腸癌組織LASP1、MMP-9陽(yáng)性表達(dá)的關(guān)系及二者與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系分析 采用Spearman非參數(shù)相關(guān)分析法分析結(jié)直腸癌組織LASP1陽(yáng)性表達(dá)與MMP-9陽(yáng)性表達(dá)的關(guān)系。收集結(jié)直腸癌患者性別、年齡、腫瘤直徑、組織分化程度、臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移資料，分析LASP1、MMP-9陽(yáng)性表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Spearman非參數(shù)相關(guān)分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌組織與癌旁正常組織LASP1、MMP-9陽(yáng)性表達(dá)比較 結(jié)直腸癌組織與癌旁正常組織LASP1陽(yáng)性表達(dá)率分別為64.3%(45/70)、35.7%(25/70)，MMP-9陽(yáng)性表達(dá)率分別為58.6%(41/70)、27.1%(19/70)。二者比較P均<0.05。

2.2 結(jié)直腸癌組織LASP1陽(yáng)性表達(dá)與MMP-9陽(yáng)性表達(dá)的關(guān)系 Spearman非參數(shù)相關(guān)分析顯示，結(jié)直腸癌組織LASP1陽(yáng)性表達(dá)與MMP-9陽(yáng)性表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(r=0.664，P<0.01)。

2.3 結(jié)直腸癌組織LASP1、MMP-9陽(yáng)性表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 見(jiàn)表1。

3 討論

LASP1最初由Christine于1995年首次報(bào)道，主要結(jié)構(gòu)域由氨基端的一個(gè)LIM(Lin/Is1/Mec)和兩段伴肌動(dòng)蛋白樣重復(fù)序列和羧基端一個(gè)scr同源結(jié)構(gòu)域(SH3)組成[8]。LASP1蛋白是LIM蛋白亞家族成員之一，通過(guò)LIM結(jié)構(gòu)的介導(dǎo)與細(xì)胞膜上突起的肌動(dòng)蛋白直接發(fā)生作用，還可通過(guò)SH3區(qū)域在細(xì)胞偽足形成、延伸及侵襲方面發(fā)揮作用[9]。近年研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌、卵巢癌、肝癌等組織中LASP1過(guò)表達(dá)，其表達(dá)變化與腫瘤發(fā)生、發(fā)展及侵襲、轉(zhuǎn)移有關(guān)[10～12]。本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌組織LASP1陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織；LASP1陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，而與患者性別、年齡、腫瘤直徑、組織分化程度無(wú)關(guān)。提示LASP1可能參與結(jié)直腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，與上述報(bào)道基本一致。

表1 結(jié)直腸癌組織LASP1、MMP-9陽(yáng)性表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系

細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的降解破壞是腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中的關(guān)鍵步驟之一。MMPs是一組重要的蛋白水解酶家族，通過(guò)降解細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜成分以及一些非基質(zhì)成分，改變腫瘤細(xì)胞微環(huán)境，繼而促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移。MMP-9作為MMPs的一個(gè)亞型，除參與降解細(xì)胞外基質(zhì)外，還參與腫瘤新生血管形成及調(diào)節(jié)細(xì)胞黏附等作用，在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮重要作用[13]。Tsai等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在具有侵襲和轉(zhuǎn)移能力的口腔鱗癌細(xì)胞中MMP-9表達(dá)明顯升高，說(shuō)明MMP-9高表達(dá)可能與口腔鱗癌的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織MMP-9陽(yáng)性表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織；MMP-9陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，而與患者性別、年齡、腫瘤直徑、組織分化程度無(wú)關(guān)。提示MMP-9可能參與結(jié)直腸癌的侵襲和轉(zhuǎn)移，與上述報(bào)道基本一致。

本研究還發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌組織LASP1陽(yáng)性表達(dá)與MMP-9陽(yáng)性表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系，說(shuō)明二者在促進(jìn)結(jié)直腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中可能具有協(xié)同作用。

綜上所述，結(jié)直腸癌組織LASP1、MMP-9表達(dá)升高；二者表達(dá)變化可協(xié)同促進(jìn)結(jié)直腸癌侵襲和轉(zhuǎn)移。

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