，,2

研究表明，分枝桿菌起源于1.5億年以前[1]。結(jié)核病(Tuberculosis，TB)是由結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex，MTBC)感染引起的一種慢性人獸共患傳染病，MTBC主要包括結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis)、非洲分枝桿菌(Mycobacterium.africanum) 、卡氏分枝桿菌(Mycobacterium.canetti) 、牛分枝桿菌(Mycobacterium.bovis)、田鼠型結(jié)核桿菌(Mycobacterium.microti)和卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin , BCG)[2]。早在1882年，德國細(xì)菌學(xué)家柯赫(Robert Koch)就已證明結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)是結(jié)核病的病原菌[1]。Cole等[3]于1998年完成了對(duì)結(jié)核分枝桿菌 H37Rv全基因組測(cè)序，H37Rv基因組包含4 411 529個(gè)堿基對(duì)，約含4 000個(gè)基因，并且具有非常高的鳥嘌呤和胞嘧啶含量,與其他細(xì)菌的基因組相比，結(jié)核分枝桿菌基因組上存在很大一部分基因編碼參與脂肪生成和脂肪分解的酶、以及兩個(gè)富含甘氨酸的蛋白質(zhì)家族，具有免疫學(xué)意義，可能是潛在的多態(tài)性抗原。隨著比較基因組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，通過全基因組比對(duì)研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群中不同種細(xì)菌(如結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌或卡介苗)的基因組中存在一些缺失片段，這些缺失片段被稱為差異區(qū)域(Region of Differences，RD)，通稱為RD區(qū)。研究顯示，RD區(qū)基因與結(jié)核分枝桿菌的毒力密切相關(guān)，且這些基因的功能在結(jié)核病新型疫苗研發(fā)及新型診斷方法建立中具有重要的潛在意義及應(yīng)用價(jià)值[4]。本文主要綜述結(jié)核分枝桿菌基因組RD區(qū)及其編碼蛋白的研究進(jìn)展。

1 RD區(qū)概述

通過人造細(xì)菌染色體(Bacterial Artificial Chromosome，BAC)數(shù)據(jù)庫和比較基因組學(xué)等方法，發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群基因組中共有16 個(gè)RD區(qū)，即RD1-RD16，含有129個(gè)開放閱讀框,如表1所示。在不同的BCG 亞株和非結(jié)核分枝桿菌中缺失的片段又有所不同[5-6]。

表1 結(jié)核分枝桿菌差異區(qū)分布[7]

Tab.1 Distribution of regions of differences (RD) in M.tuberculosis

RDSizeofORF(kb)ORF(number)ORF(range)GeneSegment(s)ORF(bprange)19.59Rv3871-Rv3879c1607534-1698925.611Rv1978-Rv198888-8914211-859839.314Rv1573-Rv1586c707677-1692341.93Rv0221-Rv0223c1217432-1933552.85Rv3117-Rv312113527437-30212612.811Rv1506c-Rv1516c6523614-364377～9.08Rv2346c-Rv2353c10317622-2658483.44Rv0309-Rv03121617018-20446918.37Rv3617-Rv3623153-15421131-28321033Rv1255c-Rv1257c553689-66961128.85Rv3425-Rv3429145-14630303-14751224Rv2072c-Rv2075c939301-1133113～11.016Rv2645-Rv2660c11812475-2345514～9.18Rv1766-Rv1773c7930573-396421512.715Rv1963c-Rv1977881153-13873167.66Rv3400-Rv3405c1455012-12621

注：本文中的RD區(qū)命名依據(jù)實(shí)驗(yàn)室目前正在進(jìn)行的RD區(qū)基因多態(tài)性分析的參考文獻(xiàn)進(jìn)行統(tǒng)一的校正，包括參考文獻(xiàn)的替換。

通過檢索 http://tuberculist.epfl.ch RD區(qū)基因功能如表2所示，所編碼的蛋白主要功能包括：相關(guān)蛋白生命活動(dòng)過程所需的酶、潛在的診斷抗原和疫苗候選成分等。研究顯示RD區(qū)可能參與MTB的潛伏感染，并維持MTB的免疫自穩(wěn)[8]。BCG是目前唯一批準(zhǔn)使用的結(jié)核疫苗，但由于保護(hù)效力存在較大爭(zhēng)議，尤其是對(duì)成人結(jié)核病的預(yù)防保護(hù)效果不明顯，故新型結(jié)合疫苗的研發(fā)已經(jīng)迫在眉睫。以往的研究已經(jīng)證明，RD區(qū)的某些基因以重組BCG或DNA疫苗的形式在一定程度上可加強(qiáng)現(xiàn)行BCG的保護(hù)效率[9-10]。

