王 莉，劉雨娟，姚 蘭，藺興遙

(1. 河西學院醫(yī)學院，甘肅 張掖 734000； 2. 甘肅中醫(yī)藥大學科研實驗中心，蘭州 730000)

沙塵暴發(fā)生時大量的細顆粒物被揚起，同時在細顆粒物形成和長途傳輸過程中發(fā)生了大量的化學和生物學污染，對大氣和人體健康帶來極大的危害[1]。河西走廊至內(nèi)蒙古中西部﹑寧夏干旱區(qū)既是我國沙塵暴最主要的源地區(qū)，也是受沙塵暴影響最主要的地區(qū)?！端貑枴り庩枒蟠笳摗氛f“天氣通于肺”“鼻為肺之竅”“喉為肺之門戶”，故咽喉的解剖部位決定了沙塵中的致病顆粒物易滯留在咽部，誘發(fā)咽部疾患。山豆根性寒味苦，具有清火解毒﹑消腫止痛的功效[2]，臨床常用治療咽喉腫痛、牙齦腫痛等。我們前期的臨床研究也證實，以山豆根為君藥的中藥復方對河西地區(qū)沙塵引發(fā)咽炎的治療有較好的療效。目前有關河西地區(qū)沙塵顆粒物引發(fā)慢性咽炎及山豆根水煎劑治療此類疾患的作用機制報道甚少，因此本實驗是初步探討了山豆根在治療河西地區(qū)沙塵顆粒物所誘發(fā)的慢性咽炎中的作用及其機制。

1 研究材料

1.1 實驗動物

健康SPF級成年SD大鼠，雌雄各半共60只，體質(zhì)量(200±20) g，由甘肅中醫(yī)藥大學科研實驗中心提供。

1.2 主要試劑

依那西普由輝瑞制藥有限公司提供；TNF-a、IL-1、IL-6、MDA、T-AOC、NF-KB試劑盒由西安科昊生物工程有限責任公司提供，山豆根水煎液由甘肅中醫(yī)藥大學科研實驗中心中藥前處理室提供。

1.3 主要儀器

酶聯(lián)免疫分析儀(BIO-TEC,U.S.A)；紫外分光光度計(UV-2401PC,日本)。

2 研究方法

2.1 沙塵模擬實驗方法

沙塵模擬實驗平臺由甘肅省人民醫(yī)院、中科院寒旱所聯(lián)合研制。沙塵采用減速法，從蘭州市市中心以及郊區(qū)10個采集點收集，降塵缸外圍安裝減速沿,自降塵缸向外高度逐漸降低。采集的沙塵主要成分為MgO、CaO、Na2O，沙塵由蘭州市環(huán)保局空氣質(zhì)量監(jiān)測站點提供。

2.2 分組方法

將60只大鼠按隨機數(shù)字表法分為4組，正常對照組：于沙塵模擬實驗平臺給予正常吹風2 h/d，不吸入沙塵，第31天開始每天以生理鹽水灌胃1 ml/100 g；沙塵模型組于沙塵模擬實驗平臺沙塵吹風2 h/d，風速8 m/s共45 d，沙塵來自室外；依那西普組從造模后的第31天、第38天、第45天按劑量皮下注射依那西普3次；山豆根組于造模后的第31天開始每天灌胃給予相應劑量的藥物。

最后1 d給藥后2 h，各組大鼠以戊巴比妥鈉0.4 ml麻醉，股動脈采血分離血清，使用3000R離心機離心10 min，取上層血清與-20 ℃冰箱保存，采用酶聯(lián)免疫法測定TNF-a、IL-1、IL-6、NF-kb含量，檢測方法均嚴格按照試劑盒說明操作。

采血后剪取咽部組織約0.8～1 g 2份，一份用分光光度法檢測MDA、T-AOC含量,一份用于病理組織切片，組織取材后迅速投入10%中性福爾馬林中固定，使用乙醇脫水、二甲苯透明、浸蠟，常規(guī)石蠟包埋切片HE染色(HE染色×400)。

