陳章祥，吳 波，朱 敏，李 莉，王取南，朱德發(fā)

甲狀腺功能減退癥(簡稱甲減)可引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能異常[1]，甲減患者常存在工作記憶、學習能力損傷[2]，過去研究多基于海馬和額葉。甲減的功能影像學顯示扣帶回等邊緣系統(tǒng)在學習、記憶功能中有重要作用[1]。后扣帶回(posterior cingulate cortex，PCC)是邊緣系統(tǒng)的重要組成部分，是監(jiān)控感覺及記憶的組織。有研究[3]顯示輕度認知障礙的阿爾茲海默癥患者即可出現(xiàn)后扣帶回損傷，本研究通過神經(jīng)元的尼氏體和可溶性NSF附著蛋白受體(soluble nethylmaleimidesensitive fusion protein attachment protein receptors,SNARE)復合體中的SNAP-25表達來觀察后扣帶回改變。尼氏體是神經(jīng)元的特征性結(jié)構(gòu)之一，主要合成細胞器更新所需蛋白、合成遞質(zhì)所需的酶等。突觸相關(guān)蛋白25(synaptosomal associated protein25,SNAP-25)是SNARE復合體的重要組成部分，通過影響突觸小泡的胞吐外排和遞質(zhì)釋放改變突觸信號強度[4]，在學習記憶中有重要意義。多奈哌齊(donepezil)是選擇性乙酰膽堿酯酶抑制劑，能夠提高腦部乙酰膽堿功能，有效改善認知功能障礙，也有研究[5]顯示其對神經(jīng)元有直接保護作用。該研究旨在觀察甲減大鼠 PCC內(nèi)SNAP-25蛋白和尼氏體的表達情況，觀察L-T4聯(lián)合多奈哌齊治療效果。

1 材料與方法

1.1實驗動物清潔級健康SD雄性大鼠(10周齡)40只，240～270 g，購自安徽醫(yī)科大學實驗動物中心。溫度21～23 ℃，濕度(55±5)%，自由飲水，標準飼料喂養(yǎng)。實驗過程遵循《安徽醫(yī)科大學實驗用動物管理和使用指南》。

1.2主要試劑及儀器

1.2.1試劑 丙硫氧嘧啶(propylthiouracil，PTU)(上海朝暉藥業(yè)有限公司)；左甲狀腺鈉(levothyroxine，L-T4)(德國默克雅柏藥業(yè)有限公司)；鹽酸多奈哌齊(donepezil)(日本衛(wèi)材藥業(yè)有限公司)；三碘甲狀腺原氨酸(triiodothyronine，T3)、四碘甲狀腺原氨酸(tetraiodothyronine,T4)、促甲狀腺激素(thyroid-stimulating hormone,TSH)放射免疫試劑盒(北京北方生物技術(shù)研究所)；尼氏染色液(上海碧云天生物技術(shù)研究所)；兔來源抗SNAP-25抗體、抗GAPDH單克隆抗體(美國Abcam公司)；DAB染色試劑盒、 辣根過氧化物酶(HPR)標記山羊抗兔IgG抗體(美國Abclonal公司)。

1.2.2儀器 Microfuge 20R臺式微量離心機(美國貝克曼庫爾商貿(mào)有限公司)；Synergy4多功能酶標儀(美國伯騰儀器有限公司)；GZX-9140MBE電熱恒溫鼓風干燥箱(上海博訊寶業(yè)有限公司)；WD-9405B型脫色搖床(濟南科賽特科技有限公司)；DP71光學顯微鏡(日本奧林巴斯株式會社)；Fine-do X6化學發(fā)光成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)。

1.3動物模型制備適應性喂養(yǎng)1周后，采用隨機數(shù)表法將大鼠隨機均分為5組： 正常對照組(CON組)、甲減組(Hypo組)、L-T4替代治療組(L-T4組)、多奈哌齊治療組(DON組)、聯(lián)合治療組(L-T4+DON組)每組8只。CON組正常飲水，其余4組給予0.05%PTU喂養(yǎng)6周制備甲減模型。造模第5周起，DON組于飲水中加入0.005%多奈哌齊，L-T4組每日給予腹腔注射L-T4(溶于生理鹽水，6 μg/100 g體質(zhì)量)，L-T4+DON組飲用水加入0.005%多奈哌齊以及腹腔注射L-T4。余下3組每日腹腔注射等量生理鹽水。各組大鼠每周稱重，治療共2周，期間根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整給藥劑量。

1.4標本制備10%水合氯醛(0.3 ml/100 g體質(zhì)量)腹腔注射麻醉大鼠后，打開腹腔，腹主動脈采血。取血后立即斷頭處死大鼠，于冰臺迅速分離大腦后扣帶回組織，左側(cè)后扣帶回置于-80 ℃冰箱儲存，用于Western blot檢測；右側(cè)后扣帶回浸泡于4%多聚甲醛溶液，固定待做尼氏染色、免疫組化染色。

