江連洲，陳 思，李 楊，吳長(zhǎng)玲，王中江，張巧智，齊寶坤，隋曉楠,*，陳復(fù)生，許振國(guó)

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.河南工業(yè)大學(xué)糧油食品學(xué)院，河南 鄭州 450001；3.山東省高唐藍(lán)山集團(tuán)總公司，山東 聊城 252000）

大豆分離蛋白（soy protein isolate，SPI）是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富的食用蛋白資源，由于其較高的蛋白含量及優(yōu)良的功能特性，目前已被廣泛地應(yīng)用于食品加工[1]。在SPI的生產(chǎn)加工過程中，噴霧干燥、復(fù)性等多個(gè)環(huán)節(jié)均需要經(jīng)過加熱處理，且熱處理會(huì)顯著影響蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)及功能性質(zhì)。Petruccelli等[2]發(fā)現(xiàn)，pH值為中性的條件下，98 ℃熱處理SPI一段時(shí)間，其持水性增強(qiáng)，但溶解性明顯下降。在此研究基礎(chǔ)上，Petruccelli等[3]繼續(xù)研究80、92 ℃熱處理對(duì)SPI的影響，發(fā)現(xiàn)其乳化性得到明顯改善。

花青素是一種含量豐富、廣泛應(yīng)用于食品中的黃酮類植物色素，具有較強(qiáng)的1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除能力[4]，可以延緩衰老。此外其還具有抑菌、預(yù)防癌癥、抗心血管疾病等多種功能[5-7]。花青素是一種小分子活性物質(zhì)，且具有較強(qiáng)的蛋白親和性，可以與蛋白復(fù)合形成具有功能性質(zhì)的復(fù)合體系。在食品的生產(chǎn)加工過程中，蛋白質(zhì)不可避免的會(huì)受到這類小分子的影響，因此近年來(lái)蛋白質(zhì)與花青素的復(fù)合對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)與功能性質(zhì)的影響備受關(guān)注。Kanakis等[8]研究茶多酚與牛奶蛋白的相互作用發(fā)現(xiàn)，茶多酚的加入會(huì)改變牛奶蛋白的結(jié)構(gòu)構(gòu)象，使牛奶蛋白結(jié)構(gòu)更加穩(wěn)定。Koningsvel等[9]的研究結(jié)果表明，酚類化合物與馬鈴薯蛋白的結(jié)合會(huì)降低蛋白的溶解性。Rawel等[10]研究發(fā)現(xiàn)酚類化合物可誘導(dǎo)蛋白質(zhì)與其發(fā)生交聯(lián)，這種相互作用會(huì)改變蛋白質(zhì)分子的凈電荷，進(jìn)而影響復(fù)合物的溶解度。劉勤勤等[11]研究發(fā)現(xiàn)，SPI與茶多酚通過范德華力和氫鍵發(fā)生相互作用，且茶多酚的加入導(dǎo)致SPI二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變。以上研究說明多酚類成分可以和蛋白相互作用，同時(shí)影響蛋白的結(jié)構(gòu)及功能性質(zhì)，然而相關(guān)研究鮮見涉及SPI與花青素的交互作用，而對(duì)于熱處理SPI與花青素的復(fù)合對(duì)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)、功能性質(zhì)更鮮見研究。因此明確SPI與花青素的相互作用可以顯著提高SPI的生物利用率，進(jìn)而極大地發(fā)揮SPI在食品中的作用。

本實(shí)驗(yàn)主要通過溶解性、乳化性及乳化穩(wěn)定性探究熱處理SPI與花青素復(fù)合體系對(duì)蛋白功能性質(zhì)的影響，采用粒度分析、Zeta電位分析進(jìn)一步解釋花青素對(duì)復(fù)合體系中蛋白功能性質(zhì)影響的變化規(guī)律，最后采用熒光光譜探究熱處理SPI和花青素復(fù)合體系對(duì)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響，以期對(duì)SPI在食品復(fù)合組分中的合理應(yīng)用提供一定的數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SPI由實(shí)驗(yàn)室自制；花青素（花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%，進(jìn)一步經(jīng)過固相萃取分離純化，除去蛋白質(zhì)、多糖、有機(jī)酸和酚類物質(zhì)，得到花青素純化物，其花青素質(zhì)量分?jǐn)?shù)為35%） 陜西天之潤(rùn)生物科技有限公司；Lowry法測(cè)溶解度試劑盒 上海荔達(dá)生物科技有限公司；十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、鹽酸、氫氧化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉 北京新光化工試劑廠；正己烷、乙酸乙酯、甲醇 天津北科化學(xué)品有限責(zé)任公司；其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