2.3 實驗藥物濃度計算方法

沙塵顆粒物(直徑≤10 um，PM10)主要成分為MgO、CaO、Na2O，濃度水平>167.5 μg/m3。山豆根水煎液，成人日服用量按藥典為0.086 g生藥/kg，大鼠灌胃劑量按成人6倍計算為0.52 g/kg，臨用前以蒸餾水配置成濃度為5.2%的溶液冰箱保存?zhèn)溆?。依那西普凍干粉劑，臨床成人治療劑量為0.36 mg/kg,每周1次；大鼠腹部皮下注射劑量按成人6倍計算為2.16 mg/kg。

2.4 統(tǒng)計學方法

3 結(jié)果

3.1 大鼠血清中IL-1、IL-6、TNF-a、NF-kb表達的變化

表1顯示，與正常對照組比較，沙塵組中IL-1、IL-6、TNF-a、NF-kb水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與沙塵組比較，依那西普組和山豆根組中IL-1、IL-6、TNF-a、NF-kb水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；依那西普組與山豆根組比較，以上指標差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，說明沙塵顆粒物可引發(fā)慢性咽炎中促炎因子的表達，而山豆根和依那西普均能抑制沙塵顆粒物促炎因子的表達，并下調(diào)沙塵顆粒物引發(fā)慢性咽炎中NF-kb水平表達。

表1 各組大鼠血清中IL-1、IL-6、TNF-a、NF-kb表達情況比較

注：與正常對照組比較：*P<0.05；與沙塵模型組比較：#P<0.05

3.2 大鼠咽部組織MDA、T-AOC含量變化

表2顯示，與正常對照組比較，沙塵組中MDA水平明顯升高，而T-AOC含量降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與沙塵組比較，依那西普組和山豆根組中MDA水平均明顯降低，而T-AOC含量降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；依那西普組與山豆根組比較，以上指標差異無統(tǒng)計學意義，說明沙塵顆粒物引發(fā)慢性咽炎時，引起機體抗氧化能力降低，山豆根和依那西普可通過增強機體的抗氧化能力，以阻斷沙塵顆粒物對咽部組織的損傷作用。

表2 各組大鼠咽部組織MDA、T-AOC含量比較

注：與正常對照組比較：*P<0.05；與沙塵模型組比較：#P<0.05

3.3 咽部組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的改變

圖1顯示，正常對照組大鼠咽部組織結(jié)構(gòu)清晰，黏膜上皮光滑，黏膜上皮層多為未角化的復層扁平上皮，固有層可見散在淋巴組織和腺泡，腺體結(jié)構(gòu)正常，致密結(jié)締組織，黏膜下有少量小血管，肌層纖維排列規(guī)則。未見明顯的上皮增生，大部分未見血管擴張、水腫、炎性細胞浸潤與纖維組織增生。肌肉層以及外膜都未明顯炎性改變。沙塵模型組大鼠咽部組織分界不清，上皮層為角化的復層扁平上皮，見明顯的增生，固有層和黏膜下水腫，小血管增多、充血，大量炎性細胞浸潤(主要為淋巴細胞以及單核細胞)，少量深入肌層組織，肌纖維排列不規(guī)則。纖維組織增生，黏膜下層為疏松結(jié)締組織，可見腺體肥大、增生、萎縮等，周圍可見血管數(shù)量最多、炎性細胞密集性浸潤。肌肉層、外膜層未見明顯的炎性改變。造模成功。依那西普組與山豆根組：黏膜上皮逐漸恢復平整，黏膜上殘留少量黏液，黏膜和黏膜下可見少量炎性細胞浸潤。上皮層、固有層病變程度與模型組比較有明顯的改善，肌肉層、外膜層的炎性改變明顯減輕，說明依那西普和山豆根均能抑制沙塵顆粒物對眼部組織所致慢性病理性變化。

圖1 各組大鼠咽部組織形態(tài)結(jié)構(gòu)改變(10×40)

