楊帆 楊寧 程天平 李向云 張健 王釗 劉波 鄭煒 馮金 郭宏強(qiáng)

1邢臺(tái)市人民醫(yī)院（河北邢臺(tái)054000）；2鄭州大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院（鄭州450008）

糖尿病是最常見(jiàn)的代謝紊亂性疾病，約影響了20%的人群［1］，并且其發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈逐年增長(zhǎng)的趨勢(shì)，由于人們生活習(xí)慣的不規(guī)律以及飲食的不節(jié)制，到2030年，可能持續(xù)增長(zhǎng)至3.66億［2］。糖尿病被認(rèn)為是萬(wàn)惡之源，引起各類并發(fā)癥，而其中糖尿病足潰瘍被認(rèn)為是嚴(yán)重影響患者身心健康的并發(fā)癥之一。據(jù)統(tǒng)計(jì)，嚴(yán)重的糖尿病足潰瘍是造成糖尿病患者截肢最重要的危險(xiǎn)因素［3］。有研究發(fā)現(xiàn)，潰瘍創(chuàng)面的愈合與創(chuàng)面的氧濃度密切相關(guān)，相對(duì)缺氧有利于傷口的愈合，而其可能的機(jī)制與缺氧誘導(dǎo)因子?1（hypoxia?inducible factor?1，HIF?1）相關(guān)。目前，糖尿病足的治療以內(nèi)科治療改善糖尿病病情，同時(shí)給予外科局部治療，直接作用于足部潰瘍面，達(dá)到治療糖尿病足潰瘍的作用。但在外科局部治療過(guò)程中，其作用機(jī)制并不明確，特別是血管新生及缺氧之間的關(guān)系沒(méi)有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，因此，本研究通過(guò)給予患者超聲清創(chuàng)刀聯(lián)合負(fù)壓創(chuàng)面系統(tǒng)治療糖尿病足潰瘍，探討超聲清創(chuàng)刀聯(lián)合負(fù)壓創(chuàng)面系統(tǒng)是否可以通過(guò)缺氧環(huán)境和血管新生達(dá)到治療糖尿病足潰瘍目的，為糖尿病足治療提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年6月至2017年6月于我院診治的糖尿病足潰瘍患者81例。納入標(biāo)準(zhǔn)：符合2015年美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)發(fā)布的《糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)》［4］；符合中華中醫(yī)藥學(xué)會(huì)發(fā)布的《糖尿病足潰瘍的診斷與治療研究》標(biāo)準(zhǔn)；Wagner分級(jí)在2～3級(jí)（2級(jí)為潰瘍創(chuàng)面深，無(wú)膿腫或骨感染；3級(jí)為深度感染，伴有骨組織的病變或深部膿腫）；無(wú)其他嚴(yán)重的器質(zhì)性病變，如腫瘤等；能夠配合完成該研究者，并簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法及基線分析

1.2.1 方法 將兩組患者隨機(jī)分為試驗(yàn)組與對(duì)照組，其中試驗(yàn)組46例，對(duì)照組35例。兩組患者均給予內(nèi)科治療，監(jiān)測(cè)血糖情況，改善肢體微循環(huán)，減少局部受壓，根據(jù)不同創(chuàng)面分泌物培養(yǎng)及藥敏實(shí)驗(yàn)，對(duì)不同的細(xì)菌感染選取針對(duì)性的抗生素（頭孢哌酮、哌拉西林等）抗感染。同時(shí)給予擴(kuò)張血管藥物如山莨菪堿或者是前列腺素等。對(duì)照組給予常規(guī)清創(chuàng)聯(lián)合創(chuàng)面系統(tǒng)治療，清洗創(chuàng)面消毒后，將聚乙烯乙醇水化海藻鹽泡沫敷料連接負(fù)壓吸引裝置。試驗(yàn)組采用超聲清創(chuàng)刀聯(lián)合負(fù)壓創(chuàng)面系統(tǒng)：選用北京厚凱醫(yī)療公司Ultraclean?超聲清創(chuàng)系統(tǒng)，通過(guò)超聲金屬探針和沖洗系統(tǒng)清洗傷口，工作頻率為50 kHz，壓強(qiáng)在70～106 kPa對(duì)創(chuàng)面進(jìn)行清洗，后連接負(fù)壓吸引裝置。兩組均在4～7 d進(jìn)行更換聚乙烯乙醇海藻鹽泡沫敷料。

