邱佳慧，紀(jì)立金

(福建中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，福州 350122)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種以持續(xù)性認(rèn)知功能衰退為表現(xiàn)的進(jìn)行性腦退化疾病。近年來，各項(xiàng)研究均佐證了脾腦相關(guān)理論，如強(qiáng)脾補(bǔ)精化瘀益智法組成的強(qiáng)脾補(bǔ)精化瘀益智膠囊具有提高學(xué)習(xí)記憶能力的作用[1]，可保護(hù)膽堿能神經(jīng)元，同時(shí)利于受損神經(jīng)元的再生修復(fù)，進(jìn)而治療AD[2]。錢會(huì)南[3]等研究發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用調(diào)理脾胃之方對(duì)癲癇、癡呆、抑郁癥等神志病都有良好的防治效果。P物質(zhì)(substance P，SP)廣泛分布于中樞及消化系統(tǒng)中，是發(fā)揮相應(yīng)生理作用的腦腸肽。認(rèn)為SP是脾(腸、胃)腦共同的物質(zhì)基礎(chǔ)，推測(cè)SP與腦、脾胃之間存在雙向調(diào)控，是脾腦相互作用的媒介。健脾益智法是以健脾為主，少佐補(bǔ)精化瘀祛濁，達(dá)生志益智除呆之目的的治療方法。本實(shí)驗(yàn)以AD大鼠為載體，以其空間學(xué)習(xí)記憶能力及海馬區(qū)、大腸區(qū)腦腸肽SP表達(dá)水平為研究對(duì)象，探討健脾益智法對(duì)其空間學(xué)習(xí)記憶能力改善情況，對(duì)AD大鼠海馬區(qū)、大腸區(qū)腦腸肽SP表達(dá)水平的影響及其關(guān)聯(lián)，挖掘脾腦相關(guān)理論的微觀機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

清潔級(jí)7周齡SD大鼠40只，雌雄各半，體質(zhì)量(250±10) g，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司提供(動(dòng)物許可證號(hào)SCXK(滬)2012-0002)。

1.2 藥物

以健脾益智法為組方原則，按人參10 g、黃芪20 g、白術(shù)20 g、制何首烏15 g、菖蒲6 g、遠(yuǎn)志6 g、水蛭3 g比例組成，制備成健脾益智混懸液(0.5 g/ml)。

1.3 試劑及儀器

試劑：Aβ1-40(Sigma、A1075)，PBS (1×)、10%水合氯醛、碘伏、75%酒精、0.9%氯化鈉注射液、無水乙醇、即用型SABC-POD(小鼠/兔IgG)試劑盒(博士德，SA1020)、DAB顯色試劑盒(黃)(博士德，AR1022)、黏附載玻片、顯微鏡蓋玻片、Anti-Substance P antibody(ab14184)、多聚甲醛。儀器：腦立體定位儀、微量注射針、Morris水迷宮、-80℃超低溫冰箱、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、生物組織烤片機(jī)、石蠟切片機(jī)、Olympus顯微鏡。

2 方法

2.1 制作AD大鼠模型

參考唐軍等方法[4]制作AD大鼠模型，其中Aβ1-40溶液注射區(qū)域?yàn)橛覀?cè)海馬齒狀回背側(cè)細(xì)胞，注射坐標(biāo)參考包新民腦立體定位圖譜。造模后4周，借助行為學(xué)檢測(cè)判斷AD造模是否成功。

2.2 分組灌胃給藥

采用隨機(jī)數(shù)字表法將40只清潔級(jí)SD大鼠分成4組，造模4周后剔除造模失敗和術(shù)后死亡的大鼠，假手術(shù)組6只，模型對(duì)照組7只，中藥組10只，西藥組8只，開始為期4周每日1次的灌胃。中藥組給予健脾益智混懸液(14.4 ml/kg/d)，西藥組給予吡拉西坦混懸液(14.4 ml/kg/d)，其他組給予等量0.9%氯化鈉溶液(14.4 ml/kg/d)。大鼠給藥劑量按《中藥藥理研究方法學(xué)》所提供的“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人按體表面積等效劑量換算比率表”倍數(shù)折算。