4 討論

慢性咽炎為上呼吸道慢性炎癥，其病理改變主要為黏膜慢性充血，血管周圍淋巴細胞、白細胞浸潤，黏膜及黏膜下結(jié)締組織增生，腺體肥大，黏液分泌增多。研究表明，慢性炎癥性疾病發(fā)生與發(fā)展中，TNF-a、IL-1、IL-6參與其中并過量表達[3]。這與本實驗中沙塵顆粒物引發(fā)慢性咽炎的結(jié)果一致。同時TNF-a、IL-1、IL-6作為細胞外刺激因子，又可激活NF-kb進一步放大炎癥反應[4]。在沙塵暴顆粒物中，部分不但本身具有自由基活性，還可促進活性氧(ROS)和活性氮(RNS)釋放，從而對細胞膜產(chǎn)生脂質(zhì)過氧化，破壞組織的氧化-抗氧化系統(tǒng)的平衡，導致氧化損傷[5]。丙二醛是脂質(zhì)過氧化的終末反應產(chǎn)物，過多的脂質(zhì)過氧化物可導致機體的總抗氧化能力減弱，而ROS和RNS的過量產(chǎn)生在炎癥反應的組織損傷中發(fā)揮重要作用。山豆根當前的化學成分主要為生物堿、黃酮、木脂素，現(xiàn)代藥理學研究證實其有抗病毒、抗炎、抗氧化等藥理學活性。山豆根中的紫檀素類黃酮與二氫黃酮，能夠誘導巨噬細胞RAC產(chǎn)生炎癥介質(zhì)NO，山豆根多糖能夠直接清除超氧陰離子及羥自由基，同時抑制H2O2釋放[6]。這與本實驗結(jié)果一致，因此推測山豆根可能通過降低促炎因子及ROS的表達，增強機體的抗氧化能力以阻斷沙塵顆粒物所致的咽部炎癥損傷反應。

TNF-a是一種具有多種生物學效應的細胞因子，其與TNF-Rl結(jié)合后，使NF-kb發(fā)生磷酸化、泛素化而活化，激活的NF-kb進入核內(nèi)誘導促炎癥因子(TNF-a、IL-1、IL-6)、趨化因子(IL-8)等炎性基因及VEGF、TGF-β等基因的表達，參與炎癥反應，TNF-a激活NF-kb介導信號通路是炎癥級聯(lián)反應放大的基礎[8]。依那西普是可溶性腫瘤壞死因子受體p75和免疫球蛋白fc段的融合蛋白，為TNF-a拮抗劑，通過抑制TNF-a與TNF-Rl結(jié)合起到控制炎癥的作用。本實驗選用依那西普后，明顯抑制沙塵顆粒物引發(fā)咽部組織的慢性炎癥反應和氧化損傷；沙塵組中隨著NF-kb通路中的2個上游分子TNF-a、IL-1表達的顯著上調(diào)，NF-kb的表達也顯著上調(diào)；而山豆根組中當TNF-a、IL-1的表達明顯下調(diào)時，NF-kb的表達也明顯下調(diào)，差異有統(tǒng)計學意義。因此推測TNF-a介導的NF-kb信號通路激活可能是沙塵顆粒物引發(fā)咽部炎癥損傷的重要因素之一；山豆根治療沙塵顆粒物誘發(fā)慢性咽炎的機制，可能是其中生物堿、黃酮成分能夠增強降低TNF-a的表達而抑制NF-kb信號通路的活化，降低TNF-a、IL-1、IL-6水平，避免炎癥反應放大，減輕炎癥因子對細胞膜的脂質(zhì)過氧化損傷，從而減輕咽部炎癥反應和機體的氧化損傷反應[9]。

山豆根治療沙塵顆粒物所致慢性咽炎的作用機制可能是通過TNF-a受體介導的信號傳導途徑，下調(diào)核轉(zhuǎn)錄因子-kb的表達水平而發(fā)揮作用。今后可進行有效成分的篩選，以山豆根提取物作為原料，用于藥劑進行沙塵地區(qū)咽炎防治新藥研發(fā)。但是本次研究只使用山豆根常規(guī)劑量作為研究劑量，以明確其對沙塵所致慢性咽炎NF-kb信號傳導通路的影響，而未使用多個對比劑量進行研究，因此需要更進一步針對不同劑量進行深入研究。

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