劉春艷 毛熙光西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科（四川瀘州 646000）；四川省南充市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科（四川南充 637000）

宮頸癌是女性最高發(fā)的惡性腫瘤之一［1］，根治性切除、放化療均為有效的治療手段［2］。順鉑是最常用的化療藥物，然而，部分患者由于腫瘤進(jìn)展而對(duì)其敏感性降低，發(fā)生耐藥抵抗，因此目前亟待明確順鉑耐藥抵抗的分子機(jī)制［3］。去泛素化酶調(diào)節(jié)多種細(xì)胞生物學(xué)進(jìn)程。研究［4］表明USP22在腫瘤進(jìn)展中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，并與化療藥物耐藥密切相關(guān)［5］，是腫瘤生物治療的潛在靶點(diǎn)。更為重要的是USP22在宮頸癌組織中高表達(dá)，并與宮頸癌不良預(yù)后相關(guān)［6］。然而，宮頸癌細(xì)胞中USP22的表達(dá)及其對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖及順鉑化療敏感性的影響，尚無(wú)研究報(bào)道。本研究擬通過qRT?PCR技術(shù)檢測(cè)宮頸癌細(xì)胞中USP22的表達(dá)情況，并分析其對(duì)細(xì)胞增殖及順鉑化療敏感性的影響，有望鑒定新的宮頸癌順鉑耐藥相關(guān)分子。

1 資料與方法

1.1 一般資料 Trizol購(gòu)于美國(guó)Sigma公司，5×PrimeScript RT master和 SYBR premix Ex TaqⅡ試劑盒購(gòu)于日本TaKaRa公司，CCK?8試劑盒購(gòu)于日本同仁公司，凋亡試劑盒購(gòu)于美國(guó)BD公司。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取及反轉(zhuǎn)錄 細(xì)胞中加入1 mL Trizol裂解至懸液呈透明狀。離心上清轉(zhuǎn)移至新離心管中。加入裂解液1/5體積的氯仿，用力振蕩至充分乳化。離心吸取上清液，加入等體積異丙醇。棄去上清，75%的乙醇，離心所得沉淀即為所需RNA。反轉(zhuǎn)錄：1 μL RNA，2 μL 5×PrimeScript RT master，7 μL去離子水。反應(yīng)條件為：37 ℃ 15 min，85℃ 5 s，4℃。

1.2.2 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng) PCR反應(yīng)體系12.5 μL SYBR premix Ex TaqⅡ，1 μL USP22 或β?actin正義鏈引物，1 μL USP22或β?actin反義鏈引物，2 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，8.5 μL去離子水。反應(yīng)條件為：預(yù)變性 95 ℃ 30 s；擴(kuò)增95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。

1.2.3 細(xì)胞增殖 轉(zhuǎn)染USP22及USP22 siRNAs 48 h至HeLa細(xì)胞，而后接種于96孔板中。培養(yǎng)24、48、72、96、120 h后取96孔板加入CCK?8試劑，37℃孵育45 min，酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度值，測(cè)量完畢后，繪制細(xì)胞增殖曲線。

1.2.4 細(xì)胞存活 細(xì)胞接種24 h后，加入順鉑，繼續(xù)培養(yǎng) 48 h，加入 10 μL CCK?8 試劑，孵育 1 h。450 nm測(cè)定吸光度值。計(jì)算公式為：細(xì)胞存活%=（加藥細(xì)胞OD?空白OD）/（對(duì)照細(xì)胞OD?空白OD）×100%。

