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非結核分枝桿菌(non—tuberculous mycobacterum，NTM)是指結核分枝桿菌復合群和麻風分枝桿菌以外的其他分枝桿菌，目前已知的有150余種，為條件致病菌[1-2]。其中鳥-胞內分枝桿菌復合菌組(Mycobacterium avium—intracellulare complex，MAC)、龜分枝桿菌、馬賽分枝桿菌和偶發(fā)分枝桿菌等是主要常見致病菌[3]。NTM引起的疾病，可累及肺、淋巴結、皮膚、軟組織等器官組織，以肺部多見[2]。NTM病快速增長，已經(jīng)成為危害人類健康的公共衛(wèi)生問題[4]。非結核分枝桿菌病和結核病由于在臨床癥狀體征影像學資料、痰菌、病理活檢等方面都十分相似，在按照結核病規(guī)范療程治療后效果欠佳時，醫(yī)生往往考慮是否出現(xiàn)了廣泛耐藥結核或耐多藥結核從而可能延誤了病情。近些年來，隨著細菌分離技術的不斷提高和普及，免疫受損宿主感染菌群的變遷等原因，導致NTM感染和相關疾病的發(fā)生呈現(xiàn)上升趨勢。

NTM對抗結核藥物具有極高的耐藥性，其對異煙肼、對氨基水楊酸鈉、乙胺丁醇、利福平、鏈霉素等常用抗結核藥物存在不同程度的耐藥，耐藥率高達97.46%，且大多菌株同時對多種抗結核藥物耐藥。NTM對大多數(shù)抗結核藥物天然耐藥的生理基礎可能是NTM細胞表面的高疏水性及細胞壁的通透屏障[3,5-6]。本實驗采用《分枝桿菌、諾卡菌和其他需氧放線菌的藥物敏感性試驗》第二版推薦方法微孔板阿爾瑪藍測定法。該方法使用調過陽離子含5%OADC的MH肉湯(CAMHB)培養(yǎng)基，同時使用阿爾瑪藍指示劑，大大的提高了檢測的靈敏性，縮短了藥敏時間。采用該方法對從來源于臨床肺結核患者中分離的非結核分枝桿菌進行藥物敏感試驗，討論自貢市非結核分枝桿菌耐藥情況。

1 材料與方法

1.1材料 收集自貢市2012年至2015年培養(yǎng)陽性的臨床菌株，并且經(jīng)hsp65、rpoB、ITS基因測序鑒定為非結核分枝桿菌的20株菌株。其中包括6株膿腫分枝桿菌、6株堪薩斯分枝桿菌、5株胞內分枝桿菌和3株鳥分枝桿菌。實驗中使用到的26種抗生素均購自美國Sigma公司，阿爾瑪藍購自美國伯樂公司，OADC增菌液購自美國Bection Dickinson公司。標準菌株95021由中國疾病預防控制中心傳染病預防控制中心結核病參比實驗室提供。

1.2方法 藥敏試驗采用微孔板阿爾瑪藍測定法(microplate Alamarue assay，MABA)，檢測對每種抗生素的MIC值[7-9]。26種抗生素分別為：氧氟沙星、利福平、異煙肼、阿米卡星、卷曲霉素、莫西沙星、加替沙星、左氧氟沙星、環(huán)絲氨酸、對氨基水楊酸、乙胺丁醇、鏈霉素、妥布霉素、利福噴丁、利福布丁、環(huán)丙沙星、利奈唑胺、司帕沙星、力克肺疾、氯法齊明、頭西、美羅培南、克拉霉素、米諾環(huán)素、復方新諾明、磺胺甲惡唑?？股匕凑彰绹R床實驗室標準化研究(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)的標準溶解(見表1)，液體培養(yǎng)基為含5% OADC的用調過陽離子的MH肉湯(CAMHB)培養(yǎng)基[9]。