表2 結(jié)核分枝桿菌差異區(qū)基因功能

Tab.2 M.tuberculosis RD region gene function

RD區(qū)基因編號(hào)基因名稱編碼蛋白R(shí)D區(qū)基因編號(hào)基因名稱編碼蛋白R(shí)D1Rv3871eccCb1ESX-1分泌系統(tǒng)相關(guān)蛋白eccCb1RD9Rv3617ephA環(huán)氧化物水解酶EphARv3872PE35PE家族相關(guān)蛋白PE35Rv3618Rv3618單加氧酶Rv3873PPE68PE家族相關(guān)蛋白PPE68Rv3619cesxVEsxV(ESAT-6)Rv3874esxBEsxB(CFP10)Rv3620cesxWEsxW(ESAT-6)Rv3875esxAEsxA(ESAT-6)Rv3621cPPE65PPE65Rv3876espIESX-1分泌相關(guān)蛋白EspIRv3622cPE32PE32Rv3877eccD1跨膜蛋白R(shí)v3623lpqG脂蛋白LpqGRv3878espJESX-1分泌相關(guān)蛋白EspJRD10Rv1255cRv1255c轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白R(shí)v3879cespKESX-1分泌相關(guān)蛋白EspKRD2Rv1978Rv1978假定蛋白R(shí)v1256ccyp130細(xì)胞色素P450Cyp130Rv1979cRv1979c透性酶Rv1257cRv1257c氧化還原酶Rv1980cmpt64抗原Mpt64RD11Rv3425PPE57PPE57Rv1981cnrdF1還原酶NrdF1Rv3426PPE58PPE58Rv1982cvapC36毒素VapC36Rv3427cRv3427c轉(zhuǎn)座酶Rv1983PE_PGRS35PE-PGRS家族蛋白PE_PGRS35Rv3428cRv3428c轉(zhuǎn)座酶Rv1984ccfp21CFP21Rv3429PPE59PPE59Rv1985cRv1985cLysR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白R(shí)D12Rv2072ccobL甲基轉(zhuǎn)移酶cobLRv1986Rv1986轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白R(shí)v2073cRv2073c脫氫酶Rv1987Rv1987幾丁質(zhì)酶Rv2074Rv2074磷酸氧化酶Rv1988erm(37)23SrRNA甲基轉(zhuǎn)移酶Erm(37)Rv2075cRv2075c假定蛋白R(shí)D3Rv1573Rv1573噬菌體蛋白R(shí)D13Rv2645Rv2645假定蛋白R(shí)v1574Rv1574噬菌體蛋白R(shí)v2646Rv2646整合酶Rv1575Rv1575噬菌體蛋白R(shí)v2647Rv2647假定蛋白R(shí)v1576cRv1576c噬菌體蛋白R(shí)v2648Rv2648轉(zhuǎn)座酶IS6110(片段)Rv1577cRv1577c噬菌體蛋白R(shí)v2649Rv2649轉(zhuǎn)座酶IS6110Rv1578cRv1578c噬菌體蛋白R(shí)v2650cRv2650c噬菌體蛋白R(shí)v1579cRv1579c噬菌體蛋白R(shí)v2651cRv2651c噬菌體蛋白酶Rv1580cRv1580c噬菌體蛋白R(shí)v2652cRv2652c噬菌體蛋白R(shí)v1581cRv1581c噬菌體蛋白R(shí)v2653cRv2653c噬菌體蛋白R(shí)v1582cRv1582c噬菌體蛋白R(shí)v2654cRv2654c噬菌體蛋白R(shí)v1583cRv1583c噬菌體蛋白R(shí)v2655cRv2655c噬菌體蛋白R(shí)v1584cRv1584c噬菌體蛋白R(shí)v2656cRv2656c噬菌體蛋白R(shí)v1585cRv1585c噬菌體蛋白R(shí)v2657cRv2657c噬菌體蛋白R(shí)v1586cRv1586c噬菌體整合酶Rv2658cRv2658c噬菌體蛋白R(shí)D4Rv0221Rv0221甘油三酯酶Rv2659cRv2659c噬菌體整合酶Rv0222echA1烯?；饷窫chA1Rv2660cRv2660c假定蛋白R(shí)v0223cRv0223c乙醛脫氫酶RD14Rv1766Rv1766假定蛋白表2(續(xù))RD區(qū)基因編號(hào)基因名稱編碼蛋白R(shí)D區(qū)基因編號(hào)基因名稱編碼蛋白R(shí)D5Rv3117cysA3硫代硫酸鹽硫轉(zhuǎn)移酶Cy-sA3Rv1767Rv1767假定蛋白R(shí)v3118sseC1假定蛋白R(shí)v1768PE_PGRS31PE-PGRS家族蛋白PE_PGRS31Rv3119moaE1MoaE1Rv1769Rv1769假定蛋白R(shí)v3120Rv3120假定蛋白R(shí)v1770Rv1770假定蛋白R(shí)v3121cyp141細(xì)胞色素P450Cyp141Rv1771Rv1771脫氫酶RD6Rv1506cRv1506c假定蛋白R(shí)v1772Rv1772假定蛋白R(shí)v1507cRv1507c假定蛋白R(shí)v1773cRv1773c轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白R(shí)v1508cRv1508c膜蛋白R(shí)D15Rv1963cmce3R轉(zhuǎn)錄抑制因子Mce3RRv1509Rv1509假定蛋白R(shí)v1964yrbE3A膜蛋白yrbE3ARv1510Rv1510膜蛋白R(shí)v1965yrbE3B膜蛋白yrbE3BRv1511gmdAGDP-D-甘露糖脫水酶Gm-dARv1966mce3AMce3ARv1512epiA核苷酸異構(gòu)酶EpiARv1967mce3BMce3BRv1513Rv1513假定蛋白R(shí)v1968mce3CMce3CRv1514cRv1514c假定蛋白R(shí)v1969mce3DMce3DRv1515cRv1515c假定蛋白R(shí)v1970lprMmce3E家族脂蛋白(lprM)Rv1516cRv1516c糖基轉(zhuǎn)移酶Rv1971mce3FMce3FRD7Rv2346cesxOEsxO(ESAT-6)Rv1972Rv1972MCE相關(guān)膜蛋白R(shí)v2347cesxPEsxP(ESAT-6)Rv1973Rv1973MCE相關(guān)膜蛋白R(shí)v2348cRv2348c假定蛋白R(shí)v1974Rv1974膜蛋白R(shí)v2349cplcC磷酸酯酶plcCRv1975Rv1975假定蛋白R(shí)v2350cplcB膜磷酸酯酶plcBRv1976cRv1976c假定蛋白R(shí)v2351cplcA膜磷酸酯酶plcARv1977Rv1977假定蛋白R(shí)v2352cPPE38PPE38RD16Rv3400Rv3400水解酶Rv2353cPPE39PPE39Rv3401Rv3401假定蛋白R(shí)D8Rv0309Rv0309假定蛋白R(shí)v3402cRv3402c假定蛋白R(shí)v0310cRv0310c假定蛋白R(shí)v3403cRv3403c假定蛋白R(shí)v0311Rv0311假定蛋白R(shí)v3404cRv3404c假定蛋白R(shí)v0312Rv0312假定蛋白R(shí)v3405cRv3405c轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白