1.5血清甲狀腺激素水平測定放射免疫法測定大鼠血清T3、T4、TSH水平，嚴格按照放射免疫試劑盒操作說明進行。

1.6尼氏染色大鼠后扣帶回蠟片置于60 ℃烤箱30 min，二甲苯脫蠟3次，每次8 min，梯度乙醇水化；三蒸水洗滌3次，每次2 min；尼氏染色液染色1 h(37 ℃)，三蒸水沖去染液；95%乙醇分化3 s，常規(guī)脫水、透明、封片；光學顯微鏡拍攝；圖像分析軟件分析染色物光密度值，取平均光密度(average optical density,AOD)值。

1.7免疫組織化學染色大鼠后扣帶回蠟片置于60 ℃烤箱30 min，二甲苯脫蠟3次，每次10 min，梯度乙醇水化；TritonX-100細胞通透，30%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；檸檬酸鹽微波爐加熱暴露抗原決定簇；山羊血清封閉；以上各步驟間使用PBS洗滌3次，每次3 min。SNAP-25抗體(1 ∶200)室溫孵育1 h后孵育過夜(4 ℃)；HRP標記山羊抗兔IgG孵育30 min(37 ℃)；以上各步驟間使用PBS洗滌5次，每次5 min；DAB顯色，常規(guī)脫水、透明、封片；應用光學顯微鏡拍攝；圖像分析軟件分析免疫反應產(chǎn)物的光密度值，取AOD值。

1.8Westernblot法檢測SNAP-25

1.8.1總蛋白提取 取后扣帶回組織置于玻璃勻漿器中，加入RIPA裂解液500 μl和蛋白酶抑制劑5 μl，冰上勻漿70～75次。4 ℃、15 000 r/min離心15 min，吸取上清液后4 ℃、15 000 r/min離心5 min，吸取上清液，用Lorry法測定總蛋白濃度。使用2×上樣緩沖液稀釋定量，100 ℃、10 min蛋白變性，分裝保存。

1.8.2Western blot法檢測 制備SDS-PAGE凝膠，各組分別取蛋白樣本20 μg進行電泳；聚偏二氟乙烯(PVDF)膜轉(zhuǎn)膜3 h；5%脫脂奶粉封閉1 h 30 min，三蒸水洗滌3次，每次7 min；加入一抗SNAP-25(1 ∶5 000)或GAPDH(1 ∶10 000)孵育過夜(4 ℃)。PBST洗膜3次，每次10 min，PBS洗滌10 min；加入HPR室溫孵育1 h 30 min，PBST洗膜3次，每次10 min，PBS洗滌10 min；滴加ECL發(fā)光液，使用化學發(fā)光成像儀拍攝蛋白條帶； Image pro plus圖像分析軟件進行光密度分析，計算目的蛋白與內(nèi)參對照GAPDH的光密度比值。

2 結(jié)果

2.1大鼠血清甲狀腺激素水平Hypo組、DON組T3、T4濃度較CON組顯著降低，TSH水平較CON組顯著升高(P<0.01)；L-T4組和L-T4+DON組T3、T4和TSH恢復正常，與CON組比較差異無統(tǒng)計學意義。見表1。

2.2尼氏染色對各組大鼠后扣帶回尼氏染色切片進行光密度值分析，Hypo組較CON組AOD值減少 (P<0.05)，神經(jīng)元內(nèi)尼氏體數(shù)量減少；DON組較Hypo組AOD值增加(P<0.05)，未恢復至CON組水平(P<0.05)；L-T4組較Hypo組AOD值增加(P<0.05)，未恢復至CON組水平(P<0.05)；L-T4+DON組與CON組比較差異無統(tǒng)計學意義，尼氏體數(shù)量恢復。見圖1、表2。

表1 各組大鼠血清甲狀腺素水平

圖1 各組后扣帶回尼氏染色圖片 SP×400

項目CON組Hypo組DON組L-T4組L-T4+DON組F值尼氏染色0.0554±0.00810.0326±0.0033*0.0414±0.0041*#0.0385±0.0042*#0.0547±0.007628.24免疫組化染色0.153±0.0140.223±0.026*0.213±0.029*0.187±0.027*#0.159±0.01916.90

與CON組比較：*P<0.05；與Hypo組比較：#P<0.05

圖2 各組后扣帶回SNAP-25免疫組化染色圖片 SP×200

2.3免疫組化結(jié)果光鏡下可見后扣帶回內(nèi)SNAP-25免疫復合物呈棕黃色顆粒，Hypo組SNAP-25的AOD值高于CON組(P<0.05)；DON組SNAP-25的AOD值較Hypo組差異無統(tǒng)計學意義，L-T4組SNAP-25的AOD值較Hypo組有下降(P<0.05)，未恢復至CON組水平(P<0.05)；L-T4+DON組SNAP-25的AOD值與CON組比較差異無統(tǒng)計學意義。見圖2、表2。

