李仁斌 余光書 林焱斌

脊髓損傷 (spinal cord injury，SCI) 是嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，損傷后原有的血－脊髓屏障破壞，血管基膜裂解，微血管損傷，產(chǎn)生出血、水腫、炎癥等病變，損傷患者多伴有下肢感覺和運動功能減退或消失[1-3]。目前，SCI 尚未有理想的治療方法?；|(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子 (tissue inhibitor of metalloproteinase 2，TIMP-2) 作為一種內(nèi)源性的酶類能夠抑制細胞外基質(zhì) (extracellular matrix，ECM)的降解從而維持組織內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[4]，故對 SCI 后組織修復(fù)所需環(huán)境的調(diào)控至關(guān)重要。I 型膠原蛋白(Collagen I) 主要來自哺乳動物成纖維細胞、軟骨細胞等。研究表明[5]，Collagen I 在損傷后傷口愈合，

血管重建中發(fā)揮重要作用；IV 型膠原蛋白 (Collagen IV) 由血管內(nèi)皮細胞分泌，在正常的神經(jīng)系統(tǒng)中，存在于腦脊液和微血管周圍，起組織連接作用[6-7]。

研究表明[8]，SCI 后 TIMP-2、Collagen I 和 Collagen IV 在某個時間內(nèi)的表達持續(xù)升高，有利于損傷處血管的構(gòu)建，基膜的重塑及軸突的生長，對 SCI 后肢體運動功能的恢復(fù)起重要作用。但三者在 SCI 后表達的變化趨勢尚不清楚。本研究旨在觀察大鼠 SCI后 TIMP-2、Collagen I 和 Collagen IV 的表達情況，探討 TIMP-2，Collagen I 和 Collagen IV 對 SCI 模型大鼠肢體運動功能恢復(fù)所起的作用。

材料和方法

一、實驗材料

1. 實驗動物：60 只體重為 (220±20) g 的健康成年雌性 SD 大鼠，購于上海斯萊克實驗動物責(zé)任有限公司，許可證號碼為 SCXK (滬) 2014-006，飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心 SPF 級實驗室。本研究符合福建中藥大學(xué)動物實驗倫理委員會要求。

2. 實驗試劑：(1) 一抗：兔抗鼠 TIMP-2 抗體(Abcam，美國)、兔抗鼠 Collagen I 抗體 (Abcam，美國)、兔抗鼠 Collagen IV 抗體 (Abcam，美國)；(2) 二抗：山羊抗兔 Alexa flour488 熒光二抗(Thermo Fisher，美國)；(3) 尼氏染色試劑盒 (索萊寶、北京)、免疫組化試劑盒 (邁新，福州)。

3. 實驗儀器：NYU 脊髓打擊器 (W. M. Keck 神經(jīng)科學(xué)協(xié)作中心，美國)、顯微鏡 (Leica DMI 4000B /DFC425C，德國)、Image-lab 圖像分析系統(tǒng)、Image-Pro 圖像分析系統(tǒng) (BIORADHERCULES，美國)。

二、實驗方法

1. 動物分組和造模：采用隨機數(shù)表法將 60 只SD 大鼠隨機分為假手術(shù)組、術(shù)后 3 天組、術(shù)后5 天組、術(shù)后 7 天組和術(shù)后 9 天組，每組 12 只。假手術(shù)組僅行椎板切除術(shù)，不損傷脊髓。其余各組均使用 NYU 脊髓打擊器建立 SCI 模型[9]。大鼠麻醉成功后，取 T9～11區(qū)域進行脫毛，局部皮膚消毒，沿脊柱縱軸作一長約 2～3 cm 切口，依次切開皮膚、皮下組織、肌肉、筋膜，鈍性剝離附著于棘突兩側(cè)的肌肉，暴露 T9～11椎骨棘突和椎板，咬除棘突和椎板，暴露 T10部位白色脊髓硬脊膜，將大鼠固定于NYU 打擊器固定臺，調(diào)整打擊桿，使其瞄準(zhǔn) T10脊髓正中，調(diào)整打擊桿高度為 12.5 mm，釋放打擊桿，使其自由下落撞擊脊髓，出現(xiàn)大鼠尾部劇烈擺動，頭部肌肉瞬間收縮，術(shù)后出現(xiàn)雙下肢完全癱瘓，提示造模成功。造模成功后，生理鹽水沖洗傷口后逐層縫合。術(shù)后每天早晚人工按摩膀胱和下腹以助大鼠排便排尿，每天進行青霉素 4 萬單位 / 只前肢注射，連續(xù) 3 天，預(yù)防感染。

