張文俊 熊梅娟 劉怡果 薛國勇 劉曾旭△

(1 南昌大學(xué)解剖學(xué)教研室， 南昌 330000； 2 井岡山大學(xué)解剖學(xué)教研室， 吉安 343000)

神經(jīng)損傷引起的疼痛機(jī)制復(fù)雜，未能完全閘明。嘌呤受體P2X家族在神經(jīng)損傷引起的疼痛中發(fā)揮著重要的作用[1]。研究表明嘌呤P2X3受體表達(dá)水平與神經(jīng)病理性疼痛呈正相關(guān)[2-3]。目前，用細(xì)胞移植治療周圍神經(jīng)損傷效果較好，而嗅鞘細(xì)胞(olfactory ensheathing cells， OECs)是一種特殊的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，能終生不斷更新存活，釋放多種神經(jīng)營養(yǎng)因子，改變神經(jīng)周邊的損傷局部環(huán)境，利于神經(jīng)修復(fù)[4-5]。微囊化(microencapsulation,MC)具有隔離移植細(xì)胞與宿主直接接觸，免受宿主免疫排斥作用[6]，延長細(xì)胞存活時間，更有利于細(xì)胞修復(fù)神經(jīng)損傷[7-8]。而微囊化嗅鞘細(xì)胞移植治療神經(jīng)損傷，國內(nèi)外報道較少。本研究通過結(jié)扎SD大鼠的坐骨神經(jīng)，制作周圍神經(jīng)損傷的動物模型，用微囊化嗅鞘細(xì)胞和非微囊化嗅鞘細(xì)胞移植到坐骨神經(jīng)損傷周圍，于術(shù)后10d和20d 用行為學(xué)方法檢測各組大鼠機(jī)械刺激縮足反射閾值，原位雜交組織化學(xué)方法檢測大鼠P2X3受體的表達(dá)情況并進(jìn)行對比。

1 材料和方法

1.1 實驗動物及主要材料

健康SD大鼠40只，雌雄不拘，體質(zhì)量80～100g，周齡3周。

4%多聚甲醛，1%DEPC水(中國博士德公司)；15%胎牛血清(Transgen，北京)；DMEM/F12培養(yǎng)基(博士德，武漢)；1.5%海藻酸鈉(美國Sigma公司)；專用PBS緩沖液(1000ml雙蒸水、NaCl 30g、Na2HPO4·12H2O 6g、NaH2PO4·2H2O 0.4g，pH 7.2～7.6)，3%檸檬酸，2×SSC緩沖液(1000ml雙蒸水加氯化鈉17.6g、檸檬酸三鈉8.8g)，0.5×SSC(300ml雙蒸水+100ml 2×SSC)，0.2×SSC(270ml雙蒸水+30ml 2×SSC)，P2X3受體專用原位雜交試劑盒(中國武漢博士德生物公司)包括：10×胃蛋白酶、預(yù)雜交液2ml、P2X3寡核苷酸探針雜交液2ml、封閉液5ml、生物素化鼠抗地高辛5ml、SABC-POD 5ml、生物素化過氧化物酶5ml。冰凍切片機(jī)(Promega company，美國)，倒置顯微鏡(Olympus BX-41，日本)；原位雜交專用蓋玻片，高速離心機(jī)(Affinity，美國)；Aesthesio VonFrey細(xì)絲及玻璃盒(Danmic，CA，USA)。

1.2 嗅鞘細(xì)胞的取材及培養(yǎng)

取1只健康SD大鼠，用無菌注射器吸取1ml 2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，用碘伏消毒大鼠頭頸部3遍，用無菌外科剪斷頭，打開皮膚及皮下組織，充分暴露嗅球組織，并將其完整取下，放于準(zhǔn)備好的PBS中漂洗，約5min，再用眼科剪將嗅球組織剪成碎末，經(jīng)過小濾過網(wǎng)，將濾過后的嗅球組織碎末置于10ml離心管中，用一次性吸管吸取5ml 0.5%的胰蛋白酶進(jìn)行消化，約5min，加入5ml培養(yǎng)基終止消化，將離心管放于離心機(jī)中(1000r/min，10min)，倒掉上清液，加入15%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，用一次性滴管，輕輕吹打(60～80次)混勻，將細(xì)胞懸液種植到無菌培養(yǎng)瓶中，將培養(yǎng)瓶放入CO2孵箱中，按NASH差速貼壁方法進(jìn)行培養(yǎng)，第1次36h換液1次，以后根據(jù)細(xì)胞生長情況，隔2～3d進(jìn)行換液，并在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁情況及生長狀況，原代培養(yǎng)5d可進(jìn)行細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)。

