張鑫磊 陳盼 夏裕寧 李雪梅 戴春光 譚永星桂林醫(yī)學(xué)院研究生院（廣西桂林 5400）；桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院護(hù)理部，重癥醫(yī)學(xué)科（廣西桂林5400）

腦缺血/再灌注（I/R）損傷是臨床常見的具有嚴(yán)重危害的病理生理過程，其損傷機(jī)制十分復(fù)雜，其中ROS自由基的大量生成及釋放是造成細(xì)胞損傷的主要因素，并引起一系列的反應(yīng)。線粒體是細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器，I/R發(fā)生時，線粒體結(jié)構(gòu)破壞、功能受損，啟動了線粒體途徑的凋亡［1］；其功能和結(jié)構(gòu)的研究對于臨床上I/R損傷的防治具有重要意義，并已成為當(dāng)前該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。氫氣是一種重要的生理性調(diào)節(jié)因子，研究［2］證實其在細(xì)胞和器官水平上具有明確的抗氧化應(yīng)激、抗凋亡作用；本研究擬用大鼠局灶性腦I/R損傷模型，觀察腹腔注射純H2后對大鼠腦I/R后神經(jīng)功能缺損評分及缺血皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細(xì)胞ROS生成率、線粒體膜電位水平變化、通透性轉(zhuǎn)換孔（MPTP）開放度和線粒體腫脹度等影響，探討氫氣對大鼠腦I/R損傷腦皮質(zhì)區(qū)線粒體功能和結(jié)構(gòu)的調(diào)控機(jī)制與氧化應(yīng)激時ROS生成率的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 成年健康雄性SPF級SD大鼠，體質(zhì)量為（230±10）g，由桂林醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（桂）2013?0001。

1.1.2 氫氣制備 使用純水氫氣發(fā)生器（濟(jì)南浩偉實驗儀器有限公司，型號SPE?300）產(chǎn)氫，電解純水后氫氣氧氣比例為2∶1。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備及處理 隨機(jī)將大鼠分為假手術(shù)組（Sham）、腦I/R組（MOD組）、氫氣治療組（H2組）。應(yīng)用Longa等的方法改良，使大鼠大腦中動脈阻塞形成實驗所需模型。此模型采用左側(cè)頸內(nèi)動脈線栓法。手術(shù)采用4%水合氯醛400 mg/kg腹腔注射麻醉。90 min后拔出栓線至頸外動脈殘端內(nèi)進(jìn)行再灌注24 h。Sham組除不插入栓線外其余操作同上。H2組于拔出栓線時腹腔注射10 mL氫氣，后每隔12 h注射1次。

1.2.2 神經(jīng)功能缺損評分 采用Longa等的5級4分法進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分并記錄神經(jīng)功能癥狀，0分：正常，無神經(jīng)損傷癥狀；1分：提尾時右側(cè)前肢不能完全伸展；2分：行走時向右側(cè)轉(zhuǎn)圈；3分：行走時向右側(cè)跌倒；4分：不能自發(fā)行走，意識水平下降。1～3分即為制模成功。

1.2.3 皮質(zhì)區(qū)缺血神經(jīng)細(xì)胞線粒體的提取 每組8只，I/R手術(shù)24 h后麻醉狀態(tài)下用冰生理鹽水經(jīng)心臟灌注后取腦，按照線粒體提取試劑盒（索萊寶）步驟進(jìn)行操作，整個提取過程在0～4℃下進(jìn)行，線粒體含量以分離出的胞漿蛋白含量表示。提取出的線粒體進(jìn)行后續(xù)檢測。

1.2.4 ROS生成率測定 按照活性氧檢測試劑盒（碧云天）操作。用熒光酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測（Tecan，In?finite F500）熒光強(qiáng)度變化情況（測定5～10 min，激發(fā)波長499 nm，發(fā)射波長521 nm）。測試過程保持37℃恒溫。以熒光強(qiáng)度（RFU）來表示生成速率。

1.2.5 JC?1法測定△ψm水平變化 按照線粒體膜電位檢測試劑盒（JC?1）說明操作，用熒光酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測，激發(fā)波長484 nm，發(fā)射波長590 nm，以熒光強(qiáng)度（RFU）來表示各組膜電位水平。同時將此樣本用倒置熒光顯微鏡進(jìn)行熒光拍照，正常線粒體內(nèi)，JC?1聚集在線粒體基質(zhì)中形成聚合物，聚合物發(fā)出強(qiáng)烈的紅色熒光；不健康的線粒體由于膜電位的下降或喪失，JC?1只能以單體的形式存在于胞漿中，產(chǎn)生綠色熒光。