2 RD區(qū)研究進(jìn)展

2.1RD1區(qū) RD1區(qū)全長(zhǎng)9.5 kb，包含9個(gè)閱讀框，即Rv3871～Rv3879c，在結(jié)核分枝桿菌H37Rv和牛分枝桿菌基因組中存在，在全部BCG菌株中缺失。RD1區(qū)所編碼的蛋白是結(jié)核分枝桿菌的主要毒力因子之一，被認(rèn)為在結(jié)核分枝桿菌的致病過程中起著關(guān)鍵的作用[11]。Rv3871編碼的eccCb1蛋白是ESX-1分泌系統(tǒng)的重要組成部分，可與Rv3870編碼的蛋白結(jié)合共同形成分子轉(zhuǎn)運(yùn)通道；又能與ESAT-6/CFP-10二聚體結(jié)合參與其分泌轉(zhuǎn)位；也有研究揭示，Rv3871編碼的蛋白可能在ESAT-6/CFP-10蛋白的折疊、分泌過程中起到關(guān)鍵性作用?？ń槊缁蚪M中的這段序列的缺失可能與其保護(hù)力減弱有直接關(guān)系[12]。Rv3872編碼的PE35蛋白和Rv3873編碼的PPE68蛋白可能在結(jié)核病的發(fā)病過程中起重要作用、有助于結(jié)核分枝桿菌感染狀態(tài)的建立和維持，此外PE35和PPE68蛋白在結(jié)核病的感染發(fā)病過程中起著重要的免疫調(diào)節(jié)作用[13]。Rv3874和Rv3875分別編碼CFP-10和ESAT-6兩個(gè)低分子質(zhì)量的蛋白[14]。這兩個(gè)基因的表達(dá)受同一個(gè)啟動(dòng)子調(diào)控，其產(chǎn)物CFP-10和ESAT-6形成的緊密的1∶1的蛋白質(zhì)復(fù)合物發(fā)揮生物學(xué)功能；CFP-10的C-末端形成的氨基酸臂，對(duì)蛋白質(zhì)的分泌起重要作用；分泌型結(jié)核分枝桿菌復(fù)合蛋白CFP-10和ESAT-6可能在病原體-宿主細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，在結(jié)核病發(fā)病機(jī)制中起重要作用[11]。Ming Zhang[15]等使用遺傳學(xué)方法證實(shí)Rv3876編碼的EspI蛋白是結(jié)核分枝桿菌ESX-1分泌系統(tǒng)的組成部分之一，在細(xì)胞ATP水平消耗的條件下，EspI在負(fù)向調(diào)節(jié)ESX-1介導(dǎo)的分泌過程中起著重要作用。Rv3877編碼的跨膜蛋白eccD1是組成蛋白質(zhì)分泌通道的主要成分[16]。Rv3878編碼ESX-1分泌相關(guān)蛋白EspJ，且EspJ與蘇氨酸蛋白激酶(Serine Threonine Protein Kinase，STPK)介導(dǎo)的磷酸化聯(lián)合作用是促進(jìn)分枝桿菌生長(zhǎng)的主要機(jī)制之一[17]。Rv3879編碼的分泌蛋白EspK能夠和Rv3871編碼的蛋白eccCb1相互作用，促進(jìn)蛋白R(shí)v3881c/Mh3881c(EspB)的分泌[18]。

