申少斐，裴燕妮，張 麗，王德富，牛顏冰

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷030801）

油用牡丹以其較高的品質(zhì)、產(chǎn)出與含油率的特點(diǎn)為眾人所知[1-2]，它是我們國家特有資源中新開發(fā)的優(yōu)質(zhì)木本油料植物[3-4]，同時(shí)也是芍藥科芍藥屬多年生灌木，其中，牡丹籽油中不飽和脂肪酸含量超過90%，亞麻酸占42%，享有“液體黃金”的美譽(yù)[5-6]，在心腦血管疾病的預(yù)防、智力的強(qiáng)化以及血脂的減低等方面都具有一定的效用[3，7-8]。

茋類化合物是指涵蓋了1，2－二苯乙烯骨架的單體及其組成的聚合物的統(tǒng)稱。大量的研究結(jié)果表明，芍藥科植物種子中所含有的豐富茋類成分，是一類重要的天然多酚類化合物[9]。近年來，因其在生物活性方面的突出特點(diǎn)而吸引了諸多探究者對其進(jìn)行研究[10-13]。目前，研究發(fā)現(xiàn)，油用牡丹種子殼中含有多種茋類化合物，包括Suffruticosol A，Suffruticosol B等芍藥科植物種子特有的一類化合物[14-15]。但現(xiàn)階段，關(guān)于油用牡丹籽仁中茋類化合物的獲取途徑及其抑菌活性的研究鮮有報(bào)道。

為充分利用油用牡丹資源，本研究將原料選定為鳳丹油用牡丹籽仁，借助響應(yīng)面分析法對其茋類化合物的超聲波提取方式加以改進(jìn)，并通過大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌試驗(yàn)研究提取物的生物活性，旨在為油用牡丹資源的進(jìn)一步開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試油用牡丹鳳丹種子由山西汾河牡丹實(shí)業(yè)股份有限公司提供。

供試菌種為大腸桿菌（Escherichia coli）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 油用牡丹籽仁粉末制備 將鳳丹牡丹種子室內(nèi)通風(fēng)干燥、人工揀選、手工去殼，獲得牡丹籽仁，并將其破碎成粉。用索氏提取脫脂[16]：即取適量的牡丹籽仁粉末于折疊好的定性濾紙中，將其包好放入索氏提取器的浸提罐，同時(shí)用量筒量取適量石油醚[17]，在80℃條件下水浴加熱回流3次，將所得粉末置于干凈紙上，室內(nèi)避光通風(fēng)12 h，壓成細(xì)粉裝入自封袋中備用。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制方法 精準(zhǔn)稱沒食子酸0.5 g，用適量的蒸餾水定容，使其保持在100 mL，用移液管從中依次量取 1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，并分別稀釋100倍。在2～3 min內(nèi)，從上述稀釋液中分別移取 0.1 mL，然后依次滴加 6 mL 的蒸餾水、0.5 mL 的Folin-Ciocalteu 試劑、1.5 mL 20%的碳酸鈉溶液，振蕩、搖勻，之后加水定容到10 mL。25℃避光反應(yīng)30 min，記錄749 nm處的吸光值[14]。將吸光值（A）、沒食子酸濃度[18]分別設(shè)定為縱、橫軸的取值[13]，繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 茋類化合物的提取 準(zhǔn)確稱量若干份1.0 g牡丹籽仁粉末，用70%乙醇溶液作提取溶劑，在不同的液料比、時(shí)間和功率下進(jìn)行超聲提取。提取完之后離心5 min，上清液存放于棕色瓶中待測。

1.2.4 茋類化合物含量的測定 本試驗(yàn)采用Folin-Ciocalteu比色法[18-19]進(jìn)行茋類化合物含量的測定。分別吸取放于棕色瓶中的上清液0.1 mL，并依次滴加6 mL的蒸餾水、0.5 mL的Folin-Ciocalteu試劑、1.5 mL 20%的碳酸鈉溶液，振蕩、搖勻，之后加水定容到10 mL。室溫環(huán)境中完成避光反應(yīng)，持續(xù)30 min[18]，測試749 nm處的吸光值[14]，同時(shí)借助回歸方程計(jì)算茋類化合物的含量。