1.3 制備微囊化嗅鞘細(xì)胞

取擴(kuò)增第9天的細(xì)胞懸液，將細(xì)胞懸液在顯微鏡下計數(shù)2.4×106/ml，加1滴錐蟲藍(lán)染色與細(xì)胞懸液混勻，加到細(xì)胞計數(shù)板上，在倒置顯微鏡下計算細(xì)胞存活率>95%后，將細(xì)胞懸液與1.5%海藻酸鈉生理鹽水溶液1∶1混勻，經(jīng)自制雙腔噴頭(事先經(jīng)過消毒)將其均勻緩慢噴入20mmol/L的氯化鋇生理鹽水溶液中，輕搖混勻后靜置沉淀，吸去上清，生理鹽水洗滌2次，最后將所得微囊懸浸于生理鹽水中備用。

1.4 動物模型建立及分組

實驗分4組，對照組(sham)、慢性坐骨神經(jīng)損傷組(CCI)、非微囊化嗅鞘細(xì)胞組(non-MC-OECs)及微囊化嗅鞘細(xì)胞組(MC-OECs)，各組10只。Sham組：取1%戊巴比妥鈉(40mg/kg)，從大鼠腹腔進(jìn)行麻醉，將大鼠固定在手術(shù)臺上，先剪掉右下肢毛發(fā)，用碘伏進(jìn)行外在皮膚消毒3遍，逐層打開皮下組織，暴露右下肢坐骨神經(jīng)，不做坐骨神經(jīng)結(jié)扎處理，然后逐層縫合皮膚，再次消毒，做好標(biāo)記。CCI組：按照上述同樣方法暴露大鼠右下肢坐骨神經(jīng)，用玻璃分針分離開坐骨神經(jīng)周邊的筋膜組織，用4號羊腸線結(jié)扎4道，間距為1mm，結(jié)扎力度以右下肢抽動為宜，然后縫合，消毒，做好標(biāo)記。non-MC-OECs組：按照以上方法暴露坐骨神經(jīng)，用可吸收明膠海綿吸1ml嗅鞘細(xì)胞懸液(2.4×106/ml)，置于坐骨神經(jīng)兩側(cè)，縫合，消毒，做好標(biāo)記。MC-OECs組：按照同樣方法暴露右下肢坐骨神經(jīng)，用可吸收明膠海綿吸同等量的微囊化嗅鞘細(xì)胞懸液置于坐骨神經(jīng)兩側(cè)，逐層縫合，消毒，做好標(biāo)記。以上4組在常溫，濕度適宜下，分別分開飼養(yǎng)，定期更換墊料并加飼料，補(bǔ)充水分，并觀察各組大鼠右下肢的情況。

1.5 大鼠機(jī)械刺激誘發(fā)反射閾值檢測

于術(shù)后10、20d，將各組大鼠放于VonFrey痛閾測量玻璃儀器中，有機(jī)玻璃儀底部為鐵絲網(wǎng)構(gòu)成，玻璃儀器放于水平面上，在常溫，安靜環(huán)境下，讓其在儀器中適應(yīng)15min，用VonFrey細(xì)絲刺激大鼠右后肢足底，刺激強(qiáng)度逐漸增加，直到大鼠右后肢出現(xiàn)縮足、舔足的反應(yīng)即可，每次刺激時間不少于15s，當(dāng)用細(xì)絲針刺激大鼠后肢時，出現(xiàn)大鼠右后肢抬足，縮足的最小刺激強(qiáng)度為機(jī)械縮足反射閾值(WMT)，重復(fù)3次，取平均值。

1.6 原位雜交組織化學(xué)方法

于術(shù)后10、20d，將各組大鼠進(jìn)行麻醉灌注，取第4～5 腰椎(L4-5)處背根神經(jīng)節(jié)放入4%多聚甲醛固定4h，再放入15%和30%的蔗糖溶液(1%DEPC水配置)中進(jìn)行梯度脫水過夜，將組織放入冰凍切片機(jī)中切片，厚度10nm，將組織吸附于載玻片上，常溫下放置30min，將載玻片放入PBS中漂洗3×5min；加3%檸檬酸胃蛋白酶，室溫下作用1～2min，PBS洗滌3×5min；加預(yù)雜交液，并放入38℃水浴箱中作用2h，不洗；加雜交液，蓋上專用蓋玻片，放入38℃水浴箱中過夜；2×SSC，0.5×SSC，0.2×SSC在38℃水浴箱中依次洗滌3次，每次5min，加封閉液，水浴箱中封閉30min，不洗；加生物素化鼠抗地高辛，水浴箱中作用90min，PBS洗滌3×5min；加SABC水浴箱中作用20min，PBS洗滌3×5min；加生物素化過氧化物酶，水浴箱中作用30min，PBS洗3×5min；加DAB顯色液顯色2min，載玻片上組織變成黃色即可，放入水中沖洗；乙醇梯度脫水，二甲苯透明，封片，倒置顯微鏡下觀察，染成棕黃色和褐色為P2X3受體表達(dá)陽性細(xì)胞，用Image-Pro Plus 6.0軟件測量P2X3受體陽性細(xì)胞百分比及平均吸光度表達(dá)情況。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 大鼠飼養(yǎng)及觀察情況

