宋蒨,石紅建,任景麗,黃優(yōu)華,徐強(qiáng),孫鐘武,張中平
(1 江蘇大學(xué)附屬武進(jìn)醫(yī)院,江蘇常州213002;2 鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院)
據(jù)統(tǒng)計,約95%結(jié)直腸癌為散發(fā)性結(jié)直腸癌(SCC)[1,2],而15% SCC是由錯配修復(fù)基因(MMR)蛋白表達(dá)缺失引起的[3]。目前在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的MMR有9種,即hMLH1、hMLH3、hPMS1、hPMS2、hMSH2、hMSH3、hMSH4、hMSH5、hMSH6,其作用主要是識別錯配位點并予以糾正,以保證DNA復(fù)制的準(zhǔn)確性。如MMR發(fā)生突變,將引起機(jī)體錯配修復(fù)功能缺失,導(dǎo)致整個基因組不穩(wěn)定,從而使某些癌基因或突變的抑癌基因快速聚集,繼而形成腫瘤[4]。在MMR中,hMLH1、hMSH2、hMSH6突變約占MMR突變的90%以上[5,6]。本研究觀察了SCC組織MMR蛋白表達(dá)變化,現(xiàn)分析其表達(dá)變化與患者臨床病理參數(shù)和預(yù)后的關(guān)系。
1.1 基本資料 研究對象為2009年6月~2012年6月在江蘇大學(xué)附屬武進(jìn)醫(yī)院行手術(shù)治療的SCC患者180例,均經(jīng)術(shù)后組織病理檢查明確診斷?;颊吣?8例、女82例,年齡60~86(70.89±8.13)歲;腫瘤直徑:≥5 cm 76例,<5 cm 104例;腫瘤形態(tài):潰瘍型95例,隆起型47例,浸潤型38例;腫瘤部位:右半結(jié)腸106例,左半結(jié)腸或直腸74例;病理類型:腺癌136例,黏液腺癌或其他類型44例;TNM分期[7]:Ⅱ期86例,Ⅲ期94例;組織分化程度:高分化68例,中低分化112例;有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移94例,無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移86例。術(shù)后每3個月隨訪1次,隨訪方式包括門診及住院復(fù)查、電話隨訪等。隨訪截至2017年6月,中位隨訪時間60個月,死亡68例。
1.2 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件。計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。生存分析采用Kaplan-Meier法,生存率比較采用Log-rank檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
1.3 SCC組織hMLH1、hMSH2、hMSH6蛋白表達(dá)檢測 取手術(shù)切除的SCC組織,采用免疫組化法檢測hMLH1、hMSH2、hMSH6蛋白表達(dá)。以正常結(jié)直腸黏膜上皮作為陽性對照,用PBS代替一抗作為陰性對照。結(jié)果判斷:MMR蛋白定位于細(xì)胞核,以細(xì)胞核出現(xiàn)棕黃色或黃褐色顆粒為陽性細(xì)胞。隨機(jī)選取5個200倍視野,每個視野計數(shù)100個細(xì)胞,計算陽性細(xì)胞所占比例。根據(jù)染色強(qiáng)度和陽性細(xì)胞所占比例綜合判斷MMR蛋白表達(dá)。染色強(qiáng)度:無著色為0分,淡黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分。陽性細(xì)胞所占比例:無陽性細(xì)胞為0分,≤10%為1分,>10%~≤50%為2分,>50%~≤75%為3分,>75%為4分。兩項評分的乘積>3分為MMR蛋白表達(dá)正常,≤3分為MMR蛋白表達(dá)缺失。hMLH1、hMSH2、hMSH6蛋白均正常表達(dá)為正常表達(dá)(pMMR),至少一項蛋白表達(dá)缺失即為陰性表達(dá)(dMMR)。本組MMR蛋白表達(dá)缺失29例,表達(dá)缺失率為16.1%。其中hMLH1蛋白表達(dá)缺失19例,hMSH2蛋白表達(dá)缺失13例,hMSH6蛋白表達(dá)缺失10例;僅hMLH1蛋白表達(dá)缺失11例,僅hMSH2蛋白表達(dá)缺失4例,僅hMSH6蛋白表達(dá)缺失3例,hMLH1、hMSH2蛋白表達(dá)均缺失4例,hMSH2、hMSH6蛋白表達(dá)均缺失3例,hMLH1、hMSH6蛋白表達(dá)均缺失2例,hMLH1、hMSH2、hMSH6蛋白表達(dá)均缺失2例。本組pMMR 29例,dMMR151例。
1.4 SCC組織MMR蛋白表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系 見表1。
表1 SCC組織MMR蛋白表達(dá)與患者臨床病理參數(shù)的關(guān)系(例)