2.4Westernblot結(jié)果Hypo組大鼠PCC內(nèi)SNAP-25表達較CON組顯著增加(P<0.05)，L-T4組，DON組損傷蛋白未恢復至正常水平(P<0.05)，L-T4+DON組SNAP-25表達恢復，與CON組比較差異無統(tǒng)計學意義。見圖3。

圖3 各組大鼠后扣帶回SNAP-25的表達

3 討論

尼氏體是神經(jīng)元的特征性結(jié)構(gòu)，主要分布于神經(jīng)元胞體和樹突內(nèi)。當神經(jīng)元受損，尼氏體將逐漸崩解，甚至消失，這種變化具有可逆性。本研究顯示Hypo組大鼠尼氏體相較CON組數(shù)量減少，這種減少在甲減大鼠的海馬中也有發(fā)現(xiàn)[6]，這提示神經(jīng)元遞質(zhì)合成受到影響。SNAP-25是SNARE復合體組成部分，其在突觸膜融合過程中起重要作用，也可以影響SNARE復合體形成過程，進而影響遞質(zhì)釋放。免疫組化法和Western blot法顯示在Hypo組大鼠PCC內(nèi)SNAP-25表達較CON組增高。既往有研究[7]顯示甲減大鼠海馬內(nèi)SNAP-25表達增高，在成年期甲減大鼠額葉也表達增高[8]；小腦內(nèi)SNAP-25表達水平未受影響[9]，差異原因尚不明確。有研究[10]顯示SNAP-25增多可能與甲減時裂解SNAP-25的鈣蛋白酶減少有關(guān)。另一研究[11]表明SNAP-25改變可能與SNARE復合體相關(guān)的突觸結(jié)合蛋白(syt-1)有關(guān)。

L-T4替代治療是目前治療甲減的標準方案，目標是使T3、T4、TSH恢復至正常水平。本試驗給予L-T4替代治療2周后，L-T4組大鼠血清甲狀腺素水平與CON組比較差異無統(tǒng)計學意義；尼氏染色顯示L-T4組大鼠PCC內(nèi)尼氏體較Hypo組數(shù)量增加，未能恢復至CON組水平。免疫組化顯示L-T4組大鼠PCC內(nèi)SNAP-25蛋白表達水平較Hypo組下降，未恢復至CON組水平。這提示L-T4替代治療2周后，甲減大鼠PCC內(nèi)尼氏體數(shù)量和SNAP-25蛋白表達均未能恢復至正常水平。Quintanar et al[12]給予T4替代治療20 d后，甲減大鼠垂體的SNAP-25表達未恢復正常。也有研究[13]顯示給予大劑量L-T4(20 μg/100 g體質(zhì)量)替代治療2周，額葉內(nèi)SNAP-25能夠有效恢復，甲狀腺素可能是通過與甲狀腺素受體結(jié)合發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[9]，大劑量L-T4替代治療能夠充分與甲狀腺素受體結(jié)合發(fā)揮作用；但其血清甲狀腺素顯著高于正常對照組，存在甲亢的風險。

本研究嘗試尋找完全修復甲減導致的PCC尼氏體和SNAP-25表達損傷的可能性。多奈哌齊是一種膽堿酯酶抑制劑，廣泛應用于阿爾茲海默癥的臨床治療。實驗研究[5]表明其具有神經(jīng)保護作用，本實驗嘗試給予多奈哌齊單獨治療，尼氏染色顯示DON組大鼠PCC內(nèi)尼氏體較Hypo組數(shù)量增加，提示多奈哌齊能夠在甲減大鼠中發(fā)揮神經(jīng)保護作用。本實驗嘗試給予L-T4+DON組大鼠L-T4聯(lián)合DON治療后，PCC尼氏體AOD值與CON組比較差異無統(tǒng)計學意義,尼氏體數(shù)量恢復；PCC內(nèi)SNAP-25表達水平與CON組比較差異無統(tǒng)計學意義。多奈哌齊能夠增強神經(jīng)再生[14]，有研究[15]表明多奈哌齊能夠顯著減少炎癥因子分泌和表達。提示L-T4+DON組大鼠PCC尼氏體數(shù)量和SNAP-25表達恢復可能與多奈哌齊的神經(jīng)保護及炎癥抑制作用有關(guān)。

綜上所述，甲減可引起后扣帶回內(nèi)SNAP-25表達增高和尼氏體損傷，L-T4替代治療和多奈哌齊單獨治療均未能使后扣帶回SNAP-25表達和尼氏體損傷完全恢復,L-T4聯(lián)合多奈哌齊治療能夠使后扣帶回SNAP-25表達和尼氏體損傷恢復至正常水平。提示L-T4與多奈哌齊聯(lián)合治療有利于修復甲減引起的后扣帶回SNAP-25表達異常和尼氏體損傷。

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