術(shù)后定期觀察大鼠飼養(yǎng)情況，大鼠生長情況良好，未見咬傷及死亡情況，術(shù)后10、20d觀察大鼠右下肢情況，sham組大鼠右下肢活動正常；CCI組大鼠右下肢癱瘓，無活動，拉其右下肢無收縮；non-MC-OECs組大鼠右下肢有活動，拉其后肢有收縮反應(yīng)，收縮緩慢，下肢能支撐；相比non-MC-OECs組，MC-OECs組大鼠右下肢活動有力，拉其下肢收縮時間較快。術(shù)后20d比術(shù)后10d大鼠右下肢恢復(fù)較好。

2.2 大鼠機(jī)械刺激縮足反射閾值

于術(shù)后10、20d分別檢測各組大鼠右后肢機(jī)械刺激縮足反射閾值，與sham組對比，CCI組大鼠機(jī)械縮足反射閾值明顯減低(P<0.05)；與CCI組對比，non-MC-OECs組與MC-OECs組大鼠右后肢機(jī)械縮足反射閾值明顯增高(P<0.05)；與non-MC-OECs組對比，MC-OECs組大鼠右后肢機(jī)械縮足反射閾值增高(P<0.05)；與術(shù)后10d相比，術(shù)后20d的MC-OECs組大鼠機(jī)械縮足反射閾值較高(圖1)。

圖1 術(shù)后10d和20d大鼠機(jī)械刺激縮足反射結(jié)果Fig 1 Mechanical stimulation constraining thresholds of rats at the 10th and 20th day after surgery*P<0.05 vs sham group; △P<0.05 vs CCI group;#P<0.05 vs non-MC-OECs

2.3 背根節(jié)P2X3 mRNA表達(dá)

術(shù)后10、20d原位雜交檢測大鼠背根神經(jīng)節(jié)P2X3受體雜交陽性細(xì)胞百分比及平均吸光度表達(dá)情況。P2X3受體陽性細(xì)胞為黃色及褐色，以細(xì)胞核表達(dá)為主，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜少量表達(dá)，較細(xì)胞核淡。與sham組對比，CCI組P2X3受體雜交陽性細(xì)胞染色較深，細(xì)胞核呈深黃色及褐色，細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色，陽性細(xì)胞百分比及平均吸光度明顯增高(P<0.05)；與CCI組對比，non-MC-OECs組及MC-OECs組P2X3受體雜交陽性細(xì)胞染色變淡，陽性細(xì)胞百分比及平均細(xì)胞吸光度明顯減低(P<0.05)；而與non-MC-OECs組對比，MC-OECs組的雜交陽性細(xì)胞百分比及細(xì)胞平均吸光度降低(P<0.05)。與術(shù)后10d對比，術(shù)后20d non-MC-OECs組和MC-OECs組P2X3受體陽性細(xì)胞百分比及平均吸光度明顯減低，且MC-OECs組要更低(圖2、表1)。

圖2 術(shù)后10d(A1～D1)和20d(A2～D2)，原位雜交組織化學(xué)檢測各組大鼠背根神經(jīng)節(jié)P2X3受體雜交陽性表達(dá)結(jié)果。標(biāo)尺=100μm。A、B、C、D：分別表示sham、CCI、non-MC-OECs及MC-OECs。圖中箭頭表示P2X3受體陽性表達(dá)細(xì)胞，主要表達(dá)于細(xì)胞核，細(xì)胞質(zhì)及胞膜少量表達(dá)。P2X3受體陽性細(xì)胞染色從高到低依次為CCI、non-MC-OECs、MC-OECs及sham。術(shù)后20d比術(shù)后10d，MC-OECs陽性細(xì)胞染色較淡.
Fig 2 The 10th(A1-D1) and 20thdays (A2-D2) after surgery,in situ hybridization histochemistry was used to detect the expression of P2X3 receptor mRNA of rat dorsal root ganglion in each group.Bar=100μm.A,B,C,D representative sham,CCI,Non-MC-OECs and MC-OECs.Arrows in the picture indicated P2X3 receptor mRNA positive expression cells.P2X3 expressed strogly in the nucleus and weakly in cyto plasm and cell membrane.Number of P2X3 receptor positive cells was from hight to low followed by CCI,non-MC-OECs,MC-OECs and sham group.Compared with the 10thdays after surgery,MC-OECs positive cells stained lightly at the 20thdays.

