劉艷 徐三清 龍文君 盧慧玲

華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院兒科（武漢 430030）

近年來，母親長期高飽和脂肪酸飲食與子代神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常之間的關(guān)系受到廣大學(xué)者的重視。母親攝入的飽和脂肪酸均可通過胎盤和母乳傳遞給胎兒及新生兒［1-2］。此外，血液中的脂肪酸能以游離形式彌散通過血腦屏障。研究［3-4］表明高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠，脂肪組織C5a及C5aR表達(dá)明顯升高。C5a是補(bǔ)體C5的活化片段。高脂飲食可誘導(dǎo)補(bǔ)體系統(tǒng)激活，補(bǔ)體活化產(chǎn)物C5a通過與其受體C5aR結(jié)合，參與異常代謝信號誘發(fā)的炎癥反應(yīng)［4］。但C5a?C5aR信號在暴露于母親高飽和脂肪酸飲食的子代腦組織炎性損傷中的作用及機(jī)制，還很少有研究涉及。研究表明，在原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中給予飽和脂肪酸——棕櫚酸（palmitic acid，PA）干預(yù)后顯著增加星形膠質(zhì)細(xì)胞炎性細(xì)胞因子 TNF?α、IL?6的釋放，給予 p44/42 MAPK（ERK1/2）抑制劑后，能阻止PA誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞炎性因子的釋放［5］。表明飽和脂肪酸可能通過激活MAPK信號途徑中的ERK通路介導(dǎo)腦組織炎癥反應(yīng)。但高脂誘發(fā)的C5a?C5aR激活是否也是通過ERK通路從而誘發(fā)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)尚不清楚。

PA是飽和脂肪酸家族的重要成員之一。本實驗擬通過PA及C5aR拮抗劑干預(yù)原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞，觀察ERK mRNA及蛋白、小膠質(zhì)細(xì)胞炎性因子表達(dá)情況，旨在探討脂肪酸對小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥的影響及C5a?C5aR在此過程中的作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 一般材料 出生后1 d的小鼠，由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，動物許可證號為SCXK（鄂）2010?0009。熒光定量PCR試劑（Western Biotechnology），SYBR Green I（上海開放科技，中國），一抗：Iba1、ERK1/2、p?ERK1/2（Ab?cam），內(nèi)參一抗（sigma，美國），二抗：羊抗兔IgG、羊抗小鼠 IgG（sigma，美國），TNF?α ELISA 試劑盒。熒光定量PCR儀 FTC2000（Canada），垂直板電泳轉(zhuǎn)移裝置（Bio?Rad，美國），圖像分析系統(tǒng)（LabworksTM Analysis Softwar，美國），電泳儀（Bio?Rad，美國），酶標(biāo)儀（美國寶特Bio?Tek），酶聯(lián)免疫檢測儀（美國寶特Bio?Tek）。

1.2 小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng) 新生24 h內(nèi)清潔級小鼠，購于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心。75%酒精消毒新生小鼠，在無菌條件下斷頭，剪開頭皮及顱骨，取出腦組織，置于盛冷的pH 7.2無鈣、鎂的D?Hank′s液的平皿中。無菌剝離腦組織，除去小腦、海馬、大腦髓質(zhì)，分離大腦皮層。用虹膜剪將組織剪切成1 mm3左右的組織塊，0.125%胰蛋白酶消化，37℃作用20 min。棄去上清液，加入完全接種液終止消化，漂洗2次。吸管輕輕吹打至肉眼觀察無明顯的腦組織團(tuán)塊，靜置2 min。懸液收集于新的離心管，離心（1 000 r/min，10 min，4℃），棄去上清液。加入完全培養(yǎng)液重懸，200目不銹鋼網(wǎng)過濾。置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后更換一次培養(yǎng)基，以后每3天換一次液。

