張麗晗 羅 智 有文靜 李丹丹 吳 坤 徐異桓

(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，動(dòng)物遺傳育種與繁殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 武漢 430070)

Wnt家族的基因最初是由Nusse和Varmus于1982年在鼠類乳腺癌病毒誘導(dǎo)的小鼠乳腺癌中克隆得到的， 并被命名為Int-1， 該基因由于與后來報(bào)道的果蠅無翅基因Wingless (Wg)同源， 故將兩者合并命名為Wnt[1]。自從Wnt家族在1982年被發(fā)現(xiàn)以來， 科學(xué)工作者已經(jīng)陸續(xù)在哺乳動(dòng)物基因組中發(fā)現(xiàn)了19種Wnt家族成員基因[2]。進(jìn)一步的研究證實(shí)，Wnt基因家族與其他相關(guān)基因組成了一條復(fù)雜的信號(hào)傳導(dǎo)途徑——Wnt信號(hào)途徑(Wnt signaling pathway)。Wnts可以通過經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號(hào)通路或者非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路(包括Wnt/Ca2+信號(hào)通路和Wnt/PCP信號(hào)通路)調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)， 在動(dòng)物胚胎發(fā)育、細(xì)胞分化和器官發(fā)育等多種生命過程中發(fā)揮作用[3—5]。

Wnt通路是機(jī)體重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一， 在細(xì)胞增殖、分化、胚胎發(fā)育和卵泡生成方面具有重要的調(diào)節(jié)作用[6，7]。因此， Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的錯(cuò)誤調(diào)節(jié)可導(dǎo)致包括卵巢發(fā)育失調(diào)在內(nèi)的多種病理變化[3，8]。研究已證實(shí)， 以Wnt基因?yàn)榕潴w的Wnt信號(hào)通路在進(jìn)化中非常保守， 從低等的無脊椎動(dòng)物到高等的哺乳動(dòng)物都可以明顯檢測(cè)到該信號(hào)通路成員的表達(dá)[5]。在魚類， 目前僅在一些模式魚類克隆得到了Wnt家族部分成員的cDNA序列， 如斑馬魚(Danio rerio)[9，10]和青鳉(Oryzias latipe)[11]等。最近，曹梅等[12]基于斑點(diǎn)叉尾鮰(Ictalurus punctatus)的基因組數(shù)據(jù)庫， 通過與NCBI中存在的人(Homo sapiens)、小鼠(Mus musculus) 和斑馬魚等Wnt蛋白氨基酸序列進(jìn)行比較， 發(fā)現(xiàn)斑點(diǎn)叉尾鮰Wnt基因家族成員共20種。然而， 在其他魚類， 還沒有有關(guān)Wnt家族成員cDNA序列克隆的報(bào)道， 也沒有關(guān)于這些基因mRNA組織表達(dá)的研究。

銅是包括魚類在內(nèi)的所有脊椎動(dòng)物必需的微量元素之一， 廣泛地參與體內(nèi)的許多生化過程， 然而， 過量的銅對(duì)生物體是有毒的[13]。與其他脊椎動(dòng)物不同， 魚類可以經(jīng)由鰓從水中吸收銅。我們前期研究發(fā)現(xiàn)水體銅暴露能影響黃顙魚的卵巢發(fā)育和激素分泌[14]， 然而相關(guān)機(jī)制尚不清楚。對(duì)哺乳動(dòng)物的研究表明， Wnt介導(dǎo)的通路在卵巢發(fā)育和激素分泌過程中起著重要作用[15]。Wnt通路能通過激活βcatenin提高FSH的作用效果， 因而促進(jìn)腔前卵泡的生長， 然而， 過度活化β-catenin對(duì)LH激素誘導(dǎo)的排卵和黃體化產(chǎn)生不利的影響[16]。

