王 榮 覃海媚 楊鳳蓮 韋葉生 王俊利

(右江民族醫(yī)學(xué)院,1 附屬醫(yī)院,2 檢驗科,3 生殖遺傳實驗室,百色 533000)

在2000年,Chen等[1]首次分析從牛的脊髓中獲得的NI250同源物,繼而克隆出了神經(jīng)突起生長抑制因子(neurite growth inhibitor,Nogo)基因。Nogo屬于網(wǎng)狀蛋白(reticulon protein,RTN)家族的第4 成員,即RTN4。Nogo基因受不同的轉(zhuǎn)錄方式可翻譯成3種蛋白異構(gòu)體,包括Nogo-A、Nogo-B及Nogo-C。研究顯示Nogo基因多態(tài)性和多種腫瘤等疾病密切相關(guān)。關(guān)于Nogo基因rs2968795G/A位點和rs10496040A/C位點遺傳多態(tài)性的研究,尚未見報道。但是,不同遺傳背景的人群對疾病的易感性表現(xiàn)不同。故本研究建立SNaPshot法和DNA測序技術(shù)檢測這兩個位點的基因型,并分析其多態(tài)性在不同人群中的差異。這不僅能豐富人類Nogo基因rs2968795G/A和rs10496040A/C的遺傳多態(tài)性資料,也可為深入探討同一疾病在不同人群中的易感性差異提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取本院體檢中心323例無血緣關(guān)系的體檢者,包括181例男性與142例女性,年齡17～76歲。臨床檢查及實驗室指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)。所有的研究對象均來自廣西地區(qū)。研究方案在本院倫理委員會批準(zhǔn)后進行,研究對象均簽署知情同意書。

1.2 樣本DNA制備

用EDTA-K2抗凝采血管采集上述研究對象的靜脈血3ml,在4℃條件保存。采集標(biāo)本48h內(nèi),取200μl標(biāo)本按照血液基因組DNA提取試劑盒(北京天根生物科技公司)進行DNA提取,-20℃保存待用。

1.3 引物合成

參考NCBI數(shù)據(jù)庫中Nogo基因rs2968795G/A和rs10496040A/C的堿基序列,運用Primer 3.0在線引物設(shè)計軟件(http：//primer3.ut.ee/)設(shè)計所需特異性引物,由上海生工公司合成。rs2968795G/A位點的上游引物：5-CAGTCTGGTGGCAGAGTATGCTAAA GA-3,下游引物：5-GACAGGATTGTGCTCTCTCAC ACAA-3,延伸引物：5-CAGTCTGGTGGCAGAGTA TGCTAAAGA-3;rs10496040A/C位點上游引物：5-TGCATATCAC AGAGCAAATTCATACCA-3,下游引物：5-AGTGAATACAGTGTACCTTTTGAGA GC-3,延伸引物：5-AGTGAATACAGTGTACCTTT TGAGAGC-3。

1.4 基因型檢測

PCR反應(yīng)體系為20μl,包括：1.0μl DNA、1×GC buffer I (Takara Inc.)、2.5mmol/L Mg2+、0.2mmol/L dNTP,0.2μmol/L 上、下游引物、1U HotStarTaq聚合酶 (Qiagen Inc.)。PCR反應(yīng)程序：95℃ 2min,94℃ 20s,65℃ 30s,72℃ 1min,循環(huán)11次。94℃ 20s,59℃ 30s,72℃ 1min,循環(huán)24次。PCR產(chǎn)物經(jīng)SAP酶和EXOI酶純化后繼續(xù)延伸反應(yīng)。SAP酶純化延伸產(chǎn)物后在ABI3730XL測序儀上樣,用Polyphred軟件分析結(jié)果。采用DNA測序法證明分型結(jié)果。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

采用基因直接計數(shù)法計數(shù)基因型及等位基因頻率。哈迪-溫伯格(Hardy-Weinberg)定律檢驗樣本人群是否有代表性。用χ2檢驗或Fisher精確檢驗比較各組基因多態(tài)性分布差異,運用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件處理數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 rs2968795G/A和rs10496040A/C基因分型

rs2968795G/A和rs10496040A/C基因型分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(P=0.342;P=0.466,P>0.05),表明樣本人群有代表性。rs2968795G/A和rs10496040A/C的擴增長度分別為313bp、567bp。分型結(jié)果顯示,rs2968795G/A位點存在GG、GA、AA3種基因型,頻率分別為18.9%,46.1%,35.0%;rs10496040A/C位點存在AA、AC、CC3種基因型,頻率分別為1.2%,16.4%,82.4%。DNA測序結(jié)果和基因分型相符合(圖1)。

