崔寶月 董迎輝 趙家熙 胡凌威 李曉英 姚韓韓 林志華

(1. 上海海洋大學水產(chǎn)與生命學院， 上海 201306； 2. 浙江萬里學院， 浙江省水產(chǎn)種質(zhì)資源高效利用技術(shù)研究重點實驗室， 寧波315100； 3. 淮海工學院， 江蘇省海洋生物技術(shù)重點實驗室， 連云港 222000)

SRB I (Scavenger receptor class B type I ， B類I型清道夫受體)是B型清道夫受體中的成員之一，作為類胡蘿卜素吸收過程的關(guān)鍵基因[1]， 主要是通過介導高密度脂蛋白(High density lipoprotein，HDL)影響膽固醇酯的選擇性吸收進而影響類胡蘿卜素在體內(nèi)的吸收和轉(zhuǎn)運[2]。迄今為止SRBI基因已在家蠶(Bombyx mori)[3]、小鼠(Mus musculus)[4]、倉鼠(Mesocricetus auratus)[5]等模式動物中進行了大量的研究。在海洋貝類中， 僅開展過少量相關(guān)研究， 如Liu等[6]通過轉(zhuǎn)錄組比對分析， 發(fā)現(xiàn)SRB-Like-3基因在華貴櫛孔扇貝(Chlamys nobilis)橙色個體中表達量高； 雷超等[7]分析了馬氏珠母貝(Pinctada fucata martensii)的B型清道夫受體的基因序列特征， 熒光定量分析發(fā)現(xiàn)在鰓、中央膜、閉殼肌、肝胰臟均有表達， 其中肝胰臟中表達量最高。但在文蛤中尚未見到關(guān)于SRBI的相關(guān)報道。

文蛤(Meretrix meretrix)是我國重要的經(jīng)濟貝類之一， 其殼色變異豐富并且可以遺傳給后代。已有研究表明， 紅殼文蛤外套膜內(nèi)比其他殼色文蛤含有更為豐富的類胡蘿卜素， 并推測類胡蘿卜素與殼色形成密切相關(guān)[8，9]。目前， 已有多位學者開展了文蛤組蛋白去乙?；?[10]、生長因子受體結(jié)合蛋白2[11]、C型凝集素[12]等生長和免疫相關(guān)基因的克隆和表達特征分析， 而與文蛤殼色相關(guān)的基因尚未見報道。本研究獲得紅殼文蛤SRBI(Mm-SRBI)基因的cDNA全長以及多段內(nèi)含子序列， 并分析了它在不同組織和不同殼色群體中的表達差異， 為后續(xù)深入研究文蛤殼色形成機理奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗文蛤材料均取自寧波市鄞州區(qū)丹艷養(yǎng)殖基地。隨機選擇4種殼色(暗紋、白殼、紅殼和黑斑)文蛤活體成貝各8枚， 并解剖獲得外套膜邊緣組織， 液氮速凍， –80℃保存， 樣品供以后實驗所用。隨機選擇紅殼文蛤10枚， 迅速獲取6個組織(斧足、外套膜、水管、鰓、內(nèi)臟團和閉殼肌)樣品， 液氮迅速冷凍， –80℃保存待用。

1.2 實驗方法

Mm-SRBI基因cDNA全長克隆用Trizol法提取紅殼文蛤外套膜組織的總RNA， 然后用試劑盒(Clontech)合成Mm-SRBI基因cDNA。根據(jù)文蛤轉(zhuǎn)錄組文庫中SRBI基因的EST序列， 分別設計3′和5′端特異性引物SRBIF和SRBIR (表 1)， 用SMART RACE試劑盒(Clontech)擴增Mm-SRBI基因的cDNA全長。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測、割膠回收， 回收產(chǎn)物與T1(Trans)載體連接， 然后轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中培養(yǎng)過夜， 挑取白斑搖菌檢測， 將陽性結(jié)果進行測序。測序結(jié)果進行比對和拼接， 得到Mm-SRBI基因的cDNA全長。

為了確保Mm-SRBI基因cDNA全長的準確性，將已經(jīng)獲得的基因的cDNA全長作為模板， 分別設計SRBIF1和SRBIR1為引物(表 1)， 進行擴增和測序， 后續(xù)實驗同上。

Mm-SRBI基因的序列及進化分析利用BLAST軟件將5′-RACE片段和3′-RACE片段序列拼接， 獲得Mm-SRBI基因cDNA全長； 使用DNAMAN6.0軟件預測其氨基酸序列， 并推測其理化性質(zhì)； 用ORF Finder搜索Mm-SRBI基因的開放性閱讀框；Clustal X進行氨基酸多序列比對； 利用ExPASy軟件推測該蛋白理化特性； Smart軟件進行蛋白質(zhì)功能域預測； 利用TMHMM和SignalP分別進行蛋白質(zhì)跨膜區(qū)和信號肽區(qū)域分析； 使用軟件Swiss Model進行蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)預測； 用Motif Scan搜索工具對SRBI序列進行功能位點檢測； MEGA 6.0軟件NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。