2. 行為學(xué)評分：本實驗采用 BBB 肢體運動功能評分[10]評估假手術(shù)組大鼠和術(shù)后 9 天組大鼠肢體運動功能。由 2 名非本實驗工作人員且熟練掌握 BBB評分標(biāo)準(zhǔn)的專業(yè)人員于造模后 1 天、3 天、5 天、7 天、9 天對每只大鼠獨立進行 BBB 肢體運動功能評分，每只大鼠評分 2 次，且每次觀察時間 ≥3 min。最終取平均評分。

3. 取材方法：水合氯醛麻醉成功后，將每組中的 6 只大鼠腹腔剪開，取血，止血鉗夾住腹主動脈，打開胸腔，暴露心臟，然后于右心房、左心耳處各剪一小口，自左心尖部注入 150 ml 生理鹽水快速沖洗，然后緩慢注入 150 ml 的 4% 多聚甲醛進行灌注固定，待大鼠肢體僵硬后以脊髓損傷處為中心，取長約 2 cm 脊髓段，置于 4% 多聚甲醛，4 ℃固定 48 h。每組剩余 6 只大鼠麻醉成功后，迅速以脊髓損傷處為中心，取長約 2 cm 脊髓段，放置于EP 管中，迅速放入液氮速凍，-80 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

4. 檢測方法：(1) 尼式染色：將厚度 5 μm 的石蠟切片常規(guī)脫蠟入水后放入尼氏染色液，置于 60 ℃溫箱中浸染 50 min，蒸餾水迅速沖洗 3 遍，再用分色液分色 1～2 min (具體時間根據(jù)分色情況而定)，晾干，中性樹膠封片，鏡下觀察，采集圖片。(2)免疫組化染色：采用免疫組化試劑盒染色，具體步驟如下：酒精梯度脫蠟，純水漂洗 1 min，微波枸櫞酸鈉抗原修復(fù)，放置常溫中冷卻至室溫。PBS 漂洗3 次，每次 3 min。洗去 PBS，加入過氧化物酶阻斷劑室溫下孵育 10 min，PBS 洗 3 次，每次 3 min，除去 PBS，加入非免疫動物血清封閉 10 min，不洗，加入一抗 4 ℃ 孵育過夜。次日常溫下復(fù)溫 30 min，PBS 漂洗 3 次，每次 3 min，加入二抗室溫孵育10 min，除去 PBS，加入鏈霉菌抗生物素－過氧化物酶溶液，室溫下孵育 10 min，除去 PBS 液，DAB顯色，顯色時間根據(jù)光學(xué)顯微鏡下觀察而定，自來水終止顯色，蘇木素復(fù)染 1 min，自來水返藍 30 s，梯度酒精脫水干燥，二甲苯透明，中性樹脂透明封片。在光學(xué)顯微鏡下用低倍鏡先定位，再用高倍鏡觀察。每個指標(biāo)每個區(qū)域選擇 6 個不重疊視野進行統(tǒng)計。(3) Western blot 檢測：取 1 cm 脊髓剪碎，加裂解液，冰浴 60 min。14 000 g 離心 10 min，BCA法定量蛋白。各孔加入 200 μl BCA 工作液，于 37 ℃烤箱中放置 30 min。在酶標(biāo)儀中測得標(biāo)準(zhǔn)曲線和吸光度，通過其算出蛋白濃度。蛋白變性后，將樣品于相應(yīng)濃度的 SDS-PAGE 凝膠電泳分離，待 Marker蛋白跑至玻璃板底部且樣本蛋白基本呈一條直線沉于底部，則停止跑膠。轉(zhuǎn)至 PVDF 膜封閉，TPBS 洗3 次。封閉液封閉 1.5 h，先后加入一抗二抗，每次步驟間隔均用 TBST 漂洗。用 TBST 清洗去除二抗后開始顯影。將膜置于化學(xué)發(fā)光試劑中反應(yīng) 1 min，在避光條件下顯影，凝膠掃描成像系統(tǒng)進行分析。分別采用 TIMP-2、Collagen I 和 Collagen IV 與 β-actin的吸光度比值表示蛋白的相對表達量。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