1.2.6 MPTP開放度測定 按照純化線粒體膜通道孔紅色熒光檢測試劑盒（GENMED）說明操作，用熒光酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測，激發(fā)波長540 nm，發(fā)射波長580 nm，以熒光強(qiáng)度降低來表明MPTP增強(qiáng)。

1.2.7 線粒體腫脹度的測定 將提取的線粒體懸液分裝出數(shù)份，加入蔗糖溶液，充分混勻后7 000g，4℃，離心10 min后去上清，重復(fù)洗滌1次。加入1 mL蔗糖溶液，混勻后移入清潔的比色杯中，再加入1 μL 200 mmol/L的CaCl2溶液充分混勻。用熒光酶標(biāo)儀進(jìn)行檢測在單波長540 nm處每隔30 s連續(xù)監(jiān)測3 min，記錄數(shù)值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗結(jié)果用SPSS 18.0進(jìn)行統(tǒng)計分析處理，所得的數(shù)值均以±s表示。各組間數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析比較，兩兩比較應(yīng)用最小顯著性差異法（LSD）檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SD大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀及評分 Sham組的大鼠無行為學(xué)異常，行動敏捷，反應(yīng)正常；MOD組的大鼠精神不振，前進(jìn)時向右側(cè)轉(zhuǎn)圈跛行，反應(yīng)遲鈍；H2組的大鼠行動較MOD組敏捷，行走較快且不轉(zhuǎn)圈，反應(yīng)較快，神經(jīng)功能缺損評分明顯低于MOD組（P＜0.01）。見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分（n=6）Tab.1 Neurological deficit scores of rats in each group

2.2 ROS生成率 熒光強(qiáng)度的大小代表ROS的生成率，結(jié)果顯示，與Sham組相比，MOD組ROS水平明顯升高（P＜0.01）；與MOD組相比，H2組ROS水平有明顯降低（P＜0.01），見圖1。

2.3 線粒體腫脹度的水平 線粒體腫脹時540 nm處吸光度下降，結(jié)果顯示，與Sham組相比，MOD組線粒體腫脹度升高（P＜0.01）；與MOD組相比，H2組線粒體腫脹度降低（P＜0.01），見圖2。

2.4 △ψm水平及MPTP開放度 熒光強(qiáng)度的大小代表△ψm水平及MPTP開放度的高低，結(jié)果顯示，與Sham組相比，MOD組△ψm水平降低（P＜0.01）、MPTP開放度升高（P＜0.01）；與MOD組相比，H2組△ψm水平升高（P＜0.01）、MPTP開放度降低（P＜0.01），見圖 3、4。熒光拍照顯示，與Sham組相比，MOD組紅色熒光減弱，綠色熒光增強(qiáng)；與MOD組相比，H2組紅色熒光增強(qiáng)，綠色熒光減弱，見圖5。

圖1 R O S生成率Fig.1 Active oxygen generation rate

圖2 線粒體腫脹度Fig.2 Mitochondrial swelling degree

圖3 線粒體膜電位 圖4 線粒體熒光拍照 圖5 MPTP開放度Fig.3 Mitochondrial membrane potential Fig.4 Mitochondrial fluorescence photography Fig.5 Opening degree of mitochondrial permeability transition pore

3 討論

目前研究發(fā)現(xiàn)［3-4］，正常生理狀態(tài)下ROS生成率處于低水平，當(dāng)I/R使腦細(xì)胞產(chǎn)生損傷時ROS自由基的大量生成及釋放引起氧化應(yīng)激損傷；I/R同時可引起線粒體功能受損，最終造成細(xì)胞凋亡，但其具體機(jī)制及與ROS生成率的關(guān)系尚不明確。為探討大鼠腦I/R皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)功能異常是否由過量的ROS引發(fā)和H2對神經(jīng)細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)功能的保護(hù)作用機(jī)制。本研究擬采用大鼠局灶性腦I/R損傷模型，觀察應(yīng)用H2后對大鼠腦I/R后神經(jīng)功能缺損評分及缺血皮質(zhì)區(qū)神經(jīng)細(xì)胞線粒體功能的影響。

