王攀鴿，譚紅娜，王 博，肖慧娟，高劍波

(鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院放射科，河南 鄭州 450052)

淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移是乳腺癌最主要的轉(zhuǎn)移途徑。內(nèi)乳淋巴結(jié)接受乳腺25%的淋巴液回流，其有無受累影響乳腺癌治療方案的選擇、臨床準(zhǔn)確分期及預(yù)后評(píng)估[1-2]。隨著前哨淋巴結(jié)(sentinel lymph node, SLN)活檢技術(shù)在臨床上的推廣應(yīng)用，內(nèi)乳區(qū)SLN活檢已成為臨床外科研究的熱點(diǎn)[3]，但常規(guī)影像學(xué)方法往往無法顯示內(nèi)乳SLN。MR淋巴造影(MR lymphography, MR-LG)已用于腋窩SLN顯像[4]。本研究探討MR-LG顯示兔VX2乳腺癌內(nèi)乳SLN的可行性，旨在為臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選取雌性健康新西蘭大白兔75只(由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)，月齡5～8個(gè)月，體質(zhì)量1.5～1.8 kg，分為腫瘤組(n=55)或炎癥組(n=20)。

1.2 建立動(dòng)物模型 腫瘤組：將VX2腫瘤(由Shope病毒致乳頭瘤惡變形成上皮細(xì)胞惡性腫瘤，經(jīng)過72次傳代后建株)軟組織塊剪成約1 mm3碎塊，以18G穿刺活檢針將其種植于實(shí)驗(yàn)兔右側(cè)胸壁第2對(duì)乳頭的乳墊下，2周左右形成約“黃豆”大的實(shí)質(zhì)性腫塊，2～4周后以觸及實(shí)驗(yàn)兔腋下腫大淋巴結(jié)為建立兔VX2乳腺癌模型成功。炎癥組：以5 ml注射器分別于實(shí)驗(yàn)兔單側(cè)胸壁第2對(duì)乳墊下及上肢腋?jìng)?cè)皮下注射1 ml蛋黃乳膠(新鮮雞蛋黃與生理鹽水按10∶1配制，置勻漿器內(nèi)充分乳化)，5天后重復(fù)上述操作。實(shí)驗(yàn)兔均按普通級(jí)動(dòng)物給予分籠飼養(yǎng)，觀察腫瘤生長(zhǎng)情況及腋窩淋巴結(jié)是否腫大，以觸及腋窩淋巴結(jié)腫大或移植腫瘤最大徑≥3 cm為MR-LG檢查的最佳時(shí)機(jī)。

1.3 儀器與方法 采用Philips Achieva 3.0T MR儀，SENSE XL TORSO TWO線圈。麻醉后將動(dòng)物仰臥位、四肢伸展保定于約35 cm×35 cm自制檢查板上。先行常規(guī)平掃檢查，掃描范圍自鎖骨上窩至瘤體下緣，掃描序列及參數(shù)：軸位自旋回波T1W序列，TE 2 ms，TR 3 ms，F(xiàn)OV 180 mm×180 mm，層厚2 mm；軸位或冠狀位反轉(zhuǎn)恢復(fù)快速自旋回波T2W序列，TE 70 ms，TR 785 ms，F(xiàn)OV 210 mm×210 mm，層厚3 mm。之后腫瘤組于VX2腫瘤深部及內(nèi)側(cè)緣皮下分別注射釓噴酸葡胺注射液0.5 ml，炎癥組注射于乳暈區(qū)皮下，按摩3 min后再次行MR掃描，掃描序列為軸位及冠狀位T1W，掃描參數(shù)同平掃，并于5 min后再重復(fù)掃描1次。

采用ISP工作站進(jìn)行圖像后處理，將自注射部位至內(nèi)乳或腋窩方向的引流淋巴通路上最先顯像的1個(gè)或數(shù)個(gè)淋巴結(jié)定義為SLN，觀察并記錄SLN及其引流淋巴管顯像情況，并測(cè)量淋巴結(jié)大小。