1.5 不同MMR表達(dá)者5年無病生存率及5年總生存率比較 采用Kaplan-Meier法繪制生存時間曲線,經(jīng)Log-rank檢驗,dMMR者與pMMR者5年無病生存率分別為75.9%(22/29)、43.7%(66/151),5年總生存率分別為82.8%(24/29)、58.3%(88/151),兩者比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(χ2分別為10.872、6.044,P均<0.01)。見圖1、2。
1993年Lothe等[8]發(fā)現(xiàn)了一條新的可導(dǎo)致SCC途徑——MMR途徑。MMR蛋白的主要功能是保證基因復(fù)制的精確性,在DNA復(fù)制過程中出現(xiàn)堿基錯配時,MMR識別并予以修復(fù),以保證基因組穩(wěn)定性。如MMR發(fā)生突變,將引起錯配修復(fù)功能缺失,導(dǎo)致整個基因組不穩(wěn)定,從而使某些癌基因或突變的抑癌基因快速聚集,繼而形成腫瘤[4]。
圖1 不同MMR表達(dá)SCC患者無病生存時間曲線
圖2 不同MMR表達(dá)SCC患者總生存時間曲線
目前已在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)了9種MMR蛋白,任意一個MMR蛋白表達(dá)缺失,均會導(dǎo)致MMR系統(tǒng)功能缺失。在MMR突變中,hMLH1、hMSH2、hMSH6突變超過90%。hMLH1、hMSH2、hMSH6多形成異源二聚體發(fā)揮作用,可特異性識別核苷酸鏈上的錯配位點,并進(jìn)行切除、修復(fù)。hMLH1蛋白在錯配修復(fù)過程中主要參與核酸內(nèi)切酶激活,在切開堿基及解除雙螺旋過程中發(fā)揮重要作用,并參與合成新的核苷酸鏈;還可與hPMS1形成Mutlα,糾正錯誤插入的堿基。hMSH2是最早發(fā)現(xiàn)的MMR蛋白,其表達(dá)于所有正常結(jié)直腸黏膜,通過與hMLH1蛋白結(jié)合形成異源二聚體hMutLα,hMutLα識別并結(jié)合錯配修復(fù)的堿基,繼而激活核酸內(nèi)切酶,切除錯配的堿基。hMSH6具有ATP酶活性,在錯配修復(fù)過程中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用,還可與hMSH2蛋白形成二聚體,接受ATP供能,與相應(yīng)的錯配堿基結(jié)合并將其游離。在DNA復(fù)制過程發(fā)生堿基錯配后,MMR系統(tǒng)啟動修復(fù)。修復(fù)過程包括錯配堿基識別、MMR蛋白聚集、錯配堿基修復(fù)。相應(yīng)的MMR蛋白在形成異二聚體后,切除包含錯配堿基的DNA片段,然后補(bǔ)充新合成的正確DNA片段,以確?;蛐畔?zhǔn)確。當(dāng)MMR基因發(fā)生突變或修飾后,MMR蛋白表達(dá)缺失,繼而MMR功能缺失,最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[9]。MMR蛋白低表達(dá)可降低基因錯配修復(fù)功能,增加腫瘤發(fā)生的易感性。其引起腫瘤發(fā)生的機(jī)制:①MMR功能缺失可引起基因組變化,造成簡單重復(fù)序列的累積,發(fā)生微衛(wèi)星不穩(wěn)定,而微衛(wèi)星不穩(wěn)定可造成某些癌基因的激活,進(jìn)一步誘發(fā)腫瘤[10];②MMR系統(tǒng)缺陷會直接造成某些原癌基因和抑癌基因突變,如無法及時糾正,將導(dǎo)致癌基因異常表達(dá)、累積,最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生。
本研究結(jié)果顯示,SCC組織MMR蛋白表達(dá)缺失率達(dá)16.1%,與Ghanipour等[11]研究結(jié)果基本一致。既往研究發(fā)現(xiàn),MMR蛋白表達(dá)缺失與腫瘤某些臨床病理特征有關(guān)[12,13]。本研究發(fā)現(xiàn),MMR蛋白表達(dá)缺失與腫瘤直徑、TNM分期、組織分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),與既往研究[14,15]結(jié)果基本一致。有研究發(fā)現(xiàn),MMR蛋白表達(dá)變化與腫瘤患者預(yù)后密切相關(guān)[14,16];以5-Fu為基礎(chǔ)的化療可延長結(jié)直腸癌患者生存時間,提高患者5年生存率[17]。但也有研究認(rèn)為,dMMR者無法從以5-Fu為基礎(chǔ)的化療方案中獲益,對TNM分期為Ⅱ期的dMMR者甚至有害[18]。本研究發(fā)現(xiàn),dMMR者5年無病生存率及總生存率均高于pMMR者。提示dMMR者預(yù)后相對較好,可能與MMR可增強(qiáng)患者免疫監(jiān)視功能有關(guān)[19],也可能與腫瘤組織胸苷合成酶和二氫嘧啶脫氫酶過表達(dá)有關(guān)[13]。
綜上所述,SCC組織可出現(xiàn)MMR蛋白表達(dá)缺失,其表達(dá)變化與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及患者預(yù)后有關(guān)。
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