圖1 Nogo基因rs2968795G/A和rs10496040A/C測序圖Fig 1 Sequencing map of genotype for Nogo gene rs2968795G/A and rs10496040A/C polymorphismA：The inverted triangles of panels ①-③ indicated GG,GA and AA genotypes of Nogo gene rs2968795G/A,respectively；B：The inverted triangles of panels ①-③ indicated AA,AC and CC genotypes of Nogo gene rs10496040A/C,respectively

2.2 廣西人群中2位點的基因多態(tài)性分布

rs2968795G/A位點GG、GA、AA基因型及G、A等位基因頻率分布在男女兩組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。rs10496040A/C位點AA、AC、CC基因型及A、C等位基因頻率分布在男女兩組間比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

表1 廣西人群Nogo基因rs2968795G/A和rs10496040A/C基因型及等位基因頻率分布(%)Tab 1 Distribution of genotype and allele frequencies of Nogo geners2968795G/A and rs10496040A/C in Guangxi population (%)

2.3 2位點多態(tài)性與其他種群的基因多態(tài)性比較

廣西人群rs2968795G/A位點基因型和等位基因分布頻率與歐洲人及非洲人相比,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與北京人和日本人相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05);廣西人群rs10496040A/C位點基因型及等位基因分布頻率與歐洲、非洲和日本人之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),與北京人相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(表2、3)。

表2 Nogo基因rs2968795G/A位點基因型及等位基因頻率在不同人群間的比較Tab 2 Comparison of the frequency of Nogo gene rs2968795G/A polymorphism in different ethic and regional groups

表3 Nogo基因rs10496040A/C位點基因型及等位基因頻率在不同人群間的比較Tab 3 Comparison of the frequency of Nogo gene rs10496040A/C polymorphism in different ethic and regional groups

3 討論

Nogo基因定位于人類第2號染色體上(2p13-14),長度約75kb,含有14個外顯子(長度為47～2400bp)和8個內(nèi)含子(長度為19bp～37kb)[2]。Nogo基因的轉(zhuǎn)錄受2種啟動子調(diào)控,其中啟動子1負(fù)責(zé)啟動Nogo-A/B的轉(zhuǎn)錄,啟動子2負(fù)責(zé)Nogo-C的轉(zhuǎn)錄。其中Nogo-A在抑制中樞神經(jīng)軸突再生和參與腫瘤細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要的作用。Nogo-B在中樞神經(jīng)系統(tǒng)及外周組織均有表達(dá),涉及腫瘤細(xì)胞凋亡、組織損傷修復(fù)和血管內(nèi)皮再生等病理生理過程。而Nogo-C主要在骨骼肌中表達(dá),在腦、心、肝和脂肪組織也有部分表達(dá),但具體功能尚不十分明確[3-4]。Teng等[5]在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的凋亡實驗中研究表明,Nogo-A蛋白可抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的凋亡,在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞生長過程中起促進作用。Zhang等[6]研究顯示rs34917480CAA插入/缺失多態(tài)性和子宮肌瘤有相關(guān)性,其純合子增加子宮肌瘤的患病風(fēng)險。Shi等[7]報道rs71682890缺失型純合子降低了宮頸鱗狀細(xì)胞癌的患病風(fēng)險。袁微等[8]研究顯示,rs1012603C/T位點的多態(tài)性和缺血性腦卒中相關(guān),T等位基因可能是缺血性腦卒中的易感基因。因此,分析和闡明Nogo基因多態(tài)性在不同人群中的分布特征,可為深入研究不同人群中Nogo基因多態(tài)性與疾病的發(fā)生發(fā)展間的關(guān)系提供分子遺傳學(xué)理論基礎(chǔ)。