刮取羅氏培養(yǎng)基上處于生長對數(shù)期的菌株，與生理鹽水配成0.5個麥氏濃度，取50 μL加入到10 mL含5% OADC的 CAMHB中，以制備最終接種液(菌體濃度約為5×105CFU/mL)，顛倒混勻。96孔板第一行加入無菌鹽水作為對照，第二排加入無藥物的培養(yǎng)基作對照。藥物濃度以2倍稀釋方式由高至低遞減。取稀釋好的菌液100 μL加入到每孔培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)。試驗設立陰性對照和標準菌株對照。24 h后在第一孔無藥培養(yǎng)基中加入70 μL指示劑(20 μL阿爾瑪藍色和50 μL無菌5%吐溫- 80)，育24 h后如果培養(yǎng)基變?yōu)榧t色，則在所有含藥培養(yǎng)基中加入指示劑，24 h后觀察結果；如果未變成紅色，則繼續(xù)在第二空中加入指示劑，培養(yǎng)24 h觀察結果，如果沒有變成紅色則重復此步驟，如果變?yōu)榧t色則在所有含藥培養(yǎng)基中均加入指示劑，24 h后觀察結果。變色孔最低濃度與不變色孔最高濃度所對應的藥物濃度范圍為MIC值。將MIC值與藥物的判讀參考值(表1)進行比較，判斷該菌株對該種藥物是否耐藥[9-11]。

2 結 果

23株非結核分枝桿菌的藥敏結果均在1周內獲得MIC值，與藥物的判讀參考相比，獲得不同菌株對藥物的耐藥結果(表2)。其中23株非結核分枝桿菌對環(huán)絲氨酸、對氨基水楊酸、頭西、美羅培南、磺胺甲惡唑、異煙肼、卷曲霉素耐藥率為100%；對乙胺丁醇、力克肺疾、鏈霉素耐藥率為80%～95%；對氧氟沙星、利福平、耐藥率為70%；對利福噴丁、利福布丁、環(huán)丙沙星、利奈唑胺、司帕沙星、米諾環(huán)素、復方新諾明耐藥率為30%～55%；其余藥物低于25%。

比較藥敏結果發(fā)現(xiàn)不同種屬間對藥物的耐藥情況存在著種間差異。在26種藥物中，膿腫分枝桿菌對其中22種藥物耐藥、胞內分枝桿菌和鳥分枝桿菌對其中的14種藥物耐藥、堪薩斯分枝桿菌對其中10種藥物耐藥。主要差異為氧氟沙星、利福平、米諾環(huán)素、復方新諾明為膿腫分枝桿菌、鳥分枝桿菌、胞內分枝桿菌耐藥及堪薩斯分枝桿菌敏感；莫西沙星、加替沙星、左氧氟沙星、利福噴丁、利福布丁、環(huán)丙沙星、利奈唑胺、司帕沙星為膿腫分枝桿菌耐藥，鳥分枝桿菌、胞內分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌敏感。

表1 抗生素濃度范圍及判斷標準

Tab.1 Concentration range of antibiotics and the judgment standard

抗生素濃度范圍(μg/mL)標準菌株95021(μg/mL)最低抑菌濃度MIC(μg/mL)敏感(S)臨界值(I)耐藥(R)氧氟沙星64～0.03116～32--2利福平256～0.125>2565異煙肼256～0.125>256--1阿米卡星16～0.0084～8163264卷曲霉素16～0.008>16--2.5莫西沙星16～0.0084～8124加替沙星16～0.0082～4---左氧氟沙星16～0.008>16248環(huán)絲氨酸128～0.063128--50對氨基水楊酸64～0.031>64--2乙胺丁醇128～0.06332～645-10鏈霉素128～0.06364～1285-10妥布霉素64～0.0311～2248利福噴汀32～0.016>32---利福布丁32～0.01616～32--2環(huán)丙沙星32～0.0164～8124利奈唑胺64～0.03116～3281632司帕沙星16～0.0088～16---力克肺疾64～0.031>64---氯法齊明16～0.0080.25～0.5---頭西64～0.03132～641632～64128美羅培南64～0.031>6448～1632克拉霉素32～0.0160.25～0.5248米諾環(huán)素32～0.016>3212～416復方新諾明256～0.125>25638-76磺胺甲惡唑256～0.125>256---