1.2.5 供試菌種的制備 在提早預(yù)備好的LB液體培養(yǎng)基當(dāng)中加入干燥大腸桿菌（或者金黃色葡萄球菌）菌落，封口，將三角瓶置于37℃的搖床上振搖，待液體培養(yǎng)基渾濁后停止振搖（不可長期振搖，以防菌種死亡）。將接種環(huán)滅菌，蘸取菌液，在LB固體培養(yǎng)基上劃線（每次劃線前接種環(huán)都要用酒精燈火焰灼燒并冷卻），接著封口，將其放進(jìn)37℃培養(yǎng)箱中，0.5 h后將培養(yǎng)基倒置。用1 000 μL移液槍將液體培養(yǎng)基加入到EP管中（每個(gè)EP管2 mL液體培養(yǎng)基），一段時(shí)間后觀察細(xì)菌生長情況，最終制成濃度為106～107個(gè)/mL的菌懸液，置于4℃環(huán)境中備用。

1.2.6 抑菌活性的測定 將分離出的茋類化合物用甲醇稀釋，采用二倍稀釋法，分別配制出質(zhì)量濃度為 2.5，1.25，0.625，0.313，0.156 mg/mL 共 5 個(gè)梯度。然后用打孔工具在無菌濾紙片上打出若干濾紙小圓片，將這些小圓片分別浸泡在稀釋好的藥液以及蒸餾水（蒸餾水為空白對照）中。取LB固體培養(yǎng)基，以記號筆于培養(yǎng)皿底端對培養(yǎng)基進(jìn)行均勻劃分，使其成為6個(gè)不同的小區(qū)域，借助涂布棒把已經(jīng)完成活化的大腸桿菌在固體培養(yǎng)基上加以涂抹分布，使其具有均等性，并把浸泡好的小圓片貼在每個(gè)區(qū)域中心。封口，放入37℃的培養(yǎng)箱中，0.5 h后倒置。一段時(shí)間后，待培養(yǎng)基上長出菌落后，測量抑菌直徑并記錄結(jié)果，以蒸餾水浸泡過的濾紙片作為空白對照組。采用以上方法完成金黃色葡萄球菌的相同試驗(yàn)，對抑菌直徑加以測量，記錄結(jié)果。

1.3 單因素試驗(yàn)

1.3.1 液料比試驗(yàn) 用電子天平稱量1.0 g脫脂牡丹籽仁粉末若干份，室溫下用70%乙醇溶液作為提取溶劑，超聲時(shí)間40 min，超聲功率200 W。分別在液料比為 10∶1，20∶1，30∶1，40∶1，50∶1（mL/g）的狀況下完成超聲提取，而后進(jìn)行5 min的離心，取上清液存于棕色瓶。最后分別取0.1 mL不同液料比提取液，用1.2.4茋類化合物合量的測定顯色方法，經(jīng)回歸方程計(jì)算不同液料比茋類化合物的含量。1.3.2 超聲提取時(shí)間試驗(yàn) 液料比與超聲提取功率分別為 30∶1（mL/g），200 W，超聲提取時(shí)間分別選取 20，30，40，50，60 min。后續(xù)處理同 1.3.1。

1.3.3 超聲提取功率試驗(yàn) 液料比 30∶1（mL/g），超聲時(shí)間40 min，超聲功率分別選取100，150，200，250，300 W。后續(xù)處理同 1.3.1。

1.4 Box-Behnken 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

參照單因素試驗(yàn)結(jié)果，液料比、超聲時(shí)間、超聲功率3個(gè)因素分別用A，B，C表示，每個(gè)因素設(shè)高、中、低水平，分別用 +1，0，-1 表示[20-21]。表 1 采用響應(yīng)面試驗(yàn)方案隨機(jī)進(jìn)行試驗(yàn)，以減少誤差，總計(jì)進(jìn)行17組試驗(yàn)，每組試驗(yàn)進(jìn)行3次，結(jié)果取平均值。