鑒于Wnt家族基因和蛋白對(duì)卵巢發(fā)育的重要作用， 我們假設(shè)Wnt家族成員介導(dǎo)了銅影響黃顙魚卵巢發(fā)育和激素分泌的調(diào)控。所以， 作為深入解析這些成員功能的第一步， 本研究首先克隆了黃顙魚Wnt家族4個(gè)基因(Wnt5a、Wnt5b、Wnt7a和Wnt9b)全長的cDNA序列， 探討了它們的組織表達(dá)模式； 在此基礎(chǔ)上研究了水體銅暴露對(duì)這些基因mRNA表達(dá)的影響， 為深入研究Wnt家族基因在銅影響魚類卵巢發(fā)育和激素分泌中所起的作用奠定基礎(chǔ)， 并為解析魚類Wnt家族基因的功能提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)魚

本實(shí)驗(yàn)的黃顙魚為一齡黃顙魚， 均購自武漢市上涉湖養(yǎng)殖場(chǎng)(東經(jīng)114°15′， 北緯30°8′)， 分為2組。第一組黃顙魚用于Wnt家族4個(gè)基因cDNA序列的克隆和組織表達(dá)水平的測(cè)定。用于基因克隆的黃顙魚組織樣品為肝臟和卵巢組織。用于基因表達(dá)譜測(cè)定的組織包括黃顙魚的腦、脾臟、腎、鰓、心臟、肌肉、脂肪、肝臟和卵巢組織。取樣參照本實(shí)驗(yàn)室的方法[17，18]。

第二組黃顙魚用于檢測(cè)水體銅暴露對(duì)Wnt家族4個(gè)基因表達(dá)水平的影響。實(shí)驗(yàn)策略參照[14]。簡單說來， 216尾規(guī)格均一的健康黃顙魚[平均體重:(10.2±0.2) g， 平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤]隨機(jī)放入9個(gè)300 L玻璃纖維缸中， 每缸24尾。分別暴露在銅濃度為0(對(duì)照)、30(低)和60(高) μg/L的水體中， 每個(gè)處理設(shè)3個(gè)重復(fù)(即3個(gè)缸)， 每天換水1次。水中銅濃度通過電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS)測(cè)定[14]， 每周測(cè)定2次， 實(shí)測(cè)值分別為(3±1)、(31±2)和(62±3) μg Cu/L (平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，n=16)。實(shí)驗(yàn)期間， 黃顙魚每天飽食投喂商業(yè)飼料2次[飼料Cu含量: (3.1±1) mg Cu/kg， 平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤，n=3]， 每天換水1次。實(shí)驗(yàn)持續(xù)8周， 在28d和56d時(shí)進(jìn)行取樣， 每缸取6尾黃顙魚提RNA用于基因表達(dá)測(cè)定。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品

RNA提取試劑盒(Trizol Reagent)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、3′-Full RACE Kit試劑盒、5′-Full RACE Kit試劑盒、熒光定量試劑盒、凝膠純化回收試劑盒、Taq酶、DNA Marker(2000)、dNTP等試劑購自大連寶生物公司(TaKaRa)， 胰蛋白胨和酵母粉購自Sigma公司， 無水乙醇、氯仿、異丙醇等為中國國藥分析純產(chǎn)品。

1.3 Wnt家族基因cDNA序列的克隆

參照本實(shí)驗(yàn)室已有的方法[17，18]。簡要步驟如下: 總RNA的提取參照Invitrogen公司的Trizol說明書進(jìn)行。總RNA的質(zhì)量通過瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)， 其濃度及A260/A280通過Nanodrop ND2000分光光度計(jì)測(cè)定。然后， 以提取的總RNA為模板， 用TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit)合成第一鏈cDNA。