1.2.5 細(xì)胞凋亡 制備細(xì)胞懸液，用5 mL PBS洗滌3次后，加入FITC標(biāo)記的Annexin?V（20 μg/mL）10 μL，及PI（50 μg/mL）5 μL，避光反應(yīng)20 min后，洗滌后利用FACScan流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.6 細(xì)胞周期取 制備細(xì)胞懸液，用5 mL PBS反復(fù)洗滌3次后，棄上清；加入PI 5 μL，避光反應(yīng)20 min后，洗滌后利用FACScan流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.7 裸鼠荷瘤 4周齡雌性BALB/c?nu裸鼠購(gòu)自南京大學(xué)模式動(dòng)物研究所，于本院SPF級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的USP22?NC組及USP22?siRNA組細(xì)胞消化后，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×107個(gè)/mL。接種200 μL細(xì)胞懸液至5～6周齡雌性BALB/c?nu裸鼠腋下。接種后第3天給予各組PBS或順鉑（5 mg/kg）處理，給藥頻率1周2次，共給藥4次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以±s表示，利用方差分析和t檢驗(yàn)分析組間USP22的表達(dá)差異，利用t檢驗(yàn)分析各組增殖、凋亡、周期、細(xì)胞存活、體內(nèi)成瘤體積的差異，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 USP22 mRNA在宮頸癌細(xì)胞及人永生化表皮細(xì)胞中的表達(dá)差異 人永生化表皮細(xì)胞系HaCaT的USP22相對(duì)表達(dá)量為1.000±0.054，宮頸癌細(xì)胞HeLa中USP22的相對(duì)表達(dá)量為3.216±0.251，宮頸癌SiHa細(xì)胞中USP22的相對(duì)表達(dá)量為4.724±0.133。方差分析顯示3組間USP22差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=9.135，P＜0.05），t檢驗(yàn)分析顯示HeLa細(xì)胞與HaCaT細(xì)胞（t=4.123，P=0.035）及SiHa細(xì)胞與HaCaT細(xì)胞（t=6.541，P=0.013）中 USP22 mRNA表達(dá)水平差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，宮頸癌細(xì)胞中USP22 mRNA的表達(dá)水平較人永生化表皮細(xì)胞明顯增高。qRT?PCR結(jié)果顯示，USP22?siRNA可穩(wěn)定沉默宮頸癌細(xì)胞系中USP22的表達(dá)水平（HeLa：t=4.182，P=0.024；SiHa：t=4.573，P=0.021）。見圖1。

圖1 宮頸癌細(xì)胞中USP22的表達(dá)Fig.1 Relative expression of USP22 in cervical cancer cells

2.2 USP22對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖的影響 轉(zhuǎn)染USP22?siRNA的HeLa細(xì)胞增殖能力較轉(zhuǎn)染USP22?NC組增殖能力顯著降低（t=4.143，P=0.037）；轉(zhuǎn)染USP22?siRNA的SiHa細(xì)胞增殖能力較轉(zhuǎn)染USP22?NC組增殖能力亦顯著降低（t=7.163，P=0.014）。見圖2。

圖2 USP22對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖的影響Fig.2 Effects of USP22 on the proliferation of cervical cancer cells

2.3 USP22對(duì)宮頸癌細(xì)胞順鉑化療敏感性的影響 給予順鉑處理后，轉(zhuǎn)染USP22?siRNA的宮頸癌細(xì)胞相對(duì)存活率顯著低于轉(zhuǎn)染USP22?NC組（HeLa：t=4.142，P=0.032；SiHa：t=5.143，P=0.026）。見圖3。

2.4 USP22對(duì)宮頸癌細(xì)胞凋亡的影響 轉(zhuǎn)染USP22?siRNAs的宮頸癌細(xì)胞凋亡細(xì)胞（第2象限+第4象限）比例顯著高于轉(zhuǎn)染USP22?NC組（HeLa：t=6.145，P=0.012；SiHa：t=3.148，P=0.038）。見圖4。

圖3 USP22對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖的影響Fig.3 Effects of USP22 on the chemosensitivity of cervical cancer cells to cisplatin

圖4 USP22對(duì)宮頸癌細(xì)胞凋亡的影響Fig.4 Effects of USP22 on the apoptosis of cervical cells

2.5 USP22對(duì)宮頸癌細(xì)胞周期的影響 轉(zhuǎn)染USP22?siRNAs的宮頸癌細(xì)胞G1期細(xì)胞比例顯著高于轉(zhuǎn)染USP22?NC組（HeLa：t=5.332，P=0.021；SiHa：t=4.533，P=0.027），而S期細(xì)胞比例則顯著低于轉(zhuǎn)染USP22?NC組（HeLa：t=3.115，P=0.032；SiHa：t=3.275，P=0.043），兩組G2期細(xì)胞比例無(wú)顯著差異。見圖5。

圖5 USP22對(duì)宮頸癌細(xì)胞周期的影響Fig.5 Effects of USP22 on the cell cycle of cervical cancer cells