2.2RD2區(qū) RD2區(qū)全長(zhǎng)5.6 kb，包含11個(gè)閱讀框，即Rv1978～Rv1988c，在牛分枝桿菌基因組和部分BCG菌株中存在，在BCG-Danish、BCG-Prague、BCG-Glaxo、BCG-Connaught、BCG-Phipps、BCG-Tice和BCG-Pasteur菌株中缺失。RD2區(qū)在結(jié)核分枝桿菌毒力方面起到重要作用，某些基因編碼的蛋白與BCG的安全性和宿主的免疫應(yīng)答有關(guān)，如Rv1979c可能是一種氨基酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，并且該基因的缺失可能抑制巨噬細(xì)胞的生長(zhǎng)。Rv1980c編碼的MPT64和Rv1984c編碼的CFP21，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生強(qiáng)烈的免疫應(yīng)答[19]。RD2區(qū)在結(jié)核分枝桿菌中的缺失導(dǎo)致巨噬細(xì)胞和小鼠中的細(xì)菌生長(zhǎng)減少，并且巨噬細(xì)胞的感染，導(dǎo)致TNF-α水平增加和細(xì)胞凋亡，提示RD2區(qū)中編碼的MPT64蛋白在宿主細(xì)胞內(nèi)具有抗細(xì)胞凋亡作用[20]。Rv1982c可以編碼毒素-抗毒素家族蛋白(Toxin-Antitoxin，TA)VapC36，VapC36可以通過RNA酶活性抑制翻譯[21]。有研究選取Rv1981c編碼的NrdF1、Rv1983編碼的PE__PGRS35，Rv1985c和Rv1986等4種蛋白進(jìn)行原核融合表達(dá)與純化，分別以 NrdF1、PE＿PGRS35、Rv1985c和Rv1986等4種融合蛋白純化產(chǎn)物作為抗原，用間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)對(duì)血清中的特異抗體進(jìn)行檢測(cè) ，結(jié)果顯示4種蛋白的陽性檢出率分別為7.35%、22.06%、16.18%和16.18%，具有用作牛結(jié)核病血清學(xué)診斷試劑的潛能[22]。Rv1987蛋白是RD2區(qū)基因編碼的一種具有免疫效力的分泌蛋白，有研究表明， Rv1987蛋白可以調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)向Th2型細(xì)胞應(yīng)答轉(zhuǎn)化，這可能有助于細(xì)菌逃逸宿主免疫識(shí)別[23]。Rv1988編碼的蛋白作為重要的分枝桿菌毒力因子，可以作為治療分枝桿菌感染的潛在靶標(biāo)[24]。Rv1978編碼的蛋白為假定蛋白。(如表2所示)。

2.3RD3區(qū) RD3區(qū)全長(zhǎng)9.3 kb，包含14個(gè)閱讀框，即Rv1573～Rv1586c，在牛分枝桿菌基因組中存在，在全部BCG菌株中缺失。研究表明，噬菌體衣殼蛋白R(shí)v1576c、Rv1578c和噬菌體整合酶Rv1586c可能與結(jié)核分枝桿菌適應(yīng)環(huán)境及發(fā)病機(jī)制有關(guān)[25]。Rv1580c可能是鑒定血清樣品中牛分枝桿菌感染的理想選擇[26]。Rv1573-Rv1585c編碼的蛋白為噬菌體蛋白。(如表2所示)。

2.4RD4區(qū) RD4區(qū),全長(zhǎng)1.9 kb，包含3個(gè)閱讀框，即Rv0221、Rv0222和Rv0223c，在結(jié)核分枝桿菌H37Rv和非洲分枝桿菌基因組中存在，在BCG和牛分枝桿菌基因組中缺失。Rosenkrands[27]等對(duì)結(jié)核分枝桿菌差異區(qū)RD2-7、RD9-13 和RD15的47個(gè)基因進(jìn)行基因克隆表達(dá)，并純化重組蛋白，采用血清學(xué)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)Rv0222編碼的蛋白EchA1具有很高的血清學(xué)診斷價(jià)值，并且在人類免疫缺陷(Human Immunodeficiency Virus，HIV)感染患者中呈現(xiàn)較高的靈敏度，其識(shí)別HIV陽性結(jié)核患者的靈敏度為43%，識(shí)別HIV陰性肺結(jié)核患者的靈敏度為30%。張慧漲[28]等在Rv0222/ESAT-6融合蛋白的結(jié)核病血清學(xué)診斷價(jià)值的研究中發(fā)現(xiàn)，以Rv0222/ESAT-6融合蛋白為抗原的ELISA方法診斷結(jié)核病的敏感性為86%，特異性為100%，證明了Rv0222/ESAT-6融合蛋白作為抗原的ELISA方法對(duì)結(jié)核病(包括合并HIV感染者)的血清學(xué)診斷具有較高的應(yīng)用價(jià)值。王慶等在結(jié)核分枝桿菌重組蛋白R(shí)v0222的表達(dá)及血清學(xué)鑒定實(shí)驗(yàn)中也證明了Rv0222的診斷潛能[29]。Rv0221和Rv0223c編碼的蛋白分別為甘油三脂酶和乙醛脫氫酶(如表2所示)。