根據(jù)GenBank及Ensembl數(shù)據(jù)庫中已報(bào)道的魚類Wnt家族基因序列， 設(shè)計(jì)簡并引物(表 1)， 以擴(kuò)增Wnt5a、Wnt5b、Wnt7a和Wnt9b基因cDNA核心片段。PCR反應(yīng)程序如下: 94℃預(yù)變性4min； 94℃30s， 55℃ 30s， 72℃ 1min， 30個(gè)循環(huán)； 72℃延伸5min。PCR體系包括500 ng cDNA template、0.2 μmol/L primer、5 μL 10×ExTaqBuffer、2.5 mmol/LdNTP和1.25 U ExTaqpolymerease (TaKaRa， 日本)。然后分別設(shè)計(jì)3′和5′ RACE特異性引物(表 1)進(jìn)行巢式PCR反應(yīng)， Outer-PCR反應(yīng)參數(shù)為: 94℃預(yù)變性3min； 然后94℃ 30s， 55℃ 30s， 72℃ lmin， 共25個(gè)循環(huán)； 最后72℃再延伸10min。Inner-PCR反應(yīng)參數(shù)為:94℃預(yù)變性3min； 然后94℃ 30s， 55℃ 30s， 72℃1min， 共30個(gè)循環(huán)； 最后72℃終延伸10min。

1.4 序列分析

用DNAStar軟件將擴(kuò)增得到的核心片段、3′和5′末端序列拼接， 從而獲得基因的cDNA全長序列。獲得的核苷酸序列經(jīng)NCBI進(jìn)行BLAST， 以確定該序列對(duì)應(yīng)的基因亞型(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)。同時(shí)， 運(yùn)用DNAStar軟件找出開放閱讀框(ORF)并翻譯成氨基酸序列。序列比對(duì)和氨基酸同源性分析使用Clustal-W軟件。進(jìn)化樹用MEGA 5.0軟件采用鄰接法(NJ)構(gòu)建[19]， 選擇的最適進(jìn)化模型為JTT+G[20]， 每個(gè)節(jié)點(diǎn)的可信值進(jìn)行1000次重復(fù)計(jì)算。

1.5 基因的組織分布和表達(dá)分析

參照文獻(xiàn)[17， 18]采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qPCR)方法檢測(cè)， 熒光定量引物見表 2。qPCR反應(yīng)參數(shù)為: 95℃預(yù)變性30s； 95℃ 5s， 57℃ 30s， 72℃ 30s，共40個(gè)循環(huán)。相對(duì)表達(dá)水平采用2-ΔΔCt方法計(jì)算[21]。選用雙內(nèi)參(β-actin和gapdh)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。我們的預(yù)實(shí)驗(yàn)表明這2個(gè)內(nèi)參組合在黃顙魚不同組織及不同銅暴露濃度下的表達(dá)水平?jīng)]有顯著差異。

表 1 Wnt5a、Wnt5b、Wnt7a和Wnt9b基因克隆的引物序列Tab. 1 Primers used for the cDNAs cloning of Wnt5a， Wnt5b，Wnt7a and Wnt9b genes

1.6 數(shù)據(jù)分析

結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(Mean±SEM) 進(jìn)行表示。統(tǒng)計(jì)分析之前， 采用Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)所有數(shù)據(jù)的正態(tài)分布性。不同處理間方差的同質(zhì)性使用Bartlett檢驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)處理組之間進(jìn)行單因素方差分析和Duncan’s多重比較檢驗(yàn)。顯著性水平取0.05。采用SPSS 19.0軟件(SPSS， Michigan Avenue， Chicago， IL， USA) 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。

2 結(jié)果

2.1 Wnt5a、Wnt5b、Wnt7a和Wnt9b序列的分子特征及進(jìn)化分析

本研究通過RT-PCR和RACE方法獲取Wnt5a、Wnt5b、Wnt7a和Wnt9b基因的cDNA全長序列， 長度分別為1984、2905、2158和1622 bp。序列分析顯示，它們的cDNA序列ORF長度分別為1124、1124、1049和1073 bp， 翻譯成蛋白所得到的氨基酸數(shù)分別為375、375、350和358。黃顙魚除WNT7A以外， WNT5A、WNT5B和WNT9B氨基酸序列都有信號(hào)肽酶切位點(diǎn)。黃顙魚WNT5A和WNT5B都有24個(gè)保守的半胱氨酸殘基， 4個(gè)保守的天冬酰胺殘基和1個(gè)酪氨酸硫酸化位點(diǎn)(圖 1)。黃顙魚WNT7A蛋白有24個(gè)保守的半胱氨酸殘基(圖 2)。黃顙魚WNT9B有23個(gè)保守的半胱氨酸殘基和1個(gè)N糖基化位點(diǎn)(圖 3)。