1.4 SLN清掃術(shù)和術(shù)后病理學(xué)評(píng)價(jià) 于MR檢查后2天內(nèi)行淋巴結(jié)清掃術(shù)。術(shù)前24 h內(nèi)注射99mTc-硫膠體(核素強(qiáng)度0.7 mCi，直徑約10～20 nm，每個(gè)注射點(diǎn)注射0.5 ml)，注射方法同MR-LG，并于注射45～60 min后行核素淋巴顯像，以尋找腋窩和/或內(nèi)乳淋巴結(jié)的放射性熱點(diǎn)，并進(jìn)行體表標(biāo)記。麻醉、保定動(dòng)物同MR-LG檢查，以相同方法注射亞甲藍(lán)(每個(gè)注射點(diǎn)1 ml)并按摩3 min后，經(jīng)耳緣靜脈空氣栓塞處死實(shí)驗(yàn)兔。沿體表標(biāo)記在患側(cè)腋窩作約4 cm手術(shù)切口，切開皮下組織，尋找藍(lán)染淋巴管，并循淋巴管尋找藍(lán)染淋巴結(jié)；然后以γ探測(cè)儀檢出有放射性熱點(diǎn)的淋巴結(jié)。打開胸廓，在胸骨兩側(cè)尋找藍(lán)染及放射性計(jì)數(shù)增高的內(nèi)乳淋巴結(jié)。以藍(lán)染淋巴結(jié)、藍(lán)染淋巴管直接指向的淋巴結(jié)或放射性計(jì)數(shù)達(dá)到所檢出淋巴結(jié)最高放射性計(jì)數(shù)值10%的淋巴結(jié)均視為SLN，并手術(shù)摘除。記錄內(nèi)乳及腋窩SLN個(gè)數(shù)、大小，對(duì)手術(shù)摘除的淋巴結(jié)行常規(guī)HE染色后行病理學(xué)評(píng)價(jià)。將有癌細(xì)胞浸潤(rùn)的SLN稱為陽性SLN，反之則為陰性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)分析軟件。對(duì)計(jì)量資料行正態(tài)性檢驗(yàn)，服從正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，并行方差齊性檢驗(yàn)，如方差齊，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；不服從正態(tài)分布資料用中位數(shù)(上，下四分位數(shù))表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。分類資料用頻數(shù)及百分比表示，以χ2檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)比較組間差異。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

75只實(shí)驗(yàn)兔中，73只建模成功，成功率97.33%(73/75)；2只失敗，其中腫瘤組1只腫瘤未生長(zhǎng)，炎癥組1只因上肢、胸壁嚴(yán)重感染而死亡。73只實(shí)驗(yàn)兔中，4只因麻醉過度或檢查后不明原因死亡，最終納入69只實(shí)驗(yàn)兔，其中腫瘤組51只(圖1A、1B)，炎癥組18只。

2.1 內(nèi)乳SLN及淋巴管顯影情況 MR-LG對(duì)實(shí)驗(yàn)兔內(nèi)乳SLN及內(nèi)乳淋巴管的顯示率分別為15.94%(11/69)和75.36%(52/69)，其中顯示淋巴結(jié)16枚、內(nèi)乳淋巴管79條。腫瘤組與炎癥組間內(nèi)乳SLN及內(nèi)乳淋巴管顯示情況差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05，表1、圖1C、1D)。

表1 腫瘤組及炎癥組實(shí)驗(yàn)兔MR-LG顯示內(nèi)乳SLN及淋巴管情況

2.2 腫瘤組MR-LG顯示內(nèi)乳SLN的影響因素 腫瘤組MR-LG內(nèi)乳SLN顯示與未顯示實(shí)驗(yàn)兔間體質(zhì)量、腫瘤生長(zhǎng)時(shí)間，腫瘤長(zhǎng)徑，腋窩SLN數(shù)目、長(zhǎng)徑、陽性數(shù)目，內(nèi)乳淋巴管顯影情況差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05，表2)；腫瘤組內(nèi)乳淋巴管顯示與未顯示實(shí)驗(yàn)兔間原發(fā)灶腫瘤大小及腋窩SLN數(shù)目差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05，表3)。