2.3 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

通過Morris水迷宮的定位航行實(shí)驗(yàn)和空間探索實(shí)驗(yàn)，反映學(xué)習(xí)和記憶的基本情況。

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)歷時(shí)5 d，前4 d是定位航行實(shí)驗(yàn)，即每天于固定時(shí)段將大鼠面對(duì)池壁，分別從4個(gè)不同入水點(diǎn)放入水中，進(jìn)行尋找水下平臺(tái)訓(xùn)練，由錄像系統(tǒng)記錄大鼠找到平臺(tái)的時(shí)間，即逃避潛伏期。第5天是空間探索實(shí)驗(yàn)，即撤除原水下平臺(tái)，隨機(jī)擇一入水點(diǎn)將大鼠面對(duì)池壁放入水中，由錄像系統(tǒng)記錄大鼠在最大潛伏期內(nèi)的跨越平臺(tái)次數(shù)。

2.4 免疫組化方法檢測(cè)大鼠海馬區(qū)、大腸區(qū)腦腸肽SP表達(dá)水平

Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，麻醉大鼠，4%多聚甲醛灌注固定，冰上取腦、大腸石蠟包埋、切片，采用免疫組化法測(cè)定大鼠海馬區(qū)、大腸區(qū)腦腸肽SP的表達(dá)水平。光學(xué)倒置顯微鏡高倍(10×20倍)下隨機(jī)選取3個(gè)視野，通過圖像分析軟件Fiji進(jìn)行平均光密度檢測(cè)，取平均值作為檢測(cè)值。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表1顯示，定位航行實(shí)驗(yàn)中與模型對(duì)照組、西藥組比較，中藥組逃避潛伏期明顯降低(P<0.05)，與假手術(shù)組比較，模型對(duì)照組逃避潛伏期明顯升高(P<0.05)，其余組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)?？臻g探索實(shí)驗(yàn)中，與模型對(duì)照組比較，中藥組、西藥組跨越平臺(tái)次數(shù)明顯升高(P<0.05)，與假手術(shù)組比較，模型對(duì)照組跨越平臺(tái)次數(shù)明顯降低(P<0.05)，其余組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。說明健脾益智混懸液可明顯縮短逃避潛伏期，明顯增加跨越平臺(tái)次數(shù)，西藥吡拉西坦僅能明顯增加跨越平臺(tái)次數(shù)。

表1 各組大鼠逃避潛伏期(s)和跨越平臺(tái)次數(shù)(次)比較

注：與假手術(shù)組比較：aP<0.05；與模型對(duì)照組比較：bP<0.05；與西藥組比較：cP<0.05

3.2 各組大鼠海馬區(qū)、大腸區(qū)腦腸肽SP免疫組化實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2圖1顯示，與假手術(shù)組、模型對(duì)照組、西藥組比較，中藥組海馬區(qū)腦腸肽SP表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。與模型對(duì)照組比較，西藥組海馬區(qū)腦腸肽SP表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。表2圖2顯示，與模型對(duì)照組、西藥組比較，中藥組大腸區(qū)腦腸肽SP表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。與模型對(duì)照組比較，西藥組大腸區(qū)腦腸肽SP表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。由此說明，健脾益智混懸液可上調(diào)AD大鼠海馬區(qū)、大腸區(qū)腦腸肽SP表達(dá)水平，西藥吡拉西坦不能上調(diào)AD大鼠海馬區(qū)、大腸區(qū)腦腸肽SP表達(dá)水平。

表2 各組大鼠海馬區(qū)、大腸區(qū)腦腸肽SP表達(dá)水平比較

注：與假手術(shù)組比較：aP<0.05，bP<0.01；與模型對(duì)照組比較：cP<0.01；與西藥組比較：dP<0.01

圖1 各組大鼠海馬區(qū)腦腸肽SP的表達(dá)(DAB顯色)注：圖1中箭頭所示之處為典型陽性表達(dá)區(qū)域，屬海馬組織的CA1區(qū)