多肽序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)黃顙魚WNT5A、WNT5B、WNT7A和WNT9B氨基酸序列與其他魚類和哺乳類的同源性分別為78.6%—83.4%、76.3%—88.4%、85.9%—89.3%和58.9%—85.9%。

黃顙魚和其他脊椎動(dòng)物WNTs氨基酸的進(jìn)化樹見圖 4。在進(jìn)化樹中， 所有硬骨魚WNTs獨(dú)立聚集成一簇， 而兩棲類和哺乳類WNTs聚集成另外一簇。與其他硬骨魚類相比， 黃顙魚WNT5A與墨西哥麗脂鯉(Astyanax mexicanus) 比較接近， 黃顙魚WNT9B與青鳉(Oryzias latipe) 最近。黃顙魚WNT5B與 墨西哥麗脂鯉(Astyanax mexicanus) 和斑馬魚(Danio rerio)比較接近。硬骨魚類WNT7A先與青鳉(Oryzias latipes)和斑馬魚(Danio rerio) 聚成一簇， 再與黃顙魚WNT7A共同聚成一簇。

表 2 熒光定量引物Tab. 2 Primers used for real-time PCR

圖 1 黃顙魚(Pf: Pelteobagrus fulvidraco)WNT5A和WNT5B氨基酸序列與斑馬魚(Dr: Danio rerio)、墨西哥麗脂鯉(Am: Astyanax mexicanus)和人類(Hs: Homo sapiens)比對(duì)分析Fig. 1 Alignment of P. fulvidraco (Pf: Pelteobagrus fulvidraco) WNT5A and WNT5B amino acid sequences with other species (Dr: Danio rerio； Am: Astyanax mexicanus； Hs: Homo sapiens)

圖 2 黃顙魚(Pf: Pelteobagrus fulvidraco) WNT7A氨基酸序列與斑馬魚(Dr: Danio rerio)、青鳉(Ol: Oryzias latipes)和人類(Hs: Homo sapiens)和其他硬骨魚類比對(duì)分析Fig. 2 Alignment of P. fulvidraco (Pf: Pelteobagrus fulvidraco) WNT7A amino acid sequences with other species (Dr: Danio rerio； Ol:Oryzias latipes； Hs: Homo sapiens)

2.2 Wnt5a、Wnt5b、Wnt7a和Wnt9b序列的組織表達(dá)模式

Wnt5a的mRNA在肌肉表達(dá)最高， 其次是脂肪組織， 而在其他組織(如腦、脾臟、腎臟、鰓、心臟、肝臟和卵巢)中無顯著差異(圖 5A)；Wnt5b在脾臟中的表達(dá)最高， 而在其他組織中無顯著性差異(圖 5B)；Wnt7a在肌肉中表達(dá)最高， 其次是腦、卵巢、脂肪和鰓， 而在其他組織中無顯著性差異(圖5C)；Wnt9b在肌肉中表達(dá)最高， 而其他組織無顯著性差異(圖 5D)。

2.3 水體銅暴露對(duì)Wnt5a、Wnt5b、Wnt7a和Wnt9b基因表達(dá)水平的影響

在暴露28d時(shí)，Wnt7amRNA水平在30 μg Cu/L組最高， 其他2組差異不顯著 (圖 6A)。Wnt5a、Wnt5b和Wnt9b基因的mRNA表達(dá)各個(gè)處理組無顯著性差異。在暴露56d (圖 6B)，Wnt5b在60 μg Cu/L組最低， 其他2個(gè)組差異不顯著；Wnt9bmRNA水平在30 μg Cu/L組最高， 其他2組差異不顯著。