線粒體作為細(xì)胞呼吸和物質(zhì)氧化的中心，在各種細(xì)胞過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用［5-7］。研究［8］表明，正常生理狀態(tài)下，線粒體膜的完整性維持著△ψm及MPTP開放度處于正常水平?！鳓譵是由線粒體膜內(nèi)負(fù)外正的電位差特性形成，其在維護(hù)線粒體內(nèi)外物質(zhì)平衡及保持線粒體正常功能方面發(fā)揮著重要作用。△ψm是線粒體合成ATP的動力，一旦△ψm消散和（或）電子傳遞受阻導(dǎo)致△ψm下降，可使細(xì)胞不能合成足夠的ATP而無法完成正常的生命活動［10］。MPTP是反映線粒體功能及結(jié)構(gòu)完整性的重要指標(biāo)，防止其大量開放可有效預(yù)防腦I/R引起的神經(jīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷及功能損害，現(xiàn)已逐漸成為關(guān)注的熱點(diǎn)［11］。同時線粒體通常被認(rèn)為是在I/R時ROS產(chǎn)生的主要場所，腦I/R損傷初期即有大量的ROS生成［9］；本研究結(jié)果顯示，Sham組沒有發(fā)生I/R，ROS處于正常水平，未產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷，線粒體功能指標(biāo)△ψm，MPTP開放度，腫脹度都處于正常水平。MOD組因發(fā)生I/R，ROS生成率升高產(chǎn)生氧化應(yīng)激損傷；同時△ψm，MPTP開放度，腫脹度都發(fā)生改變，線粒體功能受損。因此筆者猜測I/R時引起ROS升高，過量的ROS自由基破壞了線粒體膜，引起線粒體功能受損，△ψm水平下降，MPTP開放增加，線粒體發(fā)生腫脹。因此減少ROS的生成，維護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)完整性，穩(wěn)定△ψm水平，抑制并阻斷病理狀態(tài)下MPTP不可逆的長時程開放，是腦保護(hù)的重要環(huán)節(jié)。

H2是一種重要的生理性調(diào)節(jié)因子，能通過氣體擴(kuò)散穿過血腦屏障和細(xì)胞膜及細(xì)胞器膜到達(dá)線粒體，具有明確的選擇性抗氧化等臟器保護(hù)作用。國內(nèi)外研究表明［12-15］，呼吸氫氣或注射飽和氫氣生理鹽水均可通過抗炎、抗氧化和抗凋亡等作用對大鼠腦缺血缺氧和腦創(chuàng)傷，以及對心臟、肺臟、腎臟I/R損傷產(chǎn)生明顯保護(hù)作用。本實驗采用電解水制取H2并直接腹腔注射，相比于呼吸氫氣或靜脈注射飽和氫氣生理鹽水效果更加確切，可控性更好。H2主要作用是選擇性清除自由基，減少ROS的產(chǎn)生?；钚匝蹙哂泻軓?qiáng)的氧化還原作用，可以和細(xì)胞的各種成分發(fā)生相互作用，引起一些膜和酶的功能改變［16］，尤其是線粒體膜損傷，導(dǎo)致細(xì)胞損傷，最終導(dǎo)致MPTP開放增加。所以應(yīng)用氫氣治療后可以減少氧化應(yīng)激的損害，從而使線粒體膜的破壞程度降低維持其完整性。實驗結(jié)果中，使用氫氣治療后與MOD組相比，ROS生成率明顯降低，膜電位明顯升高，MPTP開放度降低，線粒體腫脹度降低，起到了保護(hù)線粒體功能的作用。本研究同時引入缺損功能評分檢測，可以更直觀地分析大鼠I/R損傷線粒體功能下降后在行為上的變化，以及氫氣治療后在行為表現(xiàn)上的改善效果。

綜上所述，I/R同時腹腔注射純氫氣可改善大鼠I/R后的神經(jīng)功能評分，對I/R損傷后的大鼠有明確的保護(hù)作用。其機(jī)制可能通過減少ROS生成，減輕氧化應(yīng)激損傷，維持了線粒體膜完整性從而增強(qiáng)△ψm的穩(wěn)定性限制線粒體MPTP開放，進(jìn)而維持線粒體結(jié)構(gòu)完整及功能穩(wěn)態(tài)等有關(guān)。同時本研究僅從單方面分析了線粒體損傷的機(jī)制，存在許多不足，下一步將從細(xì)胞自噬方面來分析線粒體損傷的更多可能的機(jī)制。

參考文獻(xiàn)

［1］FAIZI M，SEYDI E，ABARGHUYI S，et al.A Search for Mito?chondrial Damage in Alzheimer′s Disease Using Isolated Rat Brain Mitochondria［J］.Iran J Pharm Res，2016，15（Suppl）：185?195.