2.6 體內(nèi)試驗(yàn)檢測(cè)USP22對(duì)腫瘤生長(zhǎng)及順鉑化療敏感性的影響 轉(zhuǎn)染USP22?NC組的HeLa細(xì)胞腫瘤體積增長(zhǎng)速度明顯快于轉(zhuǎn)染USP22?siRNA組（t=3.242，P=0.033）。更為重要的是，與USP22?NC組相比，轉(zhuǎn)染USP22?siRNA的HeLa細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性顯著升高（t=2.871，P=0.027）。見圖6。

圖6 USP22對(duì)裸鼠體內(nèi)腫瘤生長(zhǎng)及順鉑化療敏感性的影響Fig.6 Effects of USP22 on tumor growth and chemosensitivity of HeLa cells to cisplatin in vivo

3 討論

USP22在心臟和骨骼肌等中有一定程度表達(dá)，而在肝臟和肺臟等組織表達(dá)量極低［7］。近年來(lái)，USP22已被證實(shí)在包括肝細(xì)胞癌［8］、肺癌［5］、乳腺癌［9］和結(jié)腸癌［4］等腫瘤組織中異常高表達(dá)，并與腫瘤的不良預(yù)后密切相關(guān)。值得注意的是，USP22在宮頸癌組織中表達(dá)水平顯著高于正常宮頸組織，并與FIGO分期、Ki67指數(shù)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況及組織分級(jí)呈正相關(guān)，可作為判斷宮頸癌總體生存期和無(wú)進(jìn)展生存期的獨(dú)立預(yù)后指標(biāo)［6］。本研究進(jìn)一步探索了USP22促進(jìn)宮頸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，結(jié)果顯示，沉默宮頸癌細(xì)胞中USP22的表達(dá)后，宮頸癌細(xì)胞的增殖受到顯著抑制，凋亡細(xì)胞比例顯著增加，細(xì)胞周期被阻滯于G1期。

作為hSAGA的亞基，USP22參與組蛋白H2A和H2B的去泛素化，以及組蛋白H4的乙?；瑥亩{(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)［10］。H2AX是組蛋白H2A的亞型，在DNA雙鏈斷裂修復(fù)器，H2AX 139絲氨酸位點(diǎn)將磷酸化［11］。因此，HA2X磷酸化是DNA雙鏈斷裂的敏感標(biāo)記物，并與包括順鉑在內(nèi)的多種化療藥物抵抗密切相關(guān)。USP22可去泛素化Sirt1和果糖二磷酸酶（fructose bisphosphatase 1，F(xiàn)BP1）［12-13］。而 Sir1 可去乙?；?p53 和 Ku70在內(nèi)的多種蛋白，并參與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、DNA修復(fù)及藥物抵抗［14］。更為重要的是，順鉑發(fā)揮作用的分子機(jī)制為其與DNA和非DNA靶點(diǎn)結(jié)合，形成交聯(lián)及單加合物，從而阻斷DNA復(fù)制和細(xì)胞凋亡。本研究前期結(jié)果證實(shí)USP22在宮頸癌增殖及凋亡的調(diào)控過程中發(fā)揮著重要的作用。筆者推測(cè)USP22可能通過去泛素化及穩(wěn)定Sirt1的表達(dá)而參與腫瘤細(xì)胞的化療藥物抵抗。正如筆者預(yù)期沉默宮頸癌細(xì)胞中USP22的表達(dá)后，USP22對(duì)順鉑的化療敏感性顯著增高。荷瘤裸鼠模型試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)，USP22?siRNA組細(xì)胞在接受順鉑治療后，腫瘤體積增長(zhǎng)速度顯著低于USP22?NC組。研究結(jié)果進(jìn)一步明確了USP22與腫瘤發(fā)生發(fā)展及藥物抵抗之間的關(guān)系，但仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)明確USP22是否通過去泛素化Sirt1而參與順鉑耐藥的調(diào)控。

綜上所述，本研究證實(shí)了USP22對(duì)宮頸癌增殖、凋亡、周期及順鉑化療敏感性的影響。結(jié)果提示，USP22可促進(jìn)宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖，抑制其凋亡及順鉑化療敏感性，是潛在的治療靶點(diǎn)。

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