表1 各組大鼠背根神經(jīng)節(jié) P2X3受體雜交陽性細(xì)胞百分比和平均吸光度Tab 1 The positive cells percentage and average absorbance of P2X3 receptor mRNA of the dorsal root ganglion in rats (n=10,

*P<0.05vssham；△P<0.05vsCCI；#P<0.05vsnon-MC-OECs

與sham組對比，其余3組P2X3受體陽性細(xì)胞百分比及平均吸光度明顯增加(P<0.05)；與CCI組對比，non-MC-OECs組和MC-OECs組陽性細(xì)胞百分比及平均吸光度明顯減低(P<0.05)；MC-OECs組與non-MC-OECs組對比P2X3受體的陽性細(xì)胞百分比及平均吸光度表達(dá)水平則更低(P<0.05)。

3 討論

3.1 P2X3受體、嗅鞘細(xì)胞與疼痛的關(guān)系

周圍神經(jīng)損傷能引起機(jī)體部分功能障礙，感覺異常及疼痛，而神經(jīng)損傷后修復(fù)能力有限[9]。神經(jīng)損傷的治療也成為難點，嗅鞘細(xì)胞能修復(fù)神經(jīng)損傷，抑制膠質(zhì)疤痕及空洞形成，促成軸突的再生，改變損傷微環(huán)境，釋放多種營養(yǎng)因子[10]。Zhu等[11]切斷大鼠坐骨神經(jīng)15mm，利用殼聚糖導(dǎo)管接種嗅鞘細(xì)胞置入坐骨神經(jīng)損傷區(qū)，發(fā)現(xiàn)嗅鞘細(xì)胞不僅能修復(fù)神經(jīng)損傷而且能減輕神經(jīng)病理性疼痛，恢復(fù)后肢部分運動及感覺功能。很多研究表明，P2X3受體與神經(jīng)病理性痛有著重要的聯(lián)系，隨著神經(jīng)損傷時間延長加重，其表達(dá)量相應(yīng)增加[12]。Lin等[13]用血管內(nèi)皮生長因子抑制劑，減少P2X3受體下調(diào)，緩解慢性病理性疼痛。

3.2 微囊化與非微囊化嗅鞘細(xì)胞移植減輕神經(jīng)損傷痛的差異

微囊化能減少移植到宿主體內(nèi)細(xì)胞免受免疫排斥反應(yīng)，增加細(xì)胞存活率，延長移植到宿主體內(nèi)細(xì)胞的存活時間，更好的發(fā)揮細(xì)胞修復(fù)神經(jīng)損傷的作用[14]。Calafiore R等[15]證明用微囊化處理的細(xì)胞，具有較好的免疫隔離效果，生物相容性，減少炎癥反應(yīng)，且在體外培養(yǎng)9周，細(xì)胞存活率能達(dá)到80%以上。本實驗通過微囊化及嗅鞘細(xì)胞的特性，建立SD大鼠坐骨神經(jīng)慢性壓迫性周圍神經(jīng)損傷動物模型，利用微囊化嗅鞘細(xì)胞與非微囊化嗅鞘細(xì)胞移植治療周圍神經(jīng)損傷，并比較兩者對周圍神經(jīng)損傷修復(fù)作用的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，相比模型組，非微囊化嗅鞘細(xì)胞移植組大鼠機(jī)械刺激縮足反射閾值增高，P2X3受體陽性細(xì)胞表達(dá)水平明顯減低，修復(fù)部分周圍神經(jīng)損傷，緩解疼痛；而與非微囊化嗅鞘細(xì)胞組對比，微囊化嗅鞘細(xì)胞組大鼠右下肢活動更加有力，拉其下肢收縮時間較快，機(jī)械刺激縮足反射閾值明顯增高，P2X3受體陽性細(xì)胞百分比及平均吸光度明顯減低，更好的降低P2X3受體表達(dá)量，減低周圍神經(jīng)損傷，恢復(fù)大鼠部分功能，緩解疼痛。本實驗結(jié)論表明：微囊化嗅鞘細(xì)胞移植比非微囊化嗅鞘細(xì)胞移植治療周圍神經(jīng)損傷效果更好，明顯降低P2X3受體表達(dá)水平，更好的緩解神經(jīng)病理性疼痛。通過本實驗研究能為日后周圍神經(jīng)損傷的治療提供一些實驗數(shù)據(jù)支持。