采用 SPSS 20.0 軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，實驗數(shù)據(jù)采用± s 表示，符合正態(tài)分布的用t檢驗或單因素方差分析，非正態(tài)分布資料用秩和檢驗。BBB 評分不符合正態(tài)分布，采用秩和檢驗；免疫組化和 Western blot 檢驗符合正態(tài)分布，采用單因素方差分析進行比較。

結(jié) 果

一、BBB 肢體運動功能評分

與假手術(shù)組相比，術(shù)后 9 天組 BBB 肢體運動功能評分顯著下降。隨著損傷后時間的推移，術(shù)后 9 天組的 BBB 肢體運動功能評分逐漸升高，與術(shù)后 1 天相比，術(shù)后 7 天和術(shù)后 9 天的大鼠肢體 BBB 運動功能評分升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05) (表1)。

表1 術(shù)后 BBB 評分 (± s)Tab.1 BBB score after surgery (± s)

表1 術(shù)后 BBB 評分 (± s)Tab.1 BBB score after surgery (± s)

注：與術(shù)后 1 天組相比，aP＜0.01Notice: Compared with the scores 1 day postoperatively, aP < 0.01

組別 n 術(shù)后 1 天 術(shù)后 3 天 術(shù)后 5 天 術(shù)后 7 天 術(shù)后 9 天假手術(shù)組 12 19.50±0.32 19.84±0.21 20.23±0.26 21.00±0.00 21.00±0.00術(shù)后 9 天組 12 0.58±0.15 0.83±0.21a 2.33±0.31a 4.42±0.38a 10.08±0.50a F 值 0.31 6.56 9.58 13.95 P 值 0.58 0.18 0.01 0.001

二、尼式染色

假手術(shù)組神經(jīng)細胞結(jié)構(gòu)完整、形態(tài)規(guī)則，呈飽滿的梭形狀，胞質(zhì)內(nèi)可見清晰的虎斑樣尼氏體，尼氏體飽滿，細胞核明顯；SCI 各組神經(jīng)細胞損傷嚴(yán)重，局部可見瘀血斑塊，細胞水腫或碎裂，無細胞核，尼氏體萎縮或較小，神經(jīng)細胞周圍可見空泡樣變，術(shù)后 9 天神經(jīng)細胞形態(tài)有所改善，尼氏體較飽滿，細胞水腫減輕 (圖1)。

三、免疫組化染色

免疫組化結(jié)果發(fā)現(xiàn)假手術(shù)組未見明顯的 TIMP-2、Collagen I 和 Collagen IV 表達。SCI 后 3 天即出現(xiàn) TIMP-2、Collagen I 和 Collagen IV 的表達且表達量逐漸上升。TIMP-2 表達部位主要在神經(jīng)元、膠質(zhì)細胞、單核細胞；Collagen I 和 Collagen IV 彌散性表達于脊髓實質(zhì)的基質(zhì)成分中。SCI 各組的 TIMP-2 表達均高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05)；SCI 后 5 天 TIMP-2 表達最高，與其它時間點相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05)；SCI 各組的 Collagen I和 Collagen IV 表達均高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05)；SCI 后 7 天 Collagen I 和 Collagen IV的表達最高，與其它時間點相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05) (表2，圖2、3)。