ULTRA-TURRAX UTL2000乳化機(jī) 德國(guó)IKA儀器設(shè)備公司；F-4500熒光分光光度計(jì) 日本Hitachi公司；Mastersizer 2000激光粒度儀 英國(guó)馬爾文儀器有限公司；ZetaPALS-Zeta電位儀 美國(guó)布魯克海文儀器公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品制備

1.3.1.1 SPI的制備

參考Meinlschmidt等[12]的方法。將新鮮大豆碾碎成粉后，與正己烷按照料液比1∶3（g/mL）混合，室溫下攪拌2 h進(jìn)行3 次脫脂。將脫脂豆粉與去離子水按照1∶10（g/mL）比例混合后，用2 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至8.5，室溫下攪拌2 h后，9 000×g離心20 min，取上清液用2 mol/L HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至4.5。靜置2 h后6 000×g離心20 min得到蛋白沉淀，最后將蛋白沉淀溶于去離子水，用2 mol/L NaOH溶液將蛋白質(zhì)pH值調(diào)節(jié)至7.0。將蛋白溶液冷凍干燥后得粉末狀SPI。

1.3.1.2 花青素的提純

參照Sui Xiaonan等[13]的方法，將富含花青素的黑米提取物粉末溶于去離子水，使用固相萃取技術(shù)去除黑米提取物中雜質(zhì)。具體純化步驟：首先用2 個(gè)柱體積的酸化水去除不溶性成分，如糖、酸等，然后用2 個(gè)柱體積的乙酸乙酯去除多酚類化合物，如酚酸、黃酮等，最后用甲醇洗脫吸附在吸附柱上的花青素。使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器于40 ℃除去甲醇，即可得純化后的花青素，在－20 ℃條件下貯存?zhèn)溆?，?80 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)花青素的吸光度。

1.3.1.3 SPI-花青素復(fù)合物的制備

根據(jù)王中江等[14]的研究發(fā)現(xiàn)未經(jīng)加熱處理的SPI中7S和11S球蛋白變性溫度分別為73.2 ℃和92.7 ℃，因此本實(shí)驗(yàn)選擇70（7S和11S均未變性）、85（7S變性而11S沒有變性）、100 ℃（7S和11S完全變性）作為不同的熱處理?xiàng)l件。將SPI粉末溶于去離子水后分別置于70、85、100 ℃水浴鍋內(nèi)熱處理15 min，取出后立即冰浴至室溫，將溶液冷凍干燥后使用。將熱處理SPI粉末用0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）配制成1 g/100 mL的SPI溶液。按照質(zhì)量比50∶1將花青素（0.02 g/100 mL）加入到SPI溶液中室溫下磁力攪拌90 min制成SPI-花青素復(fù)合物。其中未加熱SPI、70 ℃熱處理SPI、85 ℃熱處理SPI、100 ℃熱處理SPI組分別用A、B、C、D表示，相應(yīng)的SPI-花青素復(fù)合物組分別表示為A’、B’、C’、D’。

1.3.2 SPI-花青素復(fù)合物指標(biāo)的測(cè)定

1.3.2.1 溶解性的測(cè)定

參考Sammoto等[15]的方法，精確稱取10 mL加入花青素前后的熱處理SPI溶液，3 000×g離心15 min。上清液經(jīng)適當(dāng)稀釋后，應(yīng)用Lowry法測(cè)定上清液蛋白含量。以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，用凱氏定氮法測(cè)定樣品總蛋白含量。按公式（1）計(jì)算其溶解度：

1.3.2.2 乳化性及乳化穩(wěn)定性的測(cè)定

參考Li Chen等[16]的方法，取9 mL加入花青素前后的熱處理SPI，加入3 mL牡丹籽油后充分混合攪拌，在25 ℃條件下使用高壓均質(zhì)機(jī)10 000 r/min分散1 min，立即吸取50 μL用0.1 g/100 mL SDS溶液稀釋250 倍。用紫外分光光度計(jì)測(cè)定500 nm波長(zhǎng)處的吸光度A0。靜置30 min后測(cè)定吸光度A1，分別按公式（2）、（3）計(jì)算乳化性指數(shù)（emulsifying activity index，EAI）和乳化穩(wěn)定性指數(shù)（emulsifying stability index，ESI）：

式中：N為稀釋倍數(shù)（250）；C為SPI質(zhì)量濃度/（g/mL）；V為乳化液中油相體積分?jǐn)?shù)/%；A0為0 min時(shí)樣液吸光度；A30為30 min時(shí)樣液吸光度。