表1 響應(yīng)面分析法三因素及水平

2 結(jié)果與分析

2.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖1可知，沒食子酸的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程是y＝1.1657x＋0.00695（R2＝0.996）。式中，x 代表樣品沒食子酸的質(zhì)量濃度（μg/mL），y為吸光度值（A）。結(jié)果表明，x在0～0.25 mg/L區(qū)間內(nèi)線性關(guān)系較佳[15]。

2.2 單因素結(jié)果分析

2.2.1 液料比對茋類化合物提取效率的影響 由圖2可知，在其他條件不變、改變液料比時(shí)，茋類化合物提取量在 0.216 1～0.465 0 mg/g，當(dāng)液料比較低時(shí)，牡丹籽仁粉黏度較大，在提取溶劑中不易擴(kuò)散，超聲時(shí)的空化效應(yīng)顯著降低，使得牡丹籽仁中茋類化合物釋放、擴(kuò)散、溶解速率慢，提取量較低；當(dāng)液料比增多時(shí)，提取溶液滲透壓增大，有利于牡丹籽仁中茋類化合物的提取，液料比為30∶1（mL/g）時(shí)，提取量最大；之后再增大液料比，由于溶劑中茋類化合物達(dá)到平衡濃度，提取量不再升高，趨于穩(wěn)定。因此，從提取劑使用量的經(jīng)濟(jì)性和茋類化合物提取效率方面考慮，最終選定30∶1（mL/g）作為最優(yōu)液料比。

2.2.2 超聲時(shí)間對茋類化合物提取效率的影響由圖3可知，在其他條件不變、改變超聲時(shí)間時(shí)，茋類化合物提取量在 0.425 2～0.442 9 mg/g。不同超聲時(shí)間對牡丹籽仁中上述化合物溶出的效用表現(xiàn)為先促進(jìn)后抑制，在20～40 min時(shí)，茋類化合物的提取量隨提取時(shí)間的增加而持續(xù)加大。這是由于超聲破碎效用愈強(qiáng)勁，細(xì)胞的受損度就愈高，牡丹籽仁中的茋類化合物更加易于溶解出來，提取量也越大，并在40 min達(dá)到峰值；之后超聲提取時(shí)間高于40 min，提取液的溫度則大幅上漲，以致低聚茋類化合物的構(gòu)造出現(xiàn)改變，提取量則快速減小。因此，超聲提取的最佳時(shí)間為40 min。

2.2.3 超聲功率對茋類化合物提取效率的影響從圖4可以看出，在其他條件不變、改變超聲功率時(shí)，茋類化合物提取量在 0.328 1～0.499 1 mg/g。在提取過程中，隨著超聲功率的提高，超聲波產(chǎn)生的縱橫雙向振動(dòng)更加劇烈，超聲的空化效應(yīng)更加明顯，直到200 W時(shí)，提取量達(dá)到最大；之后超聲功率繼續(xù)增大，提取液的溫度會顯著提高，導(dǎo)致茋類化合物結(jié)構(gòu)變化，含量則降低。因此，選用200 W的超聲功率為最佳功率。

2.3 響應(yīng)面結(jié)果分析

經(jīng)Design Expert 8.0對表2所得的方案數(shù)據(jù)進(jìn)一步解析，將響應(yīng)值Y視作茋類化合物的具體提取量，回歸擬合模型，得出下式。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與分析

從表 3可以看出，模型的 F＝27.89和P＝0.000 1，達(dá)極顯著水平（P＜0.01，其余同），與實(shí)際試驗(yàn)的擬合度高，試驗(yàn)精準(zhǔn)度高，操作可信。失擬項(xiàng)P＝0.233 7＞0.05，不顯著，表明無其余因素的突出干擾，模型是有效可行的，可將茋類化合物提取量與液料比、超聲時(shí)間與超聲功率之間的關(guān)聯(lián)性較為清晰地展現(xiàn)出來。調(diào)整決定系數(shù)為0.938 0，表明93.80%的試驗(yàn)指標(biāo)的變化能用此模型分析。模型的決定系數(shù) R2＝0.972 9＞0.900 0，即該模型契合度很好，表明97.29%的試驗(yàn)數(shù)據(jù)可用這個(gè)方程解釋。從回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可以看出，A2，B2，C2和A項(xiàng)極顯著，交互項(xiàng)AB顯著，其余項(xiàng)均不顯著。根據(jù)P值大小分析，單個(gè)因素對牡丹籽仁中茋類化合物提取量影響大小順序?yàn)锳（液料比）＞C（超聲功率）＞B（超聲時(shí)間）。