3 討論

3.1 Wnt5a、Wnt5b、Wnt7a和Wnt9b序列的分子特征與進(jìn)化分析

本研究克隆得到了黃顙魚Wnt5a、Wnt5b、Wnt7a和Wnt9b基因的cDNA全長序列。分析這4個(gè)基因的蛋白序列發(fā)現(xiàn)， 它們具有一些保守的結(jié)構(gòu)域，如N-糖基化位點(diǎn)、信號(hào)肽酶切位點(diǎn)和保守的半胱氨酸殘基等[22—25]。本研究指出， WNT蛋白富含半胱氨酸， 這些半胱氨酸之間形成的二硫鍵對(duì)其正確折疊非常重要。N-糖基化是Wnt蛋白的一個(gè)重要修飾， 它們對(duì)Wnt的分泌和行使正常功能至關(guān)重要[26]。多肽序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)， 黃顙魚WNT5A、WNT5B、WNT7A和WNT9B氨基酸序列與其他魚類和哺乳類的同源性分別為78.6%—83.4%、76.3%—88.4%、85.9%—89.3%和58.9%—85.9%， 這與在哺乳動(dòng)物中的報(bào)道相近[22，23，27，28]。進(jìn)化樹分析進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，黃顙魚WNT5A、WNT5B、WNT7A和WNT9B多肽與其他魚類的親緣關(guān)系與物種的分類地位相符，與曹梅等[12]在斑點(diǎn)叉尾鮰中的研究結(jié)果相似。

圖 3 黃顙魚(Pf: Pelteobagrus fulvidraco) WNT9B氨基酸序列與斑馬魚(Dr: Danio rerio)、墨西哥麗脂鯉(Am: Astyanax mexicanus)和人類(Hs: Homo sapiens)比對(duì)分析Fig. 3 Alignment of P. fulvidraco (Pf: Pelteobagrus fulvidraco) WNT9B amino acid sequences with other species (Dr: Danio rerio； Am:Astyanax mexicanus； Hs: Homo sapiens)

3.2 Wnt5a、Wnt5b、Wnt7a和Wnt9b序列的組織表達(dá)模式

研究基因的組織分布模式有助于我們初步了解這些基因的生理功能。Wnt家族成員作為一種信號(hào)分子普遍存在于生物體各個(gè)組織中， 并參與生物體多種組織細(xì)胞的生命過程。然而， 先于我們的研究， 目前在魚類還沒有有關(guān)這些基因mRNA組織表達(dá)模式的報(bào)道。我們的研究表明這4個(gè)Wnt基因在黃顙魚各組織中均有表達(dá)， 但不同組織間的表達(dá)水平差異很大， 一方面表明Wnt家族的這4個(gè)基因在各個(gè)組織中起著廣泛的作用， 另一方面不同組織差異性的表達(dá)模式可能反映了不同組織特有的生物學(xué)作用。因此， 這種表達(dá)差異被認(rèn)為是Wnt基因功能的多樣性造成的。相似地， 周春婭等[25]指出海蜇Wnt5基因在不同的發(fā)育階段均有表達(dá)， 但存在著明顯的發(fā)育表達(dá)差異。此外， 在卵巢中的表達(dá)表明這些基因可能在卵巢發(fā)育和成熟中起著重要的調(diào)控作用， 相似的結(jié)果在Sanchez等[15]的研究中得到了證實(shí)。

3.3 水體銅暴露對(duì)Wnt5a、Wnt5b、Wnt7a和Wnt9b基因表達(dá)水平的影響

圖 4 脊索動(dòng)物Wnts系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 4 Phylogenetic tree based on the protein sequences of Wnts from P. fulvidraco (▲) and other chordate species using the neighborjoining (NJ) method with 1000 bootstrap replicates