1.3.2.3 粒徑分布的測(cè)定

利用Mastersizer 2000激光粒度儀對(duì)加入花青素前后的熱處理SPI溶液樣品進(jìn)行粒徑分布測(cè)定。顆粒折射率1.46，分散劑折射率1.33，吸收參數(shù)0.001。實(shí)驗(yàn)采用體積平均直徑（D[4,3]）表征液滴粒度的大小[17]。

1.3.2.4 Zeta電位的測(cè)定

參考Xu Duoxia等[18]的方法采用Zeta電位儀測(cè)定樣品的Zeta電位，加入花青素前后的熱處理SPI溶液樣品適度稀釋，上樣體積為1 mL，測(cè)定溫度為25 ℃，溫度平衡時(shí)間為2 min。

1.3.2.5 熒光光譜的測(cè)定

向10 mL熱處理SPI溶液（1.0×10－6mol/L）中分別逐滴加入100 μL 2.0×10－6、4.0×10－6、6.0×10－6、8.0×10－6、10.0×10－6mol/L的花青素溶液，渦旋振蕩后，分別在25、33、41 ℃的恒溫水浴鍋中保溫5 min。選擇激發(fā)波長(zhǎng)280 nm、激發(fā)狹縫5 nm、掃描速率240 nm/min，連續(xù)掃描記錄發(fā)射波長(zhǎng)為300～500 nm。樣品的三維熒光光譜測(cè)定條件：室溫條件下，以280 nm為激發(fā)波長(zhǎng)，連續(xù)掃描記錄發(fā)射波長(zhǎng)為300～500 nm。熒光猝滅一般可分為動(dòng)態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅2 種作用機(jī)制。應(yīng)用Stern-Volmer方程判斷猝滅類型[17]，見公式（4）：

式中：F0和F分別為未加入和加入猝滅劑花青素時(shí)SPI溶液的熒光強(qiáng)度；[Q]為花青素的濃度/10－6mol/L；Kq為雙分子猝滅速率常數(shù)/（L/（mol·s））；Ksv為動(dòng)態(tài)猝滅常數(shù)/（L/mol）；τ0為猝滅劑不存在時(shí)熒光體的壽命，生物大分子的平均壽命約為10－8s[16]。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

每組數(shù)據(jù)均重復(fù)3 次，利用Origin 8.5軟件處理數(shù)據(jù)作圖。利用SPSS V17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA差異顯著性分析及t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 SPI-花青素復(fù)合物對(duì)熱處理SPI溶解度的影響

圖1 SPI-花青素復(fù)合物對(duì)熱處理SPI溶液溶解度的影響Fig. 1 Effect of anthocyanins on the solubility of heated SPI

由圖1可知，與未加熱SPI相比，經(jīng)70、85 ℃熱處理的SPI溶液溶解度提高，可能是由于原本部分不溶性的蛋白聚集體由于熱處理而發(fā)生解聚[20-21]。100 ℃熱處理的SPI溶液溶解性降低，可能是由于高溫處理使得蛋白中的7S和11S成分全部變性，11S球蛋白的堿性亞基與7S球蛋白的β-亞基之間形成了不可溶性熱聚集體[22]，使蛋白溶液溶解性下降。加入花青素后，熱處理SPI-花青素復(fù)合物與熱處理SPI相比，溶解度顯著下降（P＜0.05）。與未加熱SPI-花青素復(fù)合物的現(xiàn)象相同，但從圖1可以看出，85 ℃熱處理SPI-花青素復(fù)合物溶解度最大。Rawel等[10]研究發(fā)現(xiàn)酚類物質(zhì)的加入，會(huì)封閉蛋白質(zhì)相應(yīng)的親水性氨基酸，使溶菌酶溶解度下降。因此花青素的加入，可能會(huì)封閉蛋白質(zhì)中較大量的游離氨基和色氨酸，同時(shí)花青素和蛋白可能復(fù)合生成某些不溶性聚合物從而降低溶液的溶解度。如在pH值不小于8.0時(shí)，原花青素與溶菌酶反應(yīng)生成醌類不溶性聚集物從而使溶菌酶溶解度顯著下降[23]；在強(qiáng)酸的條件下，馬鈴薯果汁中的酚類化合物和馬鈴薯蛋白質(zhì)相互作用產(chǎn)生不溶性聚集，從而使馬鈴薯蛋白質(zhì)溶解性下降[9]。