表2 23株非結核分枝桿菌藥敏結果

Tab.2 Drug sensitivity test result of 23 strains of Mycobacterium tuberculosis

抗生素膿腫分枝桿菌(9株)鳥分枝桿菌(3株)胞內分枝桿菌(5株)堪薩斯分枝桿菌(6株)耐藥(R)敏感(S)耐藥(R)敏感(S)耐藥(R)敏感(S)耐藥(R)敏感(S)氧氟沙星90305006利福平90305006異煙肼90305060阿米卡星18031424卷曲霉素90305060莫西沙星90030506表2(續(xù))抗生素膿腫分枝桿菌(9株)鳥分枝桿菌(3株)胞內分枝桿菌(5株)堪薩斯分枝桿菌(6株)耐藥(R)敏感(S)耐藥(R)敏感(S)耐藥(R)敏感(S)耐藥(R)敏感(S)加替沙星63030506左氧氟沙星90030506環(huán)絲氨酸90305060對氨基水楊酸90305060乙胺丁醇90304142鏈霉素90304160妥布霉素18030506利福噴汀90030515利福布丁90030506環(huán)丙沙星90120506利奈唑胺90032306司帕沙星90030506力克肺疾90305042氯法齊明18030506頭西90305060美羅培南90305060克拉霉素18120506米諾環(huán)素81213206復方新諾明90214106磺胺甲惡唑90305060

3 討 論

非結核分枝桿菌廣泛存在于自然界的土壤，塵埃、水、魚類和家禽中。傳播途徑主要從環(huán)境中獲得感染，如污水等，而人與人之間的傳染極少見。最近幾次流調結果顯示非結核分枝桿菌肺病正呈逐年的增長趨勢。由于我國大部分地市級結核病實驗室并未開展非結核分枝桿菌菌種鑒定工作，因此常將非結核分枝桿菌病誤診為結核病進行診治，極大的延誤了非結核分枝桿菌的臨床治療。由于比例法藥敏試驗步驟繁瑣且耗時，不能及時獲得菌株的耐藥結果。本試驗采用微孔板阿爾瑪藍測定法，共測定26種藥物的MIC值，對于非結核的臨床治療藥物選擇提供了更多的依據(jù)。

從本實驗的結果來看，非結核分枝桿菌對大部分結核類抗生素都耐藥，尤其對常用的抗結核藥物中的異煙肼、卷曲霉素、鏈霉素到達100%的耐藥率；對氧氟沙星、乙胺丁醇、利福平達到70%以上耐藥率。如果以結核分枝桿菌常規(guī)治療方法則對患者無明顯效果。實驗結果顯示自貢市非結核分枝桿菌對阿米卡星、妥布霉素、氯法齊明及克拉霉素基本敏感，與盛青等研究結果較為一致[12]。本實驗共收集4種非結核分枝桿菌，其不同種對抗生素耐藥程度也不相同，其中膿腫分枝桿菌耐藥率達82.3%，鳥分枝桿菌與胞內分枝桿菌達53%，堪薩斯分枝桿菌耐藥率最低為38%。每種分枝桿菌中的幾株非結核分枝桿菌對抗生素的耐藥情況基本一致，對不同藥物的耐藥與否，是不是該種的特性值得研究。當然本次試驗中由于菌種較少，后期將繼續(xù)收集菌株研究藥物的耐藥性與菌種的關系。

本實驗中采用微孔板阿爾瑪藍測定法測定非結核分枝桿菌的MIC值，該方法中采用液體培養(yǎng)基及使用阿爾瑪藍指示劑，因此藥敏時間大大的縮短。同時本實驗檢測了26種藥物的MIC值，對于臨床的治療指導具有重要的作用。由于非結核分枝桿菌與結核分枝桿菌在臨床的表現(xiàn)及實驗室痰檢結果極為一致，因此很難區(qū)分。對于非結核分枝桿菌肺病病原體應該盡早鑒定并及時進行藥物敏感試驗，才能對臨床治療提供重要的實驗室依據(jù)。

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