圖2 各組大鼠大腸區(qū)腦腸肽SP的表達(dá)(DAB顯色)注：圖2中箭頭所示之處為典型陽性表達(dá)區(qū)域，屬升結(jié)腸組織的黏膜層

4 討論

健脾益智法通過健脾胃，利用機(jī)體脾腦關(guān)系，間接益智為主，輔以益智中藥直接益智，間接與直接雙管齊下，以達(dá)療效。AD的病理是以脾虛為核心，兼以精虧、濁瘀，治療當(dāng)以補(bǔ)脾益智為主，與健脾益智法旨意相合，認(rèn)為健脾益智法是治療AD的有效治法。本研究創(chuàng)建健脾益智混懸液，方中人參10 g、黃芪20 g、白術(shù)20 g為君，甘溫入脾，大補(bǔ)脾氣，輔以何首烏15 g補(bǔ)益腎精，石菖蒲6 g化濁開竅，遠(yuǎn)志6 g安神兼以化濁，水蛭3 g活血化瘀。

SP廣泛分布于中樞及周圍神經(jīng)系統(tǒng)，能調(diào)節(jié)神經(jīng)元活動(dòng)，發(fā)揮著神經(jīng)遞質(zhì)和神經(jīng)調(diào)質(zhì)的作用[5]。另外，SP是良好的血管舒張劑，增加血流量，增強(qiáng)腦代謝，并可抑制AD病理學(xué)標(biāo)志β-淀粉樣蛋白的效應(yīng)[5]81，進(jìn)而改善AD腦部病變。由此認(rèn)為，SP能延緩AD病理標(biāo)志老年斑的病理進(jìn)展。消化系統(tǒng)中，SP對(duì)胃腸道大部分平滑肌具有很強(qiáng)的刺激效應(yīng)，引起收縮并促進(jìn)胃腸蠕動(dòng)。SP可激活胃腸道膽堿能神經(jīng)元，并增加乙酰膽堿效應(yīng)。SP對(duì)胃腸道有上皮保護(hù)和促進(jìn)黏膜愈合的重要作用，可促進(jìn)大小腸水和電解質(zhì)的分泌，抑制小腸的吸收[5]79。上述SP生理作用，提示SP是消化系統(tǒng)功能、形態(tài)的物質(zhì)保障。由此可知，SP可作為脾(腸、胃)功能狀態(tài)和AD進(jìn)展的評(píng)價(jià)指標(biāo)，是脾腦共同的物質(zhì)基礎(chǔ)，推測(cè)其是脾腦相互作用的媒介。

本研究采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示健脾益智混懸液可明顯縮短逃避潛伏期及明顯增加跨越平臺(tái)次數(shù)。從宏觀層面佐證了健脾益智法可提升AD大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力，肯定了健脾益智法治療AD的療效，為臨床治療AD提供了新思路。微觀層面，本研究采用免疫組化方法，研究健脾益智法對(duì)AD大鼠海馬區(qū)、大腸區(qū)腦腸肽SP表達(dá)水平的影響及其關(guān)聯(lián)。結(jié)果顯示，健脾益智混懸液可同步上調(diào)AD大鼠海馬區(qū)、大腸區(qū)腦腸肽SP表達(dá)水平。認(rèn)為健脾益智法可同步上調(diào)海馬區(qū)、大腸區(qū)腦腸肽SP表達(dá)水平。綜上所述，可知健脾益智法同步提升AD大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力和AD大鼠海馬區(qū)、大腸區(qū)腦腸肽SP表達(dá)水平。因?yàn)槟X腸肽SP在中樞及消化系統(tǒng)的雙重分布，并發(fā)揮相應(yīng)生理作用，所以認(rèn)為AD大鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力的提升與AD大鼠海馬區(qū)、大腸區(qū)腦腸肽SP表達(dá)水平的提升有關(guān)，推測(cè)腦腸肽SP是健脾益智法治療AD的微觀作用靶點(diǎn)，即健脾益智法通過同步提高腦腸中腦腸肽SP的表達(dá)水平，同步改善脾腦狀態(tài)，其中借助海馬區(qū)腦腸肽SP表達(dá)水平的提高及其中樞的生理作用，如調(diào)節(jié)神經(jīng)元、充當(dāng)遞質(zhì)和調(diào)質(zhì)、增強(qiáng)腦代謝、抑制β樣蛋白效應(yīng)，使治療AD起效，為健脾益智法治療AD提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。但由于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物樣本量有限，致實(shí)驗(yàn)仍存在局限性，以及脾腦相關(guān)理論的微觀機(jī)制尚未完全闡明，本課題組將繼續(xù)進(jìn)行相關(guān)研究。

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