四、Western blot

圖1 尼氏染色觀察各組脊髓神經(jīng)元形態(tài) (× 200) (注：黑色箭頭所示為尼氏體，紅色箭頭所示為瘀血)Fig.1 Observation of spinal neuron morphology in each group by Nissl staining (× 200) (Notice: Black arrows showed the Nissl body and the red arrows showed the blood stasis)

圖2 免疫組化觀察各組 TIMP-2、Collagen I 和 Collagen IV 表達情況 (× 200) (注：紅色箭頭所指為陽性反應(yīng))Fig.2 Immunohistochemical observation of the expressions of TIMP-2, Collagen I and Collagen IV in each group (× 200) (Notice: Red arrows showed the positive reaction)

表2 各-組大鼠 TIMP-2、Collagen I 和 Collagen IV 表達平均光密度值 (± s)Tab.2 The mean optical -density of TIMP-2, Collagen I and Collagen IV in rats of each group (± s)

表2 各-組大鼠 TIMP-2、Collagen I 和 Collagen IV 表達平均光密度值 (± s)Tab.2 The mean optical -density of TIMP-2, Collagen I and Collagen IV in rats of each group (± s)

注：與假手術(shù)組相比，aP＜0.05；與術(shù)后其它組相比，bP＜0.05Notice: Compared with the sham group, aP < 0.05; Compared with other surgery groups, bP < 0.05

組別 n (只)TIMP-2 Collagen I Collagen IV假手術(shù)組 6 0.36±0.18 0.23±0.11 0.29±0.15術(shù)后 3 天組 6 0.56±0.13a 0.41±0.16a 0.43±0.11a術(shù)后 5 天組 6 0.78±0.11ab 0.50±0.19a 0.59±0.15a術(shù)后 7 天組 6 0.63±0.16a 0.77±0.17ab 0.79±0.13ab術(shù)后 9 天組 6 0.58±0.13a 0.52±0.13a 0.53±0.15a F 值 3.02 2.78 4.32 P 值 0.00 0.00 0.00

圖3 TIMP-2、Collagen I 和 Collagen IV 相對表達量變化趨勢Fig.3 Variation trend of relative expressions of TIMP-2, Collagen I and Collagen IV

Western blot 結(jié)果顯示假手術(shù)組的 TIMP-2、Collagen I 和 Collagen IV 蛋白表達量較低。SCI 后TIMP-2、Collagen I 和 Collagen IV 蛋白表達量逐漸增高。SCI 各組中除術(shù)后 9 天組外，其它組的 TIMP-2 蛋白表達量均高于假手術(shù)組且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)；SCI 后 5 天 TIMP-2 蛋白表達量最高，與其它時間點相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05)。SCI 各組 Collagen I 和 Collagen IV 的蛋白表達量均高于假手術(shù)組，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05)；Collagen I 和 Collagen IV 蛋白表達量于 SCI 后 7 天最高，與其它時間點相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (P＜0.05)(表3，圖4、5)。

表3 各組大鼠 TIMP-2、Collagen I 和 Collagen IV 蛋白表達量(± s)Tab.3 The mean optical density of TIMP-2, Collagen I and Collagen IV in rats of each group (± s)

表3 各組大鼠 TIMP-2、Collagen I 和 Collagen IV 蛋白表達量(± s)Tab.3 The mean optical density of TIMP-2, Collagen I and Collagen IV in rats of each group (± s)

注：與假手術(shù)組相比，aP＜0.05；與術(shù)后其它組相比，bP＜0.05Notice: Compared with the sham group, aP < 0.05; Compared with other surgery groups, bP < 0.05

組別 n (只)TIMP-2 Collagen I Collagen IV假手術(shù)組 6 0.77±0.17 0.28±0.10 0.25±0.15術(shù)后 3 天組 6 0.82±0.16a 0.38±0.17a 0.39±0.13a術(shù)后 5 天組 6 0.92±0.12ab 0.53±0.18a 0.52±0.18a術(shù)后 7 天組 6 0.84±0.15a 0.54±0.17ab 0.57±0.16ab術(shù)后 9 天組 6 0.78±0.14a 0.39±0.16a 0.41±0.19a F 值 5.56 4.57 8.46 P 值 0.00 0.00 0.00