表3 方差分析結(jié)果

2.4 多因素間交互作用分析

2.4.1 液料比和超聲時(shí)間的交互作用 圖5表示當(dāng)超聲功率為200 W時(shí)，液料比、超聲時(shí)間二者對茋類化合物提取量的交互作用。由圖5可知，3D響應(yīng)面較陡，表明A和B交互時(shí)茋類化合物提取所受影響較大；3D響應(yīng)面圖顯示，伴隨液料比的提高和時(shí)間增加的過程漸漸上移，且液料比的影響較超聲時(shí)間更為顯著。

2.4.2 液料比和超聲功率交互作用 圖6表示當(dāng)超聲時(shí)間為40 min時(shí)，超聲功率、液料比二者對茋類化合物提取量的交互影響。由圖6可知，當(dāng)液料比為固定數(shù)值時(shí)，如果超聲功率增加，則茋類化合物的提取量表現(xiàn)為先上漲而后減?。划?dāng)超聲功率為固定數(shù)值時(shí)，如果液料比增大，則茋類化合物的提取量也表現(xiàn)為先上漲而后減少的變化趨勢。

2.4.3 超聲時(shí)間和超聲功率交互作用 圖7表示當(dāng)液料比為30∶1（mL/g）時(shí)，茋類化合物提取量受到超聲功率及超聲時(shí)間的交互影響。從圖7可以看出，曲面較平坦，說明B和C互作對茋類化合物提取量的影響不顯著，與方差分析的結(jié)果相對應(yīng)（BC的 P＞0.05）。

2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

為了對響應(yīng)面分析法設(shè)計(jì)的可操作性加以證實(shí)，借助優(yōu)化改進(jìn)后的提取條件對牡丹籽仁中低聚茋類化合物提取展開具體的試驗(yàn)，其中，液料比為33.68∶1（mL/g）、超聲時(shí)間為 39.42 min、超聲功率為200.18 W。根據(jù)實(shí)際條件，將參數(shù)對應(yīng)優(yōu)化為：34∶1（mL/g），40 min，200 W，該條件下，重復(fù) 3 次試驗(yàn)，取平均值，從而得到茋類化合物的提取量是0.465 4 mg/g，與理論預(yù)估數(shù)值較為一致。說明采用Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)優(yōu)化得到的回歸方程能夠較真實(shí)地反映各因素對牡丹籽仁中茋類化合物提取量的影響。因此，該模型應(yīng)用于優(yōu)化鳳丹牡丹籽仁中茋類化合物的提取工藝是可行的。

2.6 不同質(zhì)量濃度的牡丹籽仁茋類提取物對細(xì)菌的抑制作用

由表4可知，牡丹籽仁茋類提取物可以對細(xì)菌產(chǎn)生顯著的抑制作用，當(dāng)茋類提取物質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL，則對2類細(xì)菌的抑制成效最優(yōu)；在低質(zhì)量濃度為0～2.5 mg/mL，濃度愈高，則菌種被抑制的成效愈突出。若濃度一樣，從抑菌圈直徑來看，大腸桿菌較金黃色葡萄球菌大。所以，茋類提取物對大腸桿菌的抑菌成效遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出金黃色葡萄球菌。

表4 不同質(zhì)量濃度的牡丹籽仁茋類提取物對細(xì)菌的抑制 mm

3 結(jié)論

本研究通過超聲提取牡丹籽仁中茋類化合物，并采用單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面分析法對分離條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，牡丹籽仁中茋類化合物提取量受到各個(gè)因素的影響大小從高至低依次為液料比、超聲功率、超聲時(shí)間；最適工藝條件為：液料比34∶1（mL/g）、功率 200 W、時(shí)間 40 min，此時(shí)茋類化合物的提取量為0.465 4 mg/g。最后，借助對大腸桿菌及金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑的觀察，證實(shí)了牡丹籽仁茋類化合物的抑菌性較佳，且對大腸桿菌的抑菌成效尤為突出。

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