細(xì)胞培養(yǎng)14～16 d左右，在倒置相差顯微鏡下可觀察到混和膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物中出現(xiàn)細(xì)胞分層現(xiàn)象。用0.05%胰酶2～3 mL消化，待貼附在星形膠質(zhì)細(xì)胞上的小膠質(zhì)細(xì)胞脫離下來，將含漂浮的小膠質(zhì)細(xì)胞的消化液轉(zhuǎn)入10 mL離心管，1 000 r/min，離心5 min，棄上清；加定量完全培養(yǎng)再次吹打成細(xì)胞懸液，接種于預(yù)先包被的置有蓋玻片的24孔培養(yǎng)板，置于CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。生長24 h后吸掉培養(yǎng)液，以去除未貼壁的少突膠質(zhì)細(xì)胞，加完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 免疫組化檢測小膠質(zhì)細(xì)胞Iba1表達(dá) 細(xì)胞用消化液消化后，用完全培養(yǎng)基重懸調(diào)整細(xì)胞密度至2×104/mL。在無菌的12孔板中鋪上細(xì)胞爬片。取細(xì)胞懸液分別滴到圓片上，讓細(xì)胞貼片30 min。在培養(yǎng)皿中補(bǔ)加完全培養(yǎng)液，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取出培養(yǎng)皿，用PBS漂洗2次；4%多聚甲醛固定20 min；PBS漂洗；1%Triton X?100 處理15 min；PBS漂洗；3%H2O2處理15 min；PBS漂洗。

山羊血清室溫封閉60 min；取出甩干封閉液；一抗孵育（稀釋比1∶200）4℃過夜。陰性對照用PBS液代替一抗；PBS清洗標(biāo)本3次；生物素標(biāo)記二抗工作液孵育37℃30 min；PBS清洗標(biāo)本；堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液37℃30 min；PBS清洗標(biāo)本；DAB顯色（避光，鏡下觀察至棕色）10 min；蒸餾水洗2次；蘇木素復(fù)染5 min；自來水洗返藍(lán)；梯度酒精脫水75%、85%、95%、100%各3 min；二甲苯透明2次；中性樹膠封片。

1.4 QT?PCR檢測ERK1/2的mRNA表達(dá) 試驗共分 3組：對照組、PA（200 μmol/L）處理組、PA（200 μmol/L）+PMX53（100 nmol/L）處理組［5-6］。采用熒光定量PCR SYBR green I法進(jìn)行檢測，引物見表1所示（mactin作為內(nèi)參）。采用TRIzol試劑法提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，反轉(zhuǎn)錄mRNA為cDNA，采用20 μL體系進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，條件為：25 ℃ 10 min；42 ℃50 min；85 ℃ 5 min。熒光定量PCR采用50 μL體系進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增條件為：94℃4 min；94℃ 20 s、60℃30 s、72℃30 s循環(huán)35次，72℃檢測信號。

表1 熒光定量PCR引物列表Tab.1 Fluorescence quantitative PCR primer list

1.5 Western blot檢測Iba1、ERK1/2和p?ERK1/2蛋白表達(dá) 試驗分組同上。采用Western blot檢測Iba1、ERK1/2和p?ERK1/2蛋白在PA和PA+C5aR拮抗劑處理組中的表達(dá)。采用RIPA buffer裂解法對細(xì)胞進(jìn)行裂解，提取總蛋白。BCA法測定蛋白濃度。對不同試驗組中的蛋白樣品進(jìn)行SDS?PAGE電泳：4%的濃縮膠和10%的分離膠，樣品與5×SDS上樣緩沖液按4：1比例混合，混勻后沸水中煮5 min使蛋白變性。80 V跑過濃縮膠后轉(zhuǎn)換電壓至120 V，待溴酚蘭跑到膠板底部即可。電泳結(jié)束后采用PVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜實驗，將電流調(diào)整到恒流200 mA，轉(zhuǎn)移約1 h。