3.3 研究不足及展望

本次實驗表明微囊化能更好地發(fā)揮嗅鞘細(xì)胞自身的生物學(xué)特性，減低神經(jīng)損傷相關(guān)的嘌呤P2X3受體的表達(dá)水平，從而減輕疼痛。但也發(fā)現(xiàn)需要日后不斷研究待解決的問題，如微囊化嗅鞘細(xì)胞最佳移植時間移植后的不良反應(yīng)對機(jī)體有沒有較大的影響？2種或者多種細(xì)胞一起移植效果是否會優(yōu)于單種等都需日后不斷深入研究探索。本實驗可能為日后治療周圍神經(jīng)損傷提供數(shù)據(jù)支撐，也希望不久將來逐步的深入完善，為更好的治療神經(jīng)損傷及神經(jīng)病理性疼痛帶來希望。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] L Chen， Liu Y W ， K Yue,et al.Differential expression of ATP-gated P2X receptors in DRG between chronic neuropathic pain and visceralgia rat models[J].Purinergic Signal,2016,12(1)：79-87.

[2] Wang S,Xu H,Zou L,et al.LncRNA uc.48+ is involved indiabetic neuropathic pain mediated by the P2X3 receptor in the dorsal root ganglia[J].Purinergic Signal,2016,12(1)：139-148.

[3] H Peng， L Zou， J Xie,at el.lncRNA NONRATT021972 siRNA decreases diabetic neuropathic pain mediated by the P2X3 receptor in dorsal root ganglia[J].Mol Neurobiol,2017,54(1)：511-523.

[4] Heidarizadi S， Abbasi N， Asadollahi K,et al.Effect of olfactory ensheathing cells (OECs) transplantation on functional recovery in acute phase of spinal contused rats[J].Khairollah Asadollahi,2017,4(1)：30-36.

[5] Pellitteri R， Cova L， Zaccheo D,et al.Phenotypic modulation and neuroprotective effects of olfactory ensheathing cells：a promising tool for cell therapy[J].Stem Cell Rev Reports,2016,12(2)：224-234.

[6] Chen Y,Yu C,Lv G,et al.Rapid large-scale culturing of microencapsulated hepatocytes：a promising approach for cell-based hepatic support[J].Transplant Proc,201446(5)：1649-1657.

[7] HeY， Liu C， Xia X,et al.Conformal microcapsules encapsulating microcarrier-L02 cell complexes for treatment of acetaminophen-induced liver injury in rats[J].J Mater Chem B,2017,5：1962-1970.

[8] Yin J， Qiu S， Gao J,et al.FGF-2/PELA/BMP-2 microcapsule scaffold promotes osteogenic differentiation of rat periosteum-derived stem cells in vitro[J].J South Med Univer,2017,37(1)：68-74.

[9] Seixas D,Foley P,Palace J,et al.Pain in multiple sclerosis：a systematic review of neuroimaging studies[J].Neuroimage Clin,2014,5(5)：322-331.

[10] Khankan R R,Wanner I B,Phelps P E.Olfactory ensheathing cell-neurite alignment enhances neurite outgrowth in scar-like cultures[J].Exp Neurol， 2015，269(1)：93-101.

[11] Zhu S， Ge J， Wang Y， et al,A synthetic oxygen carrier-olfactory ensheathing cell composition system for the promotion of sciatic nerve regeneration[J].Biomaterials,2014,35 ：1450-1461.

[12] Wang W S,Tu W Z,Cheng R D,et al.Electroacupuncture and A-317491 depress the transmission of pain on primary afferent mediated by the P2X3 receptor in rats with chronic neuropathic pain states[J].J Neurosci Res,2014,92(12)：1703-1713.

[13] Lin J,Li G,Den X,et al.VEGF and its receptor-2 involved in neuropathic pain transmission mediated by P2X-/-receptor of primary sensory neurons[J].Brain Res Bull,2010,83(5)：284-291.

[14] Zhao H， Yang B， Liu Z,et al.Microencapsulation improves inhibitory effects of transplanted olfactory ensheathing cells on pain after sciatic nerve injury[J].Neural Regen Res,2015,10(8)：1332-1337.

[15] Calafiore R,Basta G.Clinical application of microencapsulated islets：actual prospectives on progress and challenges[J].Adv Drug Deliv Rev,2014,67-68,84-92.