圖4 各組 TIMP-2、Collagen I 和 Collagen IV 蛋白表達量 (注：與假手術(shù)組相比，aP ＜ 0.05；與術(shù)后其它組相比，bP ＜ 0.05)Fig.4 Protein expressions of TIMP-2, Collagen I and Collagen IV in each group (Notice: Compared with the sham group, aP ＜ 0.05;Compared with other surgery groups, bP ＜ 0.05)

圖5 Western blot 檢測各組 TIMP-2、Collagen I 和 Collagen IV蛋白表達情況Fig.5 Expressions of TIMP-2, Collagen I and Collagen IV in each group by Western blot

討 論

SCI 包括原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷，原發(fā)性損傷主要是由于脊髓受到機械性打擊造成組織結(jié)構(gòu)破壞，包括細胞死亡，細胞外基質(zhì)間相互作用被切斷，損傷局部出現(xiàn)水腫，血脊髓屏障被破壞，以及炎癥發(fā)生，炎癥細胞浸潤和炎性因子浸潤，內(nèi)環(huán)境紊亂等，原發(fā)性損傷后，由于血脊髓屏障通透性增加，導(dǎo)致血管內(nèi)物質(zhì)大量外漏，進一步加劇出血、水腫、炎癥等繼發(fā)性損傷[1-3,11]。在本實驗中隨著時間的推移，SCI 大鼠的 BBB 評分結(jié)果提示損傷后7 天開始顯著升高，說明其肢體功能障礙改善可能與炎癥逐漸消散，內(nèi)環(huán)境慢慢修復(fù)，出血和水腫進一步減輕有關(guān)。這也與相關(guān)實驗結(jié)果與本實驗結(jié)果相一致[12]。

TIMP-2 是一種可溶性的低分子量分泌型糖蛋白，其作為一種內(nèi)源性的酶類，能夠抑制 ECM 成分(如：膠原、明膠、蛋白多糖、基膜等) 的降解，在促進傷口修復(fù)，抑制炎性反應(yīng)等過程中起到重要作用[4,13]。TIMP-2 不僅能抑制 ECM 成分的降解，同時，還能發(fā)揮細胞生長因子樣作用，促進膠原蛋白生成及成肌纖維細胞的增生活化[14]。在本實驗中，SCI 大鼠可見大量 TIMP-2 表達，并在術(shù)后 5 天達到高峰，可能的機制是 SCI 發(fā)生后原有血脊髓屏障發(fā)生破壞，維持脊髓組織中微血管內(nèi)皮骨架結(jié)構(gòu)血管基膜發(fā)生裂解，其完整性受到破壞，開始出現(xiàn)水腫，炎癥，出血，缺氧，細胞凋亡，神經(jīng)元受損等病理現(xiàn)象，TIMP-2 被激活并開始大量表達[2,8,11]。TIMP-2 維持在較高表達水平后，對 ECM 的降解發(fā)揮抑制作用，從而維持損傷內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，有利于組織修復(fù)。但術(shù)后 5 天由于組織慢慢恢復(fù)，缺氧、缺血得到改善，對內(nèi)皮細胞，神經(jīng)元等的刺激也逐漸減弱，因此，TIMP-2 也不會被過度激活，其表達逐漸降低。TIMP-2 與 MMPs 相結(jié)合后形成酶原－TIMP 復(fù)合體，從而抑制 MMPs 的活性。在一般正常生理情況下，此二者的比例是保持一種動態(tài)平衡關(guān)系，從而維持著 ECM 有序的合成和降解。在病理狀態(tài)下，二者的平衡被打破，如脊髓損傷后，炎癥因子釋放過多，基質(zhì)大量被溶解，EMC 降解減少，因此造成積聚[15-17]。MMPs 被激活后，就能夠發(fā)揮降解 EMC 的生物學(xué)作用。因此將其活性嚴(yán)格地控制在一定的程度，對維持機體的正常穩(wěn)定狀態(tài)具有重要的意義。