1.2.2 兩組患者基線分析 通過(guò)對(duì)兩組患者的年齡、性別、體質(zhì)指數(shù)、1型糖尿病、2型糖尿病、平均糖尿病病程、高血壓、高脂血癥、口服抗生素等因素進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)比較發(fā)現(xiàn)，兩組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性，見(jiàn)表1。

1.3 檢測(cè)指標(biāo)

1.3.1 臨床療效比較 根據(jù)Wagner分級(jí)水平［5］結(jié)合臨床癥狀進(jìn)行臨床療效的判定：痊愈：癥狀完全消失，潰瘍創(chuàng)面基本愈合；顯效：癥狀基本消失，創(chuàng)面縮小＞60%；好轉(zhuǎn)：臨床癥狀雖無(wú)改善，但創(chuàng)面明顯縮小，分泌物減少；無(wú)效：癥狀無(wú)改善甚至加重，創(chuàng)面無(wú)縮小甚至擴(kuò)大。

1.3.2 兩組創(chuàng)面縮小率、肉芽覆蓋率及細(xì)菌清除率比較 創(chuàng)面縮小率=創(chuàng)面上皮覆蓋面積/初始創(chuàng)面面積×100%；肉芽覆蓋率=創(chuàng)面肉芽覆蓋面積/創(chuàng)面總面積；細(xì)菌清除率=（治療前菌屬數(shù)-治療后菌屬數(shù)）/治療前菌屬數(shù)。

1.3.3 創(chuàng)面局部組織血流灌注 治療前、治療后7及14 d采用組PeriScan PIM激光多普勒血流灌注成像儀對(duì)創(chuàng)面組織進(jìn)行掃描，取創(chuàng)面內(nèi)上下左右4個(gè)位置處血流灌注量，并取平均值。

1.3.4 Western Blot檢測(cè) 兩組患者治療前及治療14 d潰瘍組織中HIF?1α（美國(guó)，Abcam）及VEGF（美國(guó)，Abcam）的表達(dá)。在患者治療前及治療后14 d取患者足部潰瘍組織，常規(guī)提取蛋白，定量，煮蛋白定性。上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉后，加一抗過(guò)夜，洗膜，二抗孵育，上機(jī)檢測(cè)HIF?1α級(jí)VEGF的表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料采用±s表示，兩組間比較采用單因素方差分析和t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 兩組患者基線分析Tab.1 Two groups of patients baseline analysis 例（%）

2 結(jié)果

2.1 兩組臨床療效的比較 通過(guò)對(duì)兩組患者臨床療效的比較，可以發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組顯效率數(shù)及總有效率明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），而無(wú)效率明顯低于對(duì)照組（P＜0.05），說(shuō)明超聲清創(chuàng)刀聯(lián)合負(fù)壓創(chuàng)面系統(tǒng)效果優(yōu)于常規(guī)清創(chuàng)聯(lián)合創(chuàng)面系統(tǒng)治療，療效差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表2。

表2 兩組患者臨床療效的比較Tab.2 Comparison of clinical efficacy of two groups of patients 例（%）

2.2 創(chuàng)面縮小率、肉芽覆蓋率及細(xì)菌清除率比較 試驗(yàn)組的創(chuàng)面縮小率明顯大于對(duì)照組（P＜0.05），肉芽覆蓋率高于對(duì)照組（P＜0.05），說(shuō)明試驗(yàn)組潰瘍創(chuàng)面恢復(fù)優(yōu)于對(duì)照組。試驗(yàn)組細(xì)菌清除率明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），說(shuō)明試驗(yàn)組能夠有效的清除細(xì)菌，減少感染的概率。見(jiàn)表3。