2.5RD5區(qū) RD5區(qū)全長(zhǎng)2.8 kb，包含5個(gè)閱讀框，即Rv3117、Rv3118、Rv3119、Rv3120和Rv3121，在結(jié)核分枝桿菌H37Rv和非洲分枝桿菌基因組中存在，在BCG和牛分枝桿菌基因組中缺失。RD5區(qū)的完整性可能與生物毒力作用增加有關(guān)[30]。通過對(duì)60名HIV感染合并結(jié)核病患者、32名健康對(duì)照者的血清，用酶聯(lián)免疫法進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Rv3117和Rv3120之間顯示其敏感性差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；和采用ESAT-6作為抗原(敏感性21.7%，特異性90.6%)相比，Rv3117(敏感性25%，特異性96.9%)和Rv3120(敏感性31.7%，特異性96.9%)的敏感性和特異性均有所提高；這表明Rv3117和Rv3120在結(jié)核病血清學(xué)診斷方面具有較高的敏感性，可用于診斷結(jié)核分枝桿菌感染[31]。Rv3121編碼細(xì)胞色素蛋白Cyp141，可能參與調(diào)節(jié)宿主的免疫反應(yīng)，可以作為新型疫苗的候選成分、在結(jié)核病的診斷方面具有潛在的價(jià)值[32]。Rv3118編碼的蛋白為假定蛋白，Rv3119編碼的蛋白為MoaE1(如表2所示)。

2.6RD6區(qū) RD6區(qū)全長(zhǎng)12.8 kb，包含11個(gè)閱讀框，即Rvl506c-Rvl516c，其中包含編碼3個(gè)糖代謝途徑中的相關(guān)蛋白，如GDP-D-甘露糖脫水酶GmdA (Rv1511)、核苷酸異構(gòu)酶EpiA(Rv1512)和糖基轉(zhuǎn)移酶Rv1516c(Rv1516c)；以及2個(gè)膜蛋白，如Rv1508c和Rv1510。在結(jié)核分枝桿菌H37Rv和非洲分枝桿菌基因組中存在，在牛分枝桿菌和BCG基因組中缺失。通過對(duì)重組蛋白R(shí)v1515c在分枝桿菌和宿主相互作用中的功能研究發(fā)現(xiàn)，Rv1515c能夠通過影響脂肪酸的合成而引起一系列菌落表型變化，包括滑動(dòng)能力、單菌落形態(tài)和生物膜的形成，從而增強(qiáng)恥垢分枝桿菌在體外的存活能力，并能使鼠源巨噬細(xì)胞RAW264.7和人源巨噬細(xì)胞THP-1中細(xì)胞因子IL-6和IL-10 mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)，這表明Rv1515c蛋白是與結(jié)核分枝桿菌致病性相關(guān)的一種調(diào)控蛋白，可作為一種新型的抗結(jié)核藥物靶點(diǎn)[33]。也有研究發(fā)現(xiàn)，Rv1516c蛋白在結(jié)核分枝桿菌的全細(xì)胞裂解物中表達(dá)，鑒定的血清反應(yīng)性肽可能在結(jié)核病的特異性血清診斷中有重要作用[34]。Rv1506c、Rv1507c、Rv1509、Rv1513和Rv1514c編碼的蛋白為假定蛋白(如表2所示)。

2.7RD7區(qū) RD7區(qū)全長(zhǎng)9.0 kb，包含8個(gè)閱讀框，即Rv2346c-Rv2353c，在結(jié)核分枝桿菌H37Rv和非洲分枝桿菌基因組中存在，在牛分枝桿菌和BCG基因組中缺失。曹嚴(yán)明[35]等對(duì)Rv2352c蛋白進(jìn)行基因克隆表達(dá)、純化后，免疫新西蘭兔，發(fā)現(xiàn)能夠刺激產(chǎn)生高滴度的抗體反應(yīng)；之后對(duì)Rv2352c重組蛋白進(jìn)行免疫印跡分析，結(jié)果顯示該重組蛋白能與結(jié)核病人的血清發(fā)生良好免疫反應(yīng)；證明Rv2352c蛋白具有很好的免疫原性和抗原性。張紅梅[36]檢測(cè)了3個(gè)PPE重組蛋白R(shí)v3425、Rv3429和Rv2353c和兩個(gè)對(duì)照抗原CFP-10和ESAT-6，在識(shí)別結(jié)核病人和健康對(duì)照者血清中IgG抗體的反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)以Rv2353c為抗原，檢測(cè)出肺結(jié)核病人血清中特異IgG敏感性可達(dá)16.0%，而檢測(cè)肺外結(jié)核病人血清中特異IgG敏感性為12.5%；與接種過BCG疫苗的健康對(duì)照者相比較，Rv2353c抗原在檢測(cè)結(jié)核病人中的特異性為96.4%，雖然特異性比較高，可是在檢測(cè)結(jié)核病人的敏感性方面較低，用于診斷的實(shí)際價(jià)值不大。Rv2346c基因編碼的蛋白能夠誘導(dǎo)結(jié)核桿菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激來提高結(jié)核菌的生存能力[37]。Rv2347c基因編碼的蛋白可能與結(jié)核分枝桿菌毒力有關(guān)[38]。Rv2348c編碼的蛋白為假定蛋白，Rv2349c、2350c和Rv2351c編碼的蛋白分別為磷酸酯酶C(PlcC)、膜磷酸酯酶B(PlcB)和膜磷酸酯酶A(PlcA)(如表2所示)。