表2 腫瘤組實(shí)驗(yàn)兔MR-LG顯示內(nèi)乳SLN的影響因素分析

表3 腫瘤組實(shí)驗(yàn)兔MR-LG顯示內(nèi)乳淋巴管的影響因素分析

圖1 腫瘤組實(shí)驗(yàn)兔 A.軸位T2WI示右側(cè)腹壁皮下腫塊(箭)，信號(hào)不均； B.病理圖示惡性腫瘤細(xì)胞(HE，×400)； C、D.MR-LG軸位T1WI示右側(cè)胸骨旁第2～3肋間內(nèi)乳SLN(C，黑箭)及內(nèi)乳淋巴管(D，白箭)，同時(shí)可見右側(cè)腋窩SLN(箭頭)顯影； E.術(shù)中見右側(cè)第2～3肋間藍(lán)染淋巴結(jié)； F.鏡下見淋巴結(jié)內(nèi)、尤其包膜下大量炎細(xì)胞浸潤(rùn)，以粒細(xì)胞為主，未見腫瘤細(xì)胞(HE，×100)

2.3 MR-LG與SLN清掃術(shù)結(jié)果對(duì)比 SLN清掃術(shù)共檢出23只實(shí)驗(yàn)兔31枚內(nèi)乳SLN，均為炎性改變(陰性SLN，圖1E、1F)。以手術(shù)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，MR-LG檢出內(nèi)乳SLN的準(zhǔn)確率、敏感度、特異度、假陰性率及假陽性率分別為76.81%(53/69)、39.13%(9/23)、95.65%(44/46)、60.86%(14/23)及4.35%(2/46)。MR-LG與SLN清掃術(shù)檢出的內(nèi)乳SLN的特征比較見表4，手術(shù)標(biāo)本測(cè)量?jī)?nèi)乳SLN長(zhǎng)徑、短徑均大于MR-LG測(cè)量值(P均<0.05)，而兩者長(zhǎng)短徑比值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.195)。

表4 MR-LG與SLN清掃術(shù)檢出兔內(nèi)乳SLN特征比較(±s)

表4 MR-LG與SLN清掃術(shù)檢出兔內(nèi)乳SLN特征比較(±s)

檢出方式長(zhǎng)徑(mm)短徑(mm)長(zhǎng)徑/短徑MR?LG2．64±0．592．24±0．541．20±0．21SLN清掃術(shù)3．48±0．522．76±0．491．27±0．16t值-5．721-0．524-1．317P值<0．0010．0010．195

3 討論

既往研究[5-7]表明，采用VX2腫瘤組織塊原位種植建立乳腺癌動(dòng)物模型及乳暈皮下注射新鮮雞蛋黃乳膠體建立兔炎性淋巴結(jié)動(dòng)物模型簡(jiǎn)單有效。本組建模成功率為97.33%(73/75)。腫瘤組1只未見明確腫瘤組織生長(zhǎng)，可能與移植腫瘤組織塊活性、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物個(gè)體免疫狀況及生長(zhǎng)環(huán)境差異等有關(guān)；1只炎癥組兔因上肢、胸壁形成大片膿腫、嚴(yán)重感染死亡，可能與注射蛋黃乳膠量較多、進(jìn)針過深、穿破筋膜及實(shí)驗(yàn)兔不耐受等因素有關(guān)。