表 1 本實驗所用引物及其序列Tab. 1 Primers and their sequences of the experiments

Mm-SRBI基因在不同殼色和不同組織群體中的表達差異分析取上述4種殼色的外套膜和紅殼文蛤的6個組織， 提取RNA之后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TAKARA)合成cDNA， 并作為熒光定量PCR(qRT-PCR)的模板， 用PRIMER設計引物qRT-F和qRT-R (表 1)， 以18SrRNA基因(表 1)為內(nèi)參， 用ABI 7500fast進行熒光定量PCR。數(shù)據(jù)處理采用相對值2–ΔΔCt進行計算， 用軟件SPSS 17.0進行統(tǒng)計數(shù)據(jù)得到各個組織和不同殼色群體的差異分析結(jié)果。

基因的內(nèi)含子克隆提取文蛤外套膜的基因組DNA， 根據(jù)已獲得的Mm-SRBI基因的cDNA序列設計特異性引物進行PCR擴增。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖電泳檢測、割膠回收和連接轉(zhuǎn)化， 選取陽性克隆送測序。

2 結(jié)果

2.1 Mm-SRBI基因的cDNA全長與序列分析

Mm-SRBI基因的cDNA全長為1676 bp (Gen-Bank登錄號: KY434116)， 開放閱讀框(ORF) 1515 bp，編碼504個氨基酸， 5′-UTR長50 bp， 3′-UTR為112 bp，包含1個終止密碼子TGA和25 bp的polyA尾。

2.2 Mm-SRBI基因編碼的蛋白結(jié)構(gòu)預測

SignalP軟件預測顯示， 該蛋白質(zhì)沒有明顯的信號肽； ExPASy Protscale軟件預測發(fā)現(xiàn)， 該蛋白極性氨基酸所占的比例較高， 表現(xiàn)親水性； ExPASy Compute推導出Mm-SRBI蛋白的理論等電點pI=6.27， 分子量為56.87 kD。TMHMM軟件預測在結(jié)構(gòu)域兩端有2個跨膜蛋白。功能域預測結(jié)果表明，Mm-SRBI蛋白含有1個CD36功能域， 其含有455個氨基酸(14—469 aa)。Swiss model軟件預測顯示，Mm-SRBI蛋白的二級結(jié)構(gòu)由271個H鍵、18個螺旋和43個轉(zhuǎn)角組成。

2.3 Mm-SRBI基因與其他物種的同源性比對及進化分析

利用MEGA6.0軟件的NJ法構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，文蛤和其他10個物種SRBI進行了氨基酸序列比對。結(jié)果發(fā)現(xiàn)， 文蛤與華貴櫛孔扇貝(Mimachlamys nobilis，AJM13628.1)的同源性最高為55%， 與太平洋牡蠣 (Crassostrea gigas， XP_011432626.2)、海蝸牛 (Aplysia californica， XP_005103573.2)、囊舌蟲(Saccoglossus kowalevskii， XP_006815324.1)、日本對蝦 (Marsupenaeus japonicas， AKO62849.1)、羅非魚(Oreochromis niloticus， XP_003444373.1)、褐家鼠 (Rattus norvegicus， NP_113729.1)、人 (Homo sapiens， NP_005496.4)、牛(Bos taurus， NP_777022.1)、野豬(Sus scrofa， NP_999132.1)等物種的同源性為34%—51%。從構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹中可以看出(圖 1)，文蛤與同為無脊椎動物的瓣鰓綱、腹足綱親緣關(guān)系較近， 與哺乳綱、魚綱和甲殼綱的親緣關(guān)系較遠。

圖 1 采用MEGA6.0軟件NJ法構(gòu)建的進化樹Fig. 1 The NJ phylogenetic tree constructed by MEGA6.0 software

2.4 不同組織和不同殼色群體表達差異分析

qRT-PCR檢測結(jié)果表明，Mm-SRBI在6個組織中(閉殼肌、外套膜、足、鰓、內(nèi)臟團和水管)均有表達， 其中外套膜表達量最高， 與其他各組織間存在極顯著差異(P＜0.01)(圖 2)。Mm-SRBI基因在不同殼色文蛤的外套膜中也均有不同程度的表達， 在殼色較深的黑斑文蛤、紅殼文蛤中表達量較高， 而在白殼文蛤中表達量最低， 且它們之間有顯著性的差異(P＜0.05)(圖 3)。

2.5 Mm-SRBI基因內(nèi)含子序列分析

Mm-SRBI基因共有13個外顯子和12個內(nèi)含子，序列總長度為9272 bp， 且外顯子和內(nèi)含子的連接處遵循AT/GT原則， 即均屬于GT-AG內(nèi)含子。從序列長度來看， 4號外顯子最長為201 bp， 6號外顯子最短， 為49 bp， 其余的在51—201 bp； 8號內(nèi)含子最長，為1020 bp， 6號內(nèi)含子最短， 為119 bp， 其余內(nèi)含子長度在396—1001 bp (圖 4)。