2.8RD8區(qū) RD8區(qū)全長(zhǎng)3.4 kb，包含4個(gè)閱讀框，即Rv0309-Rv0312，在非洲分枝桿菌和BCG基因組中存在，在牛分枝桿菌基因組中缺失。蔣天舒等[39]構(gòu)建了高效表達(dá)的Rv0309重組質(zhì)粒，獲得高純度的Rv0309重組蛋白，研究表明Rv0309具有誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答作用，為進(jìn)一步利用該抗原制備結(jié)核新疫苗進(jìn)行結(jié)核病的防治研究提供了一定的基礎(chǔ)。Rv0310c、Rv0311和Rv0312編碼的蛋白為假定蛋白(如表2所示)。

2.9RD9區(qū) RD9區(qū)全長(zhǎng)18.3 kb，包含7個(gè)閱讀框，即Rv3617-Rv3623，在結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組中存在，在非洲分枝桿菌、牛分枝桿菌和BCG基因組中缺失。有研究用重組Rv3618蛋白作為抗原，采用ELISA檢測(cè)7l例肺結(jié)核患者血清中特異性Rv3618蛋白和38 kD蛋白的IgG抗體，發(fā)現(xiàn)Rv3618與38 kD蛋白聯(lián)合可用于肺結(jié)核病患者的血清學(xué)檢測(cè)，且呈現(xiàn)較高的敏感性， Rv3618蛋白可作為結(jié)核病血清學(xué)診斷的抗原之一[40]。也有研究揭示IS6110和Rv3618基因可以作為檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的分子靶標(biāo)；使用PCR-ICT(免疫色譜測(cè)試)測(cè)定法，同時(shí)檢測(cè)1 500個(gè)臨床痰標(biāo)本中的MTBC和MTB。將結(jié)果與傳統(tǒng)培養(yǎng)和生化鑒定結(jié)果進(jìn)行比較，并與患者的臨床結(jié)果進(jìn)行比較，整體敏感性為93.0%，特異性為99.8%，其中檢測(cè)MTBC的靈敏度為95.5%、特異性為97.9%，檢測(cè)MTB的靈敏度為93.0%、特異性為99.8%，證明Rv3618在結(jié)核病的診斷上具有較好的潛在應(yīng)用價(jià)值[41]。Rv3620c也是結(jié)核分枝桿菌的重要免疫顯性抗原。以Ag85B-ESAT6-Rv3620c融合基因重組卡介苗構(gòu)建了一種新型重組卡介苗(recombinant BCG，rBCG)，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示與BCG相比，這種rBCG可以顯著增加Th1型細(xì)胞免疫應(yīng)答和特異性體液應(yīng)答，這將對(duì)新型卡介苗的研發(fā)有重要指導(dǎo)性意義[42]。曹廷明[43]等成功構(gòu)建原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET30a(+)-Rv3623，證實(shí)Rv3623蛋白具有較好的免疫原性并制備了其多克隆抗體，為進(jìn)一步研究其作為診斷結(jié)核病的潛在分子標(biāo)志物的可行性奠定了基礎(chǔ)。Rv3617編碼的蛋白為環(huán)氧化物水解酶EphA，Rv3619c編碼的蛋白為EsxV(ESAT-6)，Rv3621c的預(yù)測(cè)功能為PPE65，Rv3622c編碼蛋白PE32(如表2所示)。

2.10RD10區(qū) RD10區(qū)全長(zhǎng)3.0 kb，包含3個(gè)閱讀框，即Rv1255c-Rv1257c，在結(jié)核分枝桿菌H37Rv和非洲分枝桿菌基因組中存在，在牛分枝桿菌和BCG基因組中缺失。RD10區(qū)促進(jìn)對(duì)結(jié)核分枝桿菌的保護(hù)作用，而與毒力作用無關(guān)，因此，可用于新疫苗研發(fā)[44]。Rv1255c的編碼蛋白為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，Rv1256c編碼的蛋白為細(xì)胞色素 P450 Cyp130，Rv1257編碼的蛋白為氧化還原酶(如表2所示)。