表3 兩組患者創(chuàng)面縮小率、肉芽覆蓋率及細(xì)菌清除率比較Tab.3 Two groups of patients with wound shrinkage,granulation coverage and bacterial clearance rate ±s，%

表3 兩組患者創(chuàng)面縮小率、肉芽覆蓋率及細(xì)菌清除率比較Tab.3 Two groups of patients with wound shrinkage,granulation coverage and bacterial clearance rate ±s，%

注：與試驗(yàn)組比較，*P＜0.05

組別試驗(yàn)組對(duì)照組創(chuàng)面縮小率82.1±21.3 51.2±10.95*肉芽覆蓋率79.2±6.15 44.6±5.19*細(xì)菌清除率89.3±27.11 59.2±10.5*

2.3 創(chuàng)面局部組織血流灌注 在治療7 d后，兩組血流灌注比較差異無(wú)顯著性（P＞0.05），當(dāng)連續(xù)治療14 d后，試驗(yàn)組血流灌注明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）。見(jiàn)表4。

2.4 兩組患者在治療前及治療后14 d潰瘍組織中HIF?1α及VEGF的表達(dá)比較 為進(jìn)一步探討超聲清創(chuàng)刀聯(lián)合負(fù)壓創(chuàng)面系統(tǒng)改善血流的相關(guān)機(jī)制，本研究中檢測(cè)潰瘍中HIF?1α及血管生成因子VEGF的表達(dá)。通過(guò)比較可以發(fā)現(xiàn)，兩組在治療前HIF?1α及VEGF的表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而在連續(xù)治療14 d后，試驗(yàn)組潰瘍組織中HIF?1α的表達(dá)較對(duì)照組得到了明顯的升高（P＜0.05），同時(shí)VEGF的表達(dá)出現(xiàn)了明顯的上升（P＜0.05）。見(jiàn)圖1、2。

表4 兩組患者血流灌注的比較Tab.4 Comparison of two groups of patients perfusion x±s

圖1 兩組患者潰瘍組織在治療前后HIF-1α與VEGF蛋白表達(dá)的差異Fig.1 The difference of HIF-1αand VEGF protein expression in ulcer tissue between two groups before and after treatment

圖2 HIF?1α與VEGF蛋白光密度比值的差異Fig.2 HIF?1α and VEGF protein optical density ratio differences

3 討論

糖尿病足潰瘍是糖尿病眾多并發(fā)癥中嚴(yán)重影響人類健康的疾病。外周神經(jīng)病變和外周血管病變是足部潰瘍的主要原因，而關(guān)節(jié)活動(dòng)受限，肌肉改變和足部的畸形都可能增加該病的發(fā)病幾率。缺氧是潰瘍創(chuàng)口愈合的重要刺激因素，誘導(dǎo)VEGF、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子（SDF?1α）等相關(guān)細(xì)胞因子。VEGF對(duì)于血管的生成是必要的，其可以增加內(nèi)皮細(xì)胞增殖、存活、遷移，并促進(jìn)血管的生成［6］。MIAOMIAO 等［7］通過(guò)鏈脲霉素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠和高葡萄糖誘導(dǎo)的糖尿病足潰瘍中發(fā)現(xiàn)，由于糖尿病所引起的糖尿病足潰瘍VEGF的表達(dá)出現(xiàn)抑制，而給予3?甲基腺嘌呤（3?MA）（一種強(qiáng)效自噬抑制劑）可以明顯提高VEGF的表達(dá)，對(duì)足部細(xì)胞起到保護(hù)作用。LI等［8］通過(guò)在正常大鼠和糖尿病模型大鼠建立全層皮膚缺損傷口發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠的傷口明顯愈合緩慢，VEGF表達(dá)降低，血管生成障礙，而給予負(fù)壓治療后，VEGF、Fit?1及Ang2的表達(dá)都出現(xiàn)了上調(diào)，新的血管發(fā)育成熟。如何通過(guò)缺氧治療糖尿病足潰瘍，成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)，因此，本研究通過(guò)超聲清創(chuàng)刀聯(lián)合負(fù)壓系統(tǒng)治療糖尿病，并進(jìn)一步探討缺氧和VEGF與糖尿病足潰瘍之間的機(jī)制聯(lián)系。