乳腺SLN顯像檢查時(shí)，對(duì)比劑注射部位(乳暈區(qū)或腫瘤周圍皮下)鄰近腫瘤，對(duì)比劑流動(dòng)方向與腫瘤淋巴引流方向一致，可較好地反映腫瘤病變的局部淋巴引流情況[8-9]。MR-LG檢查已用于顯像并初步評(píng)價(jià)乳腺癌腋窩淋巴結(jié)狀態(tài)[4，10-11]。

內(nèi)乳淋巴結(jié)位置較深，主要引流乳腺內(nèi)側(cè)及深部淋巴液，臨床主要通過術(shù)前淋巴閃爍顯像及術(shù)中γ探測(cè)儀對(duì)其進(jìn)行定位[2，12]。目前多將同位素示蹤劑注射于乳腺實(shí)質(zhì)或腫瘤深部，并采用雙象限兩點(diǎn)注射法[13]等改良核素示蹤劑注射技術(shù)[14]。本研究采用兩點(diǎn)注射法，將對(duì)比劑/示蹤劑注入乳腺實(shí)質(zhì)及腫瘤深部，以提高SLN顯像率。本組結(jié)果顯示，MR-LG對(duì)內(nèi)乳SLN及淋巴管的顯示率分別為15.94%(11/69)和75.36%(52/69)，提示MR-LG顯示兔VX2乳腺癌模型的內(nèi)乳SLN及其引流淋巴管具有可行性。以SLN清掃術(shù)結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，本組MR-LG檢出內(nèi)乳SLN的準(zhǔn)確率較高，為76.81%(53/69)，且假陰性率及假陽性率均較低，表明MR-LG顯示實(shí)驗(yàn)兔內(nèi)乳SLN及淋巴管具有較高價(jià)值。

原發(fā)灶腫瘤大小及腋窩淋巴結(jié)有無受累與內(nèi)乳淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[15-16]。本研究將觸及腋窩淋巴結(jié)腫大或移植腫瘤最大徑>3 cm作為影像學(xué)檢查的最佳時(shí)機(jī)，理論上可提高內(nèi)乳淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移率及顯像率。但本組MR-LG檢查中SLN總體顯示率僅為15.94%(11/69)，且均為炎性，與預(yù)期存在差異，可能與本組動(dòng)物模型腫瘤侵襲性較弱、實(shí)驗(yàn)動(dòng)物個(gè)體免疫力較強(qiáng)或內(nèi)乳區(qū)淋巴結(jié)未見增大或轉(zhuǎn)移有關(guān)，提示宜采用侵襲性較強(qiáng)的瘤株建立動(dòng)物模型。本研究中內(nèi)乳SLN顯像與否與原發(fā)灶腫瘤大小及腋淋巴結(jié)狀態(tài)等均無明顯關(guān)系，可能與顯影內(nèi)乳SLN數(shù)目較少有關(guān)；而原發(fā)灶大小及腋淋巴結(jié)數(shù)目影響內(nèi)乳淋巴管的顯示，提示可進(jìn)一步調(diào)整檢查時(shí)機(jī)，以提高內(nèi)乳淋巴管顯示率。內(nèi)乳淋巴結(jié)處于乳腺淋巴引流通路，理論上提高內(nèi)乳淋巴管顯示率可相應(yīng)提高內(nèi)乳SLN顯示率，有待擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步觀察。

本研究中手術(shù)標(biāo)本測(cè)量的內(nèi)乳SLN長(zhǎng)、短徑均大于MR-LG測(cè)量值，分析原因，手術(shù)標(biāo)本測(cè)量長(zhǎng)徑為其三維最大徑，而MR-LG均在軸位圖像測(cè)量淋巴結(jié)長(zhǎng)、短徑，受掃描層厚及測(cè)量誤差影響，所選測(cè)量層面可能非最大截面。另外，淋巴結(jié)長(zhǎng)短徑比值主要反映淋巴結(jié)形態(tài)，MR-LG與手術(shù)檢出內(nèi)乳SLN比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明MR-LG圖像可基本反映淋巴結(jié)形態(tài)。

總之，以MR-LG顯示兔VX2乳腺癌模型內(nèi)乳SLN及其引流淋巴管具有可行性，尚需深入研究、改良方法，以提高其顯示率。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Cong BB, Qiu PF, Wang YS. Internal mammary sentinel lymph node biopsy: Minimally invasive staging and tailored internal mammary radiotherapy. Ann SurgOncol, 2014,21(7):2119-2121.