單核苷酸多態(tài)性是指在基因組DNA序列中由單個核苷酸改變而引起的多態(tài)性,是可遺傳變異中最常見的一種,占所有已知多態(tài)性的90%以上。不同遺傳背景的人群的基因多態(tài)性呈現(xiàn)不同的差異,這使得許多學(xué)者熱衷于探索群體遺傳的多態(tài)性分布[9-10]。本研究結(jié)果表明,廣西人群Nogo基因rs2968795G/A位點和rs10496040A/C位點的基因型和等位基因頻率在不同性別間比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義,表明廣西人群中的這兩個位點的多態(tài)性可能和性別無相關(guān)性。進一步將兩位點的多態(tài)性結(jié)果與HapMap公布的不同人群比較,顯示廣西人群rs2968795G/A的基因型及等位基因頻率與歐洲人和非洲人間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義,而與北京人和日本人比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。廣西人群rs7575107G/T位點基因型及等位基因分布頻率與歐洲、非洲和日本人之間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),與北京人相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。引起這種差異可能原因是廣西地處我國南方邊界,環(huán)境相對外界封閉,有獨特的地貌和生活習(xí)慣[11]?？傊?rs2968795G/A位點和rs10496040A/C位點多態(tài)性在不同人群中分布呈不同程度的差異。rs2919126C/T和rs7575107G/T位于Nogo基因的內(nèi)含子區(qū),內(nèi)含子的基因突變可以影響基因的轉(zhuǎn)錄效率,進一步影響蛋白的表達(dá),從而參與疾病的發(fā)生發(fā)展過程[12]。這種差異可能影響一些相關(guān)疾病在不同人群間所反映出不同發(fā)病率及臨床表現(xiàn)。

近年來,隨著分子生物學(xué)技術(shù)的進步,人們發(fā)現(xiàn)不同的遺傳背景表現(xiàn)出對疾病的易感性和預(yù)后質(zhì)量呈現(xiàn)出不同差異,這也使得更多學(xué)者開始研究基因多態(tài)性和疾病間的密切關(guān)系。本研究首次開展對廣西人群Nogo基因rs2968795G/A位點和rs10496040A/C位點多態(tài)性的研究,同時并和不同人群進行比較。為其與相關(guān)疾病的研究奠定了基因水平上的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。選取的研究對象來自廣西地區(qū),多態(tài)性的結(jié)果具有一定的區(qū)域代表性。此外,由于通婚的普遍性,很難明確到研究對象的具體民族。今后,將深入探討Nogo基因的單核苷酸多態(tài)性和疾病的關(guān)系。

參 考 文 獻(xiàn)

[1] Chen M S,Huber A B,van der Haar M E,et al.Nogo-A is a myelin-associated neurite outgrowth inhibitor and an antigen for monoclonal antibody IN-1[J].Nature,2000,403(6768)：434-439.

[2] Liu G M,Luo Y G,Li J,et al.Knockdown of Nogo gene by short hairpin RNA interference promotes functional recovery of spinal cord injury in a rat model[J].Mol Med Rep,2016,13(5)：4431-4436.

[3] Schmandke A,Schmandke A,Schwab M E.Nogo-A：multiple roles in CNS development,maintenance,and disease[J].Neuroscientist,2014,20(4)：372-386.

[4] Xu W J,Shen G Q,Li Q.Biological function of Nogo-B[J].Sheng Li Xue Bao,2013,65(4)：445-450.

[5] Teng F Y,Tang B L.Nogo/RTN4 isoforms and RTN3 expression protect SH-SY5Y cells against multiple death insults[J].Mol Cell Biochem,2013,384(1-2)：7-19.

[6] Zhang K,Bai P,Shi S,et al.Association of genetic variations in RTN4 3′-UTR with risk of uterine leiomyomas[J].Pathol Oncol Res,2013,19(3)：475-479.

[7] Shi S,Zhou B,Wang Y,et al.Genetic variation in RTN4 3′-UTR and susceptibility to cervical squamous cell carcinoma[J].DNA Cell Biol,2012,31(6)：1088-1094.

[8] 袁微,王耀輝,蒙蘭青,等.神經(jīng)突起生長抑制因子A基因多態(tài)性與缺血性腦卒中患者遺傳易感性的研究[J].中華老年心腦血管病雜志,2014,16(7)：682-685.

[9] 李文娜,李克研,宋慧娟,等.西藏藏族人群白細(xì)胞介素1β基因-511C/T多態(tài)性[J].解剖學(xué)雜志,2014,37(1)：92-94.

[10] 盛優(yōu)靜,余冰,耿芝,等.性激素結(jié)合球蛋白基因單核苷酸多態(tài)性在寧夏回、漢族人群中的分布特征[J].解剖學(xué)雜志,2016,39 (1)：86-90.

[11] 梁燕冰,彭丁偉,黃雨晴,等.廣西人群EPCR基因3′-非編碼區(qū)rs9574 C/G位點的多態(tài)性[J].臨床與實驗病理學(xué)雜志,2017,33(3)：249-252.

[12] Jo B S,Choi S S.Introns：the functional benefits of introns in genomes[J].Genomics Inform,2015,13(4)：112-118.

(編輯: 劉 芳)