HIF?1由α和β兩個(gè)亞基構(gòu)成，在正常氧氣條件下易降解，而在缺氧條件下表達(dá)穩(wěn)定。其中HIF?1α基因位于染色體14q21?q24，其靶基因包括能量代謝、血管生成及細(xì)胞增殖與活力。因此HIF?1α在胰島素不同的條件下，在糖酵解系統(tǒng)中激活很多基因［9］。HIF?1α在調(diào)節(jié)細(xì)胞氧穩(wěn)態(tài)和缺氧的適應(yīng)性方面發(fā)揮著重要的作用［10］。在正常的傷口愈合過(guò)程的早期階段，HIF?1α在傷口中呈高表達(dá)狀態(tài)［11］，而在糖尿病中，HIF?1α的功能受其共培養(yǎng)物p300（高葡萄糖誘導(dǎo)）的影響，導(dǎo)致HIF?1α的激活受損，血管生成減少［12］，并且隨著病情的進(jìn)展，一旦形成潰瘍，該損傷過(guò)程很難被逆轉(zhuǎn)。WANG等［13］研究發(fā)現(xiàn)，高血糖抑制HIF?1α的穩(wěn)定性和活性，導(dǎo)致體內(nèi)和體外傷口愈合所必須的HIF?1基因的表達(dá)出現(xiàn)了抑制。而通過(guò)化學(xué)抑制阻斷HIF?1α羥基化，可以逆轉(zhuǎn)高血糖癥所引起的HIF?1α下降，并改善傷口愈合的情況。CHEN等［14］發(fā)現(xiàn)通過(guò)DFO水溶性納米纖維支架作用于糖尿病足潰瘍模型大鼠發(fā)現(xiàn)，通過(guò)上調(diào)HIF?1α的表達(dá)，可以促進(jìn)新生血管的形成，促進(jìn)傷口的愈合。