[2] Gnerlich JL, Barreto-Andrade JC, Czechura T, et al. Accurate staging with internal mammary chain sentinel node biopsy for breast cancer. Ann Surg Oncol, 2014,21(2):368-374.

[3] 邱鵬飛,趙榮榮,叢斌斌,等.乳腺癌內(nèi)乳區(qū)前哨淋巴結(jié)活檢術(shù)對(duì)淋巴分期和個(gè)體化治療的影響.中華腫瘤雜志,2016,38(1):42-47.

[4] Lu Q, Hua J, Kassir MM, et al. Imaging lymphatic system in breast cancer patients with magnetic resonance lymphangiography. PLoS One, 2013,8(7):e69701.

[5] 劉玉璽,孫業(yè)全,王苗苗,等.改良型乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移模型的制備及超聲表現(xiàn).中國(guó)醫(yī)學(xué)影像學(xué)雜志,2016,24(6):410-413.

[6] 孟珊,李傳明,楊新華,等.磁共振間質(zhì)淋巴造影診斷乳腺癌腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移.中國(guó)醫(yī)學(xué)影像技術(shù),2013,29(12):1977-1980.

[7] 王志銘,劉欣,錢穎,等.兔乳腺腫瘤及炎性病變前哨淋巴結(jié)間接CT淋巴造影實(shí)驗(yàn)研究.遼寧醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2010,31(4):289-292,381.

[8] Suga K, Ogasawara N, Okada M, et al. Interstitial CT lymphography-guided localization of breast sentinel lymph node: Preliminary results. Surgery, 2003,133(2):170-179.

[9] Suga K, Ogasawara N, Yuan Y, et al. Visualization of breast lymphatic pathways with an indirect computed tomography lymphography using a nonionic monometric contrast medium iopamidol:Preliminary results. Invest Radiol, 2003,38(2):73-84.

[10] Li C, Meng S, Yang X, et al. Sentinel lymph node detection using magnetic resonance lymphography with conventional gadolinium contrast agent in breast cancer: A preliminary clinical study. BMC Cancer, 2015,15:213.

[11] Shiozawa M, Kobayashi S, Sato Y, et al. Magnetic resonance lymphography of sentinel lymph nodes in patients with breast cancer using superparamagnetic iron oxide: A feasibility study. Breast Cancer, 2014,21(4):394-401.

[12] 叢斌斌,邱鵬飛,王永勝.乳腺癌內(nèi)乳區(qū)前哨淋巴結(jié)活檢術(shù)研究進(jìn)展.中華普通外科學(xué)文獻(xiàn)(電子版),2013,7(4):311-314.

[13] 邱鵬飛,劉雁冰,趙榮榮,等.乳腺癌內(nèi)乳區(qū)前哨淋巴結(jié)顯像新技術(shù).中華腫瘤雜志,2013,35(11):858-862.

[14] Qiu PF, Cong BB, Zhao RR, et al. Internal mammary sentinel lymph node biopsy with modified injection technique:High visualization rate and accurate staging. Medicine (Baltimore), 2015,94(41):e1790.

[15] Huang O, Wang L, Shen K, et al. Breast cancer subpopulation with high risk of internal mammary lymph nodes metastasis: Analysis of 2,269 Chinese breast cancer patients treated with extended radical mastectomy. Breast Cancer Res Treat, 2008,107(3):379-387.

[16] Lee HW, Kim SH. Breast magnetic resonance imaging for assessment of internal mammary lymph node status in breast cancer. J Breast Cancer, 2016,19(2):191-198.