2.11RD11區(qū) RD11區(qū)全長(zhǎng)28.8 kb，包含5個(gè)閱讀框，即Rv3425-Rv3429，在結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組中存在，在BCG基因組中缺失。吳興福[45]等用H37Rv免疫的兔血清進(jìn)行間接酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)測(cè)定融合蛋白CFPl0-ESAT6-Rv3425的免疫原性，結(jié)果顯示該蛋白具有較強(qiáng)的免疫原性，可作為結(jié)核病免疫診斷的一個(gè)候選抗原。研究表明Rv3425蛋白在結(jié)核病診斷方面具有很高的應(yīng)用價(jià)值[46]。Rv3426的預(yù)測(cè)功能為編碼蛋白PPE58，Rv3427c和Rv3428c編碼的蛋白為轉(zhuǎn)座酶，Rv3429編碼蛋白PPE59(如表2所示)。

2.12RD12區(qū) 全長(zhǎng)2.0 kb，包含4個(gè)閱讀框，即Rv2072c、Rv2073c、Rv2074和Rv2075c，在結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組中存在，在BCG基因組中缺失。葉娟[47]成功誘導(dǎo)表達(dá)純化了RD12區(qū)抗原Rv2074，血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示蛋白R(shí)v2074具有較高的敏感性和特異性，但未進(jìn)行細(xì)胞免疫學(xué)活性的驗(yàn)證。Tan[48]在研究Rv2073c和Rv2074兩種蛋白時(shí)發(fā)現(xiàn)，與健康對(duì)照組相比，蛋白R(shí)v2073c只在結(jié)核組誘導(dǎo)分泌高水平的IFN-γ，且呈正相關(guān)關(guān)系，這表明Rv2073c可能是結(jié)核分枝桿菌特異性診斷試劑和疫苗的備選成分之一。Rv2072c和Rv2075c編碼的蛋白分別為甲基轉(zhuǎn)移酶cobL和假定蛋白(如表2所示)。

2.13RD13區(qū) RD13區(qū)全長(zhǎng)11.0 kb，包含16個(gè)閱讀框，即Rv2645-Rv2660c，在結(jié)核分枝桿菌H37Rv和牛分枝桿菌基因組中存在，在BCG基因組中缺失。研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核病人外周血中Rv2645特異性刺激產(chǎn)生IFN-γ水平比健康人更高；Rv2645能夠誘導(dǎo)接種熱滅活的結(jié)核桿菌H37Rv的小鼠發(fā)生結(jié)核分枝桿菌特異性皮膚試驗(yàn)反應(yīng)，有可能作為一種新型細(xì)胞介導(dǎo)的結(jié)核免疫診斷劑[49]。有研究對(duì) ESAT-6、CFP10、Rv2031c、Rv2654c和Rv1038c免疫原機(jī)制進(jìn)行對(duì)比時(shí)發(fā)現(xiàn)，CFP10占最主導(dǎo)地位，Rv2654c幾乎不表達(dá)[50]。楊丹等發(fā)現(xiàn)，Rv2657c蛋白既有B細(xì)胞表位也有T細(xì)胞表位，可能成為結(jié)核病診斷抗原分子和候選疫苗抗原[51]。有研究表明，純化的重組Rv2659c蛋白，在潛伏性結(jié)核感染患者中可引起T細(xì)胞應(yīng)答的選擇性免疫原性；因此，它具有潛在的診斷價(jià)值，可能是對(duì)潛伏性結(jié)核感染使用的疫苗候選之一[52]。Rv2646編碼的蛋白為整合酶，Rv2648編碼的蛋白為轉(zhuǎn)座酶IS6110(片段)，Rv2649編碼的蛋白為轉(zhuǎn)座酶IS6110，Rv2650c、Rv2652c、Rv2653c、Rv2655c、Rv2656c和Rv2658c編碼的蛋白為噬菌體蛋白，Rv2651c編碼的蛋白為噬菌體蛋白酶，Rv2647和Rv2660c編碼的蛋白都為假定蛋白(如表2所示)。

2.14RD14區(qū) RD14區(qū)全長(zhǎng)9.1 kb，包含8個(gè)閱讀框，即Rv1766-Rv1773c，在大部分BCG基因組中存在 ，在牛分枝桿菌基因組和BCG-Pasteur菌株中缺失。研究表明Rv1769和Rv1772都可作為T細(xì)胞抗原，誘發(fā)較強(qiáng)的T細(xì)胞免疫反應(yīng)，可以作為潛在的細(xì)胞免疫檢測(cè)抗原或亞單位疫苗成分[53]。Rv1771編碼一種脫氫酶，具有合成維生素C的能力[54]。Rv1766、Rv1767和Rv1770編碼的蛋白為假定蛋白，Rv1768編碼的蛋白為PE-PGRS家族蛋白PE_PGRS31，Rv1773c編碼的蛋白為轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白(如表2所示)。