Collagen I 主要來自哺乳動物正常組織中真皮層，成纖維細胞、成骨細胞、成軟骨細胞等，具有形成和保持骨與結(jié)締組織的完整性的作用[18]。研究也表明，Collagen I 能夠參與損傷血管的重新構(gòu)建，與血管形成密切相關(guān)，同時在形成特定的細胞外微環(huán)境中也起到主要作用，而這些特定的細胞外微環(huán)境對于細胞生存，維持細胞完整性及細胞之間信號傳遞有著重要意義和作用[9,19]。此外，Collagen I 可以通過盤蛋白、整合素等向細胞內(nèi)傳遞細胞外環(huán)境中的刺激信號，發(fā)揮其生物學(xué)功能；通過截留、保存、運輸生長因子從而起到信號分子的作用[9,20]。這些功能在器官發(fā)育、傷口組織愈合與修復(fù)中發(fā)揮重要作用。在正常脊髓組織中，Collagen I 并無明顯表達，SCI 后，由于出血，水腫等病理因素的刺激，Collagen I 開始表達[21]。

Collagen IV 作為 ECM 中基膜的主要組成組分，廣泛分布于全身組織，起組織連接、促進損傷血管再生作用，對維持內(nèi)環(huán)境的平衡穩(wěn)定具有重要意義[22-24]。Collagen IV 在正常的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，僅存在于微血管周圍和腦脊膜中，由血管內(nèi)皮細胞分泌并包繞血管內(nèi)皮細胞，也是構(gòu)成微血管管壁的主要成分之一，在脊髓實質(zhì)中的其它部分并無明顯表達[8]。當(dāng)脊髓受到打擊后，ECM 遭到破壞，基膜成分開始裂解，血管內(nèi)皮細胞壞死、凋亡，Collagen IV 開始降解，但由于生理病理因素的影響，血管再生機制被很快激活，作為構(gòu)成微血管主要成分的Collagen IV 開始大量合成，研究表明，SCI 早期，Collagen IV 的合成有利于阻礙炎癥的發(fā)生[25]。

本研究發(fā)現(xiàn)術(shù)后 3 天 Collagen I、Collagen IV 開始明顯表達，術(shù)后 7 天 Collagen I、Collagen IV 表達到最高峰，隨后開始慢慢下降。其可能的機制為：SCI 后，TIMP-2，Collagen I、Collagen IV 開始表達，高表達的 TIMP-2 促進 Collagen IV 過度表達，同時過度表達的 Collagen IV 形成的某種機械屏障能限制軸突再生，從而阻礙神經(jīng)功能的恢復(fù)，此時Collagen I 表達水平也并未很高，對組織的修復(fù)能力很弱。術(shù)后 5 天，TIMP-2 表達到最高峰隨后開始下降，其對 Collagen IV 表達的促進作用減弱，Collagen IV 表達減少，機械屏障開始分解，神經(jīng)正常的生理功能得以恢復(fù)，與此同時 Collagen I 在損傷后 7 天表達最高，其所發(fā)揮的血管重建，組織修復(fù)等作用也達到最高峰，所以 BBB 評分在損傷后 7 天顯著升高。研究證明[26-27]，SCI 后過度表達的 Collagen IV形成的膠質(zhì)瘢痕發(fā)揮機械屏障作用，能夠限制軸突的再生與傳導(dǎo)功能，從而影響神經(jīng)功能的恢復(fù)。

本實驗研究結(jié)果為治療 SCI 提供一個新思路，即在損傷早期提高 Collagen I 的表達，通過調(diào)控TIMP-2 的表達，控制 Collagen IV 表達水平使其不形成膠質(zhì)瘢痕的同時還能限制炎癥反應(yīng)。

參 考 文 獻

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