2.2 SPI-花青素復(fù)合物對(duì)熱處理SPI的EAI和ESI的影響

圖2 花青素對(duì)熱處理SPI溶液EAI及ESI的影響Fig. 2 Effect of anthocyanins on the EAI and ESI of heated SPI solutions

EAI表示SPI-花青素復(fù)合物形成油-水界面的能力；ESI是指SPI-花青素復(fù)合物乳狀液形成小液滴的抗應(yīng)變能力[24]。復(fù)合物中蛋白質(zhì)乳化性受多種因素影響，如蛋白質(zhì)與花青素的結(jié)合程度、分子的柔順性或蛋白質(zhì)分子質(zhì)量分布等[25]。由圖2可知，未加入花青素時(shí)，隨著熱處理溫度的升高，蛋白EAI和ESI均先增大再減小，85 ℃熱處理蛋白EAI和ESI最強(qiáng)。由于熱處理溫度的升高，蛋白質(zhì)的二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)舒展，使得鏈節(jié)變得十分柔順，好的柔順性有利于界面上分子有序重排，從而使得蛋白親水親油性增強(qiáng)，乳化性增強(qiáng)[26]。100 ℃熱處理后，蛋白EAI和ESI明顯下降，這可能是SPI分子結(jié)構(gòu)進(jìn)一步展開，極化的蛋白分子間發(fā)生吸引產(chǎn)生相互作用重新形成大尺度聚集體所導(dǎo)致。加入花青素后，熱處理SPI的EAI均顯著增大（P＜0.05），相應(yīng)復(fù)合物中85 ℃熱處理SPI的EAI和ESI最好?？赡苁怯捎诨ㄇ嗨氐募尤朐鰪?qiáng)界面薄膜的表面壓力和黏彈性，形成較穩(wěn)定的界面膜，增加復(fù)合物的EAI[27]。另外，蛋白與花青素復(fù)合后，油-水界面層一部分被蛋白質(zhì)占據(jù)，另一部分被花青素占據(jù)，形成第1層乳化膜。蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)充分暴露和花青素通過疏水相互作用形成第2層的乳化膜，因此EAI顯著提升。這與Liu Fuguo等[28]的研究結(jié)果一致，中性條件下SPI-花青素復(fù)合物的形成會(huì)提高乳液的乳化性。此外，花青素的加入使熱處理SPI的ESI增強(qiáng)，這種效應(yīng)可以歸因于花青素與蛋白復(fù)合后，液滴間空間斥力的增加及表面電荷的變化。

2.3 SPI-花青素復(fù)合物對(duì)熱處理SPI粒徑分布的影響

粒徑分布可較為直觀地表征復(fù)合物的ESI，體積平均直徑D[4,3]表征復(fù)合物液滴的平均大小。從圖3a可以看出，熱處理SPI溶液呈雙峰分布，與花青素復(fù)合后溶液呈單峰分布，說明復(fù)合后溶液中液滴具有相似的直徑，穩(wěn)定性較強(qiáng)。同未加熱SPI比較，70、85 ℃熱處理后SPI溶液液滴的粒徑變小，可能是由于熱處理后蛋白疏水基團(tuán)暴露，蛋白柔性結(jié)構(gòu)的展開，乳化性增強(qiáng)，維持體系液滴以小液滴存在，所以體系液體的粒徑較小。當(dāng)SPI經(jīng)過100 ℃處理后，粒徑開始增大，這說明100 ℃處理后，SPI完全變性發(fā)生熱聚集作用從而生成大尺度聚集體，使粒徑增大。熱處理蛋白與花青素復(fù)合后，體積平均直徑D[4,3]均顯著降低（P＜0.05），與未加熱大豆蛋白結(jié)果相同，相應(yīng)復(fù)合物中85 ℃熱處理SPI體積平均直徑最小，ESI最強(qiáng)，與2.2節(jié)ESI結(jié)果一致。Sorgentini等[27]研究發(fā)現(xiàn)熱處理導(dǎo)致蛋白質(zhì)解折疊，疏水基團(tuán)暴露。故花青素與SPI間通過疏水相互作用發(fā)生了緊密縮合從而降低粒徑。

圖3 加入花青素前后熱處理SPI溶液粒徑分布（a）和體積平均直徑D[4,3]（b）Fig. 3 Particle size distribution (a) and volume mean diameter D[4,3] (b) in heated soybean protein solutions before and after being complexed with anthocyanins

2.4 SPI-花青素復(fù)合物對(duì)熱處理SPI Zeta電位的影響

圖4 花青素對(duì)熱處理SPI溶液Zeta電位的影響Fig. 4 Effect of anthocyanins on Zeta potential of heated SPI solutions