在本研究中， 我們假設(shè)銅對(duì)黃顙魚卵巢發(fā)育和激素合成的影響與Wnt通路的變化有關(guān)。然而， 無論是在陸生(包括哺乳動(dòng)物)還是水生動(dòng)物， 目前還沒有關(guān)于銅影響這些基因表達(dá)水平的報(bào)道； 而且，目前僅見Wnt5a在哺乳動(dòng)物卵巢發(fā)育和激素分泌過程中所起生物學(xué)作用的研究， 沒有Wnt5b、Wnt7a和Wnt9b生物學(xué)功能的類似報(bào)道， 因此要進(jìn)行深入的討論非常困難。我們的研究表明: 在28d時(shí)， 黃顙魚卵巢中的Wnt7amRNA水平在30μg Cu/L組最高， 其他2組差異不顯著；Wnt5a、Wnt5b和Wnt9b基因的mRNA表達(dá)各個(gè)處理組無顯著性差異。而在56d，卵巢中的Wnt5b在60 μg Cu/L組最低， 其他2個(gè)組差異不顯著；Wnt9bmRNA水平在30 μg Cu/L組最高，其他2組差異不顯著。Wnt家族成員是一類富含半胱氨酸的分泌型糖脂蛋白， 可以通過經(jīng)典的Wnt/βcatenin信號(hào)通路或者非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路 (包括Wnt/Ca2+信號(hào)通路和Wnt/PCP信號(hào)通路) 調(diào)控機(jī)體的生命活動(dòng)。有限的研究指出， Wnt5a是非經(jīng)典Wnt信號(hào)通路的配體， 在哺乳動(dòng)物雌性生殖系統(tǒng)發(fā)育過程中發(fā)揮了重要的作用。過表達(dá)Wnt5a能夠抑制顆粒細(xì)胞的β-catenin信號(hào)[29]。Wu等[7]在黑鯛(Acanthopagrus schlegeli)的研究表明，Wnt4基因的上調(diào)和cyp19a基因的下調(diào)伴隨著卵巢的生長， 說明Wnt信號(hào)通路參與并調(diào)控卵巢組織的生長與發(fā)育。本研究初步發(fā)現(xiàn)Wnt5b、Wnt7a和Wnt9b可能介導(dǎo)了銅影響黃顙魚卵巢發(fā)育和激素合成的變化， 因此，深入闡明Wnt5b、Wnt7a和Wnt9b在銅影響黃顙魚卵巢發(fā)育和激素合成中的作用機(jī)制， 有助于揭示銅影響黃顙魚卵巢發(fā)育和激素合成的機(jī)理， 這將為研究銅的繁殖營養(yǎng)和毒性效應(yīng)提供一個(gè)新的思路。

圖 5 黃顙魚Wnts組織特異性表達(dá)分析Fig. 5 The mRNA level of Wnts in the brain， spleen， kindey， gill， heart， muscle， fat， liver and ovary

圖 6 第28天和第56天銅暴露對(duì)黃顙魚卵巢中Wnts基因(Wnt5a、Wnt5b、Wnt7a和Wnt9b)mRNA表達(dá)的影響Fig. 6 Effect of Cu exposure on the mRNA levels of genes (Wnt5a， Wnt5b， Wnt7a and Wnt9b) in the ovary of P. fulvidraco on days 28 and 56

本研究獲取了Wnt5a、Wnt5b、Wnt7a和Wnt9b基因的cDNA全長序列， 為深入解析它們的功能奠定了基礎(chǔ)； 這些基因在檢測(cè)的9個(gè)組織中都有表達(dá)，但表達(dá)水平相同， 表明它們會(huì)以信號(hào)分子的形式參與多種組織細(xì)胞的生命過程； 銅暴露差異性影響了Wnt家族4個(gè)基因的mRNA水平， 表明它們的基因功能發(fā)生了分化， 并可能介導(dǎo)了銅影響黃顙魚卵巢發(fā)育的調(diào)控。

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