［2］袁楠楠，夏裕寧，張鑫磊，等.氫氣對大鼠全腦缺血再灌注損傷海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的保護(hù)作用［J］.實用醫(yī)學(xué)雜志，2016，32（6）：870?874.

［3］JANKAUSKAS S S，ANDRIANOVA N V，ALIEVA I B，et al.Dysfunction of kidney endothelium after ischemia/reperfusion and its prevention by mitochondria?targeted antioxidant［J］.Bio?chemistry（Mosc），2016，81（12）：1538?1548.

［4］WANG Z，KANG B，LI W，et al.Hydrogen sulfide protects car?diomyocytes against apoptosis in ischemia/reperfusion through MiR?1?regulated histone deacetylase 4 pathway［J］.Cell Physiol Biochem，2016，41（1）：10?21.

［5］DYMKOWSKA D.Oxidative damage of the vascular endotheli?um in type 2 diabetes?the role of mitochondria and NAD（P）H oxidase［J］.Postepy Biochem，2016，62（2）：116?126.

［6］BIAAS A J，SITAREK P，MIKOWSKA J，et al.The role of mito?chondria and oxidative/antioxidative imbalance in pathobiology of chronic obstructive pulmonary disease［J］.Oxid Med Cell Longev，2016，2016：7808576.

［7］GUEGUEN N，DESQUIRET V，LEMAN G，et al.Resveratrol directly binds to mitochondrial complex I and increases oxida?tive stress in brain mitochondria of aged mice［J］.PLoS One，2015，10（12）：e0144290.

［8］崔耀梅，程慧嫻，曾憲明，等.富氫液對大鼠腦缺血/再灌注損傷后海馬線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔及細(xì)胞凋亡的影響［J］.中國藥理學(xué)通報，2012，28（6）：853?857.

［9］LI H，SUN J J，CHEN G Y，et al.Carnosic acid nanoparticles suppress liver ischemia/reperfusion injury by inhibition of ROS，Caspases and NF?κB signaling pathway in mice［J］.Biomed Pharmacother，2016，82：237?246.

［10］ ALIZADEH R，NAVID S，ABBASI N，et al.The effect of amino?guanidine on sperm motility and mitochondrial membrane poten?tial in varicocelized rats［J］.Iran J Basic Med Sci，2016，19（12）：1279?1284.

［11］ TAMARA A，OLGA K，YULIA B，et al.Effect of the CRAC peptide，VLNYYVW，on mPTP Opening in rat brain and liver mitochondria［J］.Int J Mol Sci，2016，17（12）：2096.

［12］ STOJANOVIC M，ZIVKOVIC V，SREJOVIC I，et al.The role of hydrogen sulfide in homocysteine?induced cardiodynamic effects and oxidative stress markers in the isolated rat heart［J］.Physi?ol Int，2016，103（4）：428?438.

［13］ GAO Y，YANG H，F(xiàn)AN Y，et al.Hydrogen?Rich saline attenu?ates cardiac and hepatic injury in doxorubicin rat model by in?hibiting inflammation and apoptosis［J］.Mediators Inflamm，2016，2016：1320365.

［14］ 譚永星，夏裕寧，袁楠楠，等.PI3K/Akt/GSK?3β信號通路在氫抑制局灶性腦缺血再灌注誘發(fā)大鼠神經(jīng)元凋亡中的作用［J］.中華麻醉學(xué)雜志，2016，36（9）：1058?1062.

［15］ 劉寧，王薇，張蕊，等.富馬酸氯馬斯汀在肺缺血/再灌注損傷中對TLR4表達(dá)的影響［J］.實用醫(yī)學(xué)雜志，2016，32（18）：2988?2991.

［16］ MADUNGWE N B，ZILBERSTEIN N F，F(xiàn)ENG Y，et al.Criti?cal role of mitochondrial ROS is dependent on their site of pro?duction on the electron transport chain in ischemic heart［J］.Am J Cardiovasc Dis，2016，6（3）：93?108.