用封閉液將對應(yīng)的一抗稀釋成一定的濃度（1∶500），內(nèi)參一抗的稀釋終濃度為1∶3 000，然后溫育1.5 h。用TBST清洗3次，每次5 min。用封閉液將二抗稀釋成一定的濃度（1∶3 000），然后溫育1.5 h。用TBST清洗4次，每次5 min。將A和B兩種試劑在試管內(nèi)等體積混合，然后加在PVDF膜的正面，溫育大概2 min。進(jìn)入暗室，PVDF膜上蓋一層保鮮膜，擦去多余的發(fā)光劑。依照發(fā)光的強(qiáng)度選擇不同的曝光時間將膠片放入顯影液中，出現(xiàn)條帶后，立即放入定影液中，流水沖洗膠片后晾干。對膠片進(jìn)行掃描，用UVP凝膠圖象處理系統(tǒng)Labworks 4.6軟件分析目的條帶的灰度值。

1.6 ELISA檢測TNF?α的表達(dá) 采用ELISA試劑盒檢測小鼠TNF?α的表達(dá)水平。首先制作各細(xì)胞因子的標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后根據(jù)測定的各樣品OD值算出細(xì)胞因子數(shù)值。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用GraphPad Prism5對結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組之間總體均數(shù)比較使用one?way ANOVA，兩組間比較采用 Student?t檢驗。

2 結(jié)果

2.1 小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定 本研究成功構(gòu)建小鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)（圖1A），可用于后續(xù)實驗。免疫組化結(jié)果顯示，Iba1蛋白廣泛分布于小鼠原代小膠質(zhì)細(xì)胞中（圖1B中棕色顆粒部分），表明小膠質(zhì)細(xì)胞增殖狀態(tài)良好。

圖1 小膠質(zhì)細(xì)胞原代培養(yǎng)及鑒定（×400）Fig.1 Microglia primary culture and identification（× 400）

2.2 PA及PA+PMX53干預(yù)后小膠質(zhì)細(xì)胞Iba1表達(dá)情況 200 μmol/L PA干預(yù)后，小膠質(zhì)細(xì)胞Iba1蛋白表達(dá)較對照組明顯提高（t=33.46，P＜0.001）；PA+PMX53組較PA組Iba1蛋白表達(dá)均有所下降（t=53.11，P＜0.001）。見圖2。

圖2 各組Iba1蛋白表達(dá)Fig.2 The expression of Iba1 protein

2.3 PA及PA+PMX53干預(yù)后小膠質(zhì)細(xì)胞ERK1/2 mRNA及蛋白表達(dá)情況 PA組較對照組ERK1/2 mRNA表達(dá)明顯增加（t=13.3，P=0.005 6）；PA+PMX53組較PA組ERK1/2 mRNA表達(dá)下降（t=16.78，P＜0.001）。見圖3A。各組ERK1/2蛋白表達(dá)均無差異，見圖3B及3D。PA干預(yù)后，p?ERK1/2蛋白表達(dá)較對照組明顯升高（t=204.1，P＜0.001）；PA+PMX53組較PA組p?ERK1/2蛋白表達(dá)下降（t=147.9，P＜0.001）。見圖3C及3D。

圖3 各組ERK1/2 mRNA及蛋白表達(dá)Fig.3 The expression of ERK1/2 mRNA and protein

2.4 PA及PA+PMX53干預(yù)后小膠質(zhì)細(xì)胞炎性因子表達(dá)情況 PA干預(yù)后，TNF?α表達(dá)均較對照組明顯升高（t=26.69，P＜0.001）；PA+PMX53組較PA組TNF?α表達(dá)均有所下降（t=9.55，P=0.000 7）。見圖4。

圖4 各組TNF?α濃度Fig.4 The concentration of TNF?α in different groups

3 討論

孕前期及孕期高脂飲食致母親肥胖可以導(dǎo)致兒童及青少年認(rèn)知功能異常、注意力缺陷多動障礙和精神異常等［7］。關(guān)于母親長期高脂飲食導(dǎo)致子代神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常的潛在機(jī)制并不清楚。有研究［8-9］認(rèn)為與激發(fā)子代腦內(nèi)與認(rèn)知功能密切相關(guān)的部位如海馬及大腦皮質(zhì)炎癥反應(yīng)有一定關(guān)系。從側(cè)腦室注射飽和脂肪酸后，腦組織中炎性細(xì)胞因子TNF?α、IL?6及IL?1β表達(dá)明顯增加［10］。表明飽和脂肪酸可以誘導(dǎo)腦組織炎癥反應(yīng)。本研究采用體外細(xì)胞實驗的方法，體外培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞中加入PA干預(yù)后，小膠質(zhì)細(xì)胞Iba1蛋白表達(dá)較對照組明顯增加，相應(yīng)的炎性因子TNF?α濃度也顯著增加，表明PA誘導(dǎo)了小膠質(zhì)細(xì)胞活化及炎癥反應(yīng)。