Zeta電位可較好地表征顆粒之間相互吸引能力[29]。通過Zeta電位的絕對(duì)值可以判斷溶液體系的穩(wěn)定性。絕對(duì)值越高，粒子間的相互排斥力越大，越不易發(fā)生相互碰撞而聚集。反之，絕對(duì)值越低，粒子間極易相互吸引而發(fā)生聚集。由圖4可知，未加入花青素的熱處理SPI樣品液滴表面呈現(xiàn)出較低的負(fù)電性，且變化不大（－13.2～－14.5 mV）。加入花青素后，溶液的Zeta電位絕對(duì)值均顯著增大（P＜0.05），且相應(yīng)復(fù)合物中85 ℃熱處理SPI的Zeta電位絕對(duì)值最大，穩(wěn)定性最強(qiáng)，這與Von Staszewski[30]和Rodríguez[31]等的研究結(jié)果一致?？赡苁怯捎诨ㄇ嗨貛ж?fù)電荷[32]，并且在pH值為7.4時(shí)，花青素中的酚羥基可以去質(zhì)子化，所產(chǎn)生的氧中心可以輸出高的負(fù)電荷密度，與蛋白的正電基團(tuán)結(jié)合，使得SPI的負(fù)電荷相對(duì)增加。此外，由于與花青素的復(fù)合，蛋白質(zhì)上的帶正電荷基團(tuán)較少暴露出來(lái)，從而使SPI負(fù)電性增強(qiáng)。這說明熱處理SPI與花青素復(fù)合可以提高體系穩(wěn)定性。該結(jié)果與樣品乳化穩(wěn)定性較好的結(jié)果一致。

2.5 SPI-花青素復(fù)合物的熒光光譜分析

2.5.1 花青素對(duì)熱處理SPI內(nèi)源熒光光譜的影響

蛋白質(zhì)的內(nèi)源熒光主要依賴于色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe），在激發(fā)波長(zhǎng)為280 nm時(shí)，只考慮Trp和Tyr，Phe可以忽略[8]。由圖5可知，在25 ℃、pH 7.4的條件下，固定激發(fā)波長(zhǎng)280 nm，掃描300～500 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)隨花青素濃度的增加，蛋白內(nèi)源熒光發(fā)射光譜的變化情況。固定熱處理SPI溶液濃度，隨著花青素的不斷加入，熱處理SPI熒光強(qiáng)度逐漸降低，說明花青素對(duì)熱處理SPI的內(nèi)源熒光產(chǎn)生了猝滅作用。同時(shí)發(fā)現(xiàn)SPI的最大熒光發(fā)射波長(zhǎng)發(fā)生了紅移，未加熱SPI從342 nm紅移至352.8 nm，紅移了10.8 nm，70、85、100 ℃熱處理SPI分別紅移了10.2、11.6 nm和10.6 nm，這說明花青素與SPI發(fā)生了結(jié)合，從而改變了SPI的結(jié)構(gòu)構(gòu)象，Trp和Tyr的微環(huán)境發(fā)生改變，由疏水環(huán)境變?yōu)橛H水環(huán)境，肽鏈結(jié)構(gòu)舒展[33]。

圖5 花青素對(duì)熱處理SPI溶液熒光光譜的影響Fig. 5 Effect of anthocyanins on the fluorescence spectrum of heated SPI

2.5.2 SPI-花青素復(fù)合物的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)

圖6 不同溫度條件下花青素猝滅熱處理SPI的Stern-Volmer圖Fig. 6 Stern-Volmer plots for the quenching of heated SPI by anthocyanins at different temperatures

根據(jù)Stern-Volmer方程，以[Q]為自變量，F(xiàn)0/F為因變量，作圖得圖6，根據(jù)圖6直線的斜率可以計(jì)算出SPI-花青素復(fù)合物的Ksv和Kq，結(jié)果見表1。

表1 SPI-花青素復(fù)合物的熒光猝滅常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)、表觀結(jié)合常數(shù)Table 1 Fluorescence quenching constants, binding sites and apparent binding constants of anthocyanin-heated soybean protein complex

對(duì)于動(dòng)態(tài)猝滅，隨著溫度的升高，猝滅常數(shù)增大，即Stern-Volmer曲線斜率增大。如果是靜態(tài)猝滅則相反。通過圖6和表1可以看出，隨著溫度的升高，熱處理SPI的Stern-Volmer曲線斜率逐漸變小，說明花青