圖 2 Mm-SRBI基因在紅殼文蛤不同組織中的表達差異分析(n=3)Fig. 2 The expression of Mm-SRBI gene in different tissues of red shell of M. meretrix (n=3)

圖 3 Mm-SRBI基因在不同殼色文蛤外套膜中的表達差異分析(n=3)Fig. 3 The expression of Mm-SRBI gene in shells colors of M.meretrix (n=3)

圖 4 Mm-SRBI基因結(jié)構(gòu)圖Fig. 4 The structure of Mm-SRBI gene

3 討論

B類Ⅰ型清道夫是膜受體蛋白， 能高親和力地結(jié)合HDL[13，14]、ox-LDL(氧化修飾低密度脂蛋白)和ac-LDL[5，15](乙?；兔芏戎鞍?等， 還參與炎癥反應、清除凋亡細胞和宿主防御等生理反應[16—21]。目前關(guān)于SRBI基因的研究主要集中在哺乳動物和模式動物， 如在果蠅(Drosophila melanogaster)中研究了SRBI基因在類胡蘿卜素轉(zhuǎn)運中的生理功能[22，23]、在家蠶中研究了黃繭的形成[19]。本實驗首次獲得文蛤Mm-SRBI基因的cDNA全長序列1676 bp， 開放閱讀框1515 bp， 編碼504個氨基酸，這與馬氏珠母貝SRB基因的開放閱讀框有1443 bp、編碼480個氨基酸的結(jié)果大致相當[7]。Mm-SRBI蛋白含一個CD36結(jié)構(gòu)域， 編碼455個氨基酸(14—469)。Mm-SRBI的CD36結(jié)構(gòu)域包含C端和N端的兩個跨膜區(qū)(1—29AA和449—504AA)， 一個胞外區(qū)， 有多個糖基化、蛋白激酶磷酸化等多種位點， 這與已報道的家蠶[3]和馬氏珠母貝[7]B型清道夫受體大致相同， 因此說明Mm-SRBI屬于含有CD36結(jié)構(gòu)域的B類清道夫受體家族。

已有研究證明， 類胡蘿卜素是維生素A的前體，動物不能從頭合成只能從食物中獲取[24]。SRBI基因是通過識別與高密度脂蛋白和低密度脂蛋白結(jié)合的類胡蘿卜素， 并將其轉(zhuǎn)運到細胞[18，19]。已有研究發(fā)現(xiàn)，SRBI基因在貝類中參與殼色的形成[8]， 如在華貴櫛孔扇貝中發(fā)現(xiàn)橘色貝的類胡蘿卜素含量高于白色貝， 且與B類清道夫受體基因的高表達相關(guān)，通過RNA干擾對該基因下調(diào)， 發(fā)現(xiàn)血液中類胡蘿卜素含量顯著降低， 為B類清道夫受體基因與類胡蘿卜素累積有關(guān)提供證據(jù)[6]。本實驗通過qRT-PCR技術(shù)證明紅殼文蛤Mm-SRBI基因在各個組織均有表達， 其中在外套膜的表達量最高； 不同殼色群體之間Mm-SRBI基因的表達量存在著較大的差異， 白殼的表達量較低而紅殼卻表達量顯著。先前的研究證明， 在紅殼文蛤外套膜中富含豐富的類胡蘿卜素，其含量是白殼文蛤的3倍多[8]。據(jù)此推測Mm-SRBI基因參與文蛤類胡蘿卜素的轉(zhuǎn)運和在外套膜上的富集， 從而影響紅殼色的形成。

大部分真核生物的基因都是由若干個編碼區(qū)和非編碼區(qū)組成的斷裂基因， 編碼區(qū)序列為外顯子，斷裂基因中的非編碼區(qū)序列為內(nèi)含子。諸多研究發(fā)現(xiàn)， 在生物體有極少數(shù)內(nèi)含子參與了機體內(nèi)基因表達調(diào)節(jié)， 如果蠅組織中的長內(nèi)含子在其兩側(cè)外顯子， 拼接之前通過共轉(zhuǎn)錄參與機體的表達調(diào)控[20]；小鼠血小板生成素基因(TPO)的第5內(nèi)含子， 可以提高TPO的表達[25]； 文蛤長鏈脂肪酸-CoA連接酶(ACSL)內(nèi)含子中， 有5個SNP與生長性狀顯著相關(guān)[26]。本研究克隆得到Mm-SRBI基因7596 bp的內(nèi)含子序列， 分析表明內(nèi)含子核苷酸序列均符合“GT開頭，AG結(jié)尾”的原則， 是真核生物RNA剪切的識別位

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