近年來，通過對C5aR特異性拮抗劑PMX205及C5aR基因敲除模型（C5aR-/-）在中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎性疾病中的研究，更進(jìn)一步證實C5a?C5aR信號在中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變中起著重要的作用。在宮內(nèi)炎性暴露的早產(chǎn)兒腦損傷及缺血性中風(fēng)模型中，C5aR基因敲除的小鼠和使用C5aR拮抗劑的小鼠則顯示神經(jīng)元凋亡明顯減少，腦組織病變減輕［6，11］。用PMX205治療阿爾茨海默病12周后膠質(zhì)細(xì)胞活化程度降低、Aβ聚集減少，記憶力改善［12］。PMX53是人工合成的環(huán)肽片段，也是C5aR的特異性拮抗劑，可阻斷C5a的主要生物學(xué)效應(yīng)，在許多損傷及炎癥模型中被證實可減輕腦損傷、內(nèi)毒素性休克、敗血癥、炎性腸病等多種炎癥性損傷，取得了比較肯定的效果［13-14］。本研究也觀察到，PMX53干預(yù)后，小膠質(zhì)細(xì)胞Iba1蛋白表達(dá)及炎性因子TNF?α濃度均較PA組明顯降低，表明PA可能通過C5a?C5aR誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活化及炎癥。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)脫髓鞘病變中，C5a可通過激活星形膠質(zhì)細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞的MAPK信號途徑中的ERK1/2通路，誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子和趨化因子釋放［15］。ERK是MAPK家族的重要成員，也是介導(dǎo)和調(diào)控細(xì)胞外信號到細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)的重要激酶。ERK信號通路不僅與細(xì)胞的增殖和分化密切相關(guān)［16］，而且在炎癥反應(yīng)中也具有重要作用［17］?？侲RK1/2包括磷酸化ERK1/2（p?ERK1/2）和非磷酸化 ERK1/2，p?ERK1/2是 ERK1/2的活性形式。ERK通路是否參與了PA誘發(fā)的C5a?C5aR激活及小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)？本研究結(jié)果顯示PA干預(yù)后，盡管ERK1/2蛋白表達(dá)較對照組無明顯差異，但ERK1/2 mRNA及p?ERK1/2蛋白表達(dá)較對照組明顯升高；而給予C5aR拮抗劑后ERK1/2 mRNA及p?ERK1/2蛋白表達(dá)較PA組有所下降，表明ERK信號的活化與C5a?C5aR激活有一定關(guān)系，但C5a?C5aR激活是否通過ERK信號活化來誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥，尚需進(jìn)一步研究如加用ERK的抑制劑。

綜上所述，本研究表明PA可誘發(fā)小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)，其作用機(jī)制可能通過C5a?C5aR，激活ERK1/2使其磷酸化，啟動ERK1/2MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而激活小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥。C5aR拮抗劑在炎癥性損傷疾病具有神經(jīng)保護(hù)作用。由于疾病的發(fā)展受很多條件影響，且在體內(nèi)還有很多未知因素參與，所以僅通過體外實驗不能很好地解釋發(fā)病機(jī)制，在后期的實驗中，筆者一方面在體外實驗中增加ERK的抑制劑進(jìn)一步闡明C5a?C5aR與ERK信號的關(guān)系，另一方面將通過體內(nèi)實驗著手C5a?C5aR在孕前期及孕期高脂飲食母親子代腦組織炎癥中的作用及機(jī)制研究，從而為代謝性炎癥所致腦損傷性疾病研究提供策略與指導(dǎo)。

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