2.15RD15區(qū) RD15區(qū)全長(zhǎng)12.7 kb，包含15個(gè)閱讀框，即Rv1963c-Rv1977，在結(jié)核分枝桿菌H37Rv基因組中存在，在牛分枝桿菌和BCG基因組中缺失。Rv1966-Rv1971分別編碼蛋白質(zhì)Mce3A、Mce3B、Mce3C、Mce3D、Mce3E和Mce3F，研究表明Mce3A-F蛋白在結(jié)核分枝桿菌體外生長(zhǎng)過程中及其mRNA中表達(dá)，可能與結(jié)核分枝桿菌的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[55]。Rv1973編碼的蛋白是結(jié)核分枝桿菌的外膜蛋白[56]。Jiang Y等發(fā)現(xiàn)Rv1977編碼的蛋白可能是一種特異性抗原，它可能參與宿主免疫逃避[57]。Rv1963c編碼的蛋白為轉(zhuǎn)錄抑制因子Mce3R，Rv1964、Rv1965、Rv1972和Rv1974編碼的蛋白為膜蛋白，Rv1975和Rv1976c編碼的蛋白為假定蛋白(如表2所示)。

2.16RD16區(qū) RDl6區(qū)全長(zhǎng)7.6 kb，包含6個(gè)閱讀框，即Rv3400、Rv3401、Rv3402c、Rv3403c、Rv3404c和Rv3405c，在大部分BCG基因組中存在，在牛分枝桿菌基因組、BCG-Moreau菌株和BCG-Russia菌株的基因組中缺失。Rv3400編碼一種水解酶，參與分枝菌酸合成[58]。朱琳等發(fā)現(xiàn)抗原Rv3400能夠誘導(dǎo)高水平IL-6和TNF-a的分泌，增加巨噬細(xì)胞表面分子CD80、CD86、CD40、MHCⅡ的表達(dá)，提高巨噬細(xì)胞吞噬能力；亞單位疫苗Rv3400-IFA在C57BL/6小鼠體內(nèi)可產(chǎn)生較好的細(xì)胞免疫和體液免疫效應(yīng)，Rv3400有望成為新型結(jié)核病疫苗及診斷標(biāo)志物的候選成分[59]。研究表明，NF-κB、ERKl/2和p38信號(hào)通路的激活是Rv3402c蛋白誘導(dǎo)產(chǎn)生TNF-α所必需的，而且NF-κB、ERKl/2信號(hào)通路是Rv3402c誘導(dǎo)的IL分泌所需的，Rv3402c也可以通過干擾宿主的信號(hào)途徑來擾亂宿主的免疫應(yīng)答，最終導(dǎo)致巨噬細(xì)胞的快速裂解以及細(xì)菌在胞內(nèi)的存活率提高[60-61]。Rv3401、Rv3403c和Rv3404c編碼的蛋白為假定蛋白，Rv3405c編碼的蛋白為轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白(如表2所示)。

3 展 望

結(jié)核分枝桿菌基因組變異具有多樣性，而宿主對(duì)結(jié)核分枝桿菌的免疫，首先是細(xì)胞免疫，其次是體液免疫，用單一抗原或單一方法只能檢出一部分的感染者，效果不令人滿意，而且，由于BCG的接種和非結(jié)核分枝桿菌感染的交叉免疫反應(yīng)，導(dǎo)致免疫學(xué)檢測(cè)診斷的特異性不理想，使得結(jié)核病免疫學(xué)診斷的臨床應(yīng)用價(jià)值大大減低。目前，BCG的預(yù)防效果差，特別是對(duì)成人結(jié)核病。因此，高度特異和靈敏的免疫學(xué)診斷技術(shù)和更有效的結(jié)核病新疫苗的研發(fā)成為亟待解決的科學(xué)難題，這主要依賴于特異抗原及其相關(guān)技術(shù)的突破。結(jié)核分枝桿菌16個(gè)RD區(qū)對(duì)于研究結(jié)核分枝桿菌的進(jìn)化歷程、毒力機(jī)制以及免疫學(xué)診斷具有重要的研究?jī)r(jià)值。結(jié)核分枝桿菌基因組RD區(qū)抗原，由于絕大多數(shù)在BCG和非結(jié)核分枝桿菌基因組中缺失，以其為基礎(chǔ)的血清學(xué)診斷和疫苗研制具有獨(dú)特的優(yōu)越性；然而，可能是不同的個(gè)體對(duì)不同抗原的免疫應(yīng)答不同，同一個(gè)體不同的感染(疾病)階段對(duì)同一抗原的免疫應(yīng)答不同、以及種族不同、結(jié)核病的發(fā)病環(huán)境和抗原來源不同、臨界值算法不同等等[62]，結(jié)核病免疫診斷的敏感性和特異性有很大的可變性，尤其是單一抗原效果極不理想。因此，RD區(qū)蛋白抗原聯(lián)合應(yīng)用能夠顯著提高檢測(cè)的敏感性和特異性，對(duì)結(jié)核病的診斷和預(yù)防具有十分重要的應(yīng)用價(jià)值。

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