負(fù)壓創(chuàng)面系統(tǒng)是一種創(chuàng)面物理治療方法，在20世紀(jì)90年代引入中國(guó)，其原理是通過(guò)無(wú)菌醫(yī)用材料覆蓋于創(chuàng)面，再通過(guò)負(fù)壓設(shè)備進(jìn)行持續(xù)的負(fù)壓吸引，由于其價(jià)格便宜、操作簡(jiǎn)單在臨床上被廣泛使用。但與此同時(shí)，負(fù)壓創(chuàng)面系統(tǒng)雖然可以有效排膿，但其殺菌、抗菌能力的能力較差，并且無(wú)法做到快速、準(zhǔn)確、無(wú)菌清除壞死組織，對(duì)深層次的壞死組織和深部感染效果較差。因此尋求更加有效的治療方法成為臨床治療中難題。超聲清創(chuàng)刀是利用超聲波的空化效應(yīng)、乳化效應(yīng)和止血效應(yīng)作用于復(fù)雜創(chuàng)口的清創(chuàng)設(shè)備［15］，可以提高清創(chuàng)的效率，減少對(duì)正常組織的損壞，降低患者的痛苦。超聲清創(chuàng)具有清創(chuàng)、殺菌和促進(jìn)潰瘍愈合的作用［17］。通過(guò)體外研究發(fā)現(xiàn)，超聲清創(chuàng)可以刺激細(xì)胞活性和蛋白質(zhì)的合成，激活炎性細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等可以促進(jìn)細(xì)胞愈合的化學(xué)介質(zhì)［17］，并且超聲能量在細(xì)胞和分子水平產(chǎn)生的機(jī)械力可以促進(jìn)細(xì)胞分裂。血管生成、生長(zhǎng)因子的釋放和刺激膠原合成來(lái)促進(jìn)細(xì)胞的愈合［18］。因此，本研究通過(guò)將超聲清創(chuàng)刀聯(lián)合負(fù)壓創(chuàng)面系統(tǒng)作用于糖尿病足潰瘍的患者，探討其臨床療效及可能的作用機(jī)制。在本研究中發(fā)現(xiàn)，通過(guò)二者聯(lián)合可以明顯提高臨床療效，患者的總有效率較對(duì)照組顯著提高，創(chuàng)面縮小率明顯增大、肉芽覆蓋率高于對(duì)照組。對(duì)兩組細(xì)菌清除率比較發(fā)現(xiàn)，試驗(yàn)組細(xì)菌清除率明顯高于對(duì)照組，說(shuō)明超聲清創(chuàng)刀能夠有效的清除細(xì)菌，減少感染的概率，說(shuō)明兩者聯(lián)合使用可以有效的做到殺菌、減少潰瘍面積，增加新生肉芽組織，促進(jìn)糖尿病足的痊愈。并且在檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)潰瘍組織中的血流灌注發(fā)現(xiàn)，在治療過(guò)程中，潰瘍組織中的血流逐漸增加，并且超聲清創(chuàng)刀聯(lián)合負(fù)壓創(chuàng)面系統(tǒng)血流明顯高于普通清創(chuàng)聯(lián)合負(fù)壓創(chuàng)面系統(tǒng)組。進(jìn)一步檢測(cè)潰瘍組織中的HIF?1α及VEGF的表達(dá)，結(jié)果顯示，在治療前，潰瘍組織中的HIF?1α及VEGF的表達(dá)明顯減少；而治療后，兩組HIF?1α及VEGF的表達(dá)都出現(xiàn)了明顯升高，并且試驗(yàn)組二者的升高更為明顯。HIF?1α是缺氧狀態(tài)下所產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄因子，HIF?1α的升高，說(shuō)明潰瘍內(nèi)缺氧狀態(tài)提高，有利于潰瘍組織的愈合。而VEGF作為血管生成因子，能夠有效促進(jìn)血管的生成，增加潰瘍內(nèi)的血流量。因此筆者認(rèn)為，超聲清創(chuàng)刀聯(lián)合負(fù)壓創(chuàng)面系統(tǒng)提高臨床療效、創(chuàng)面縮小率，增加血流是通過(guò)提高潰瘍組織中的HIF?1α及VEGF的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。

本研究首次將超聲清創(chuàng)刀聯(lián)合負(fù)壓創(chuàng)面系統(tǒng)的臨床療效與缺氧環(huán)境及血管新生之間的關(guān)系進(jìn)行探討，研究發(fā)現(xiàn)超聲清創(chuàng)刀聯(lián)合負(fù)壓創(chuàng)面系統(tǒng)可以提高臨床療效，提高創(chuàng)面縮小率、肉芽覆蓋率、細(xì)菌清除率，增加潰瘍組織血流，其可能機(jī)制是通過(guò)提高潰瘍組織中的HIF?1α及VEGF的表達(dá)而實(shí)現(xiàn)，為糖尿病足的治療提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。本研究的不足之處在于樣本量小，研究不夠深入，在后續(xù)的研究中通過(guò)擴(kuò)大樣本量，同時(shí)對(duì)HIF?1α及VEGF對(duì)糖尿病足潰瘍這一疾病發(fā)生發(fā)展的相關(guān)機(jī)制進(jìn)行深入研究，以HIF?1α及VEGF為靶點(diǎn)，為糖尿病足潰瘍的治療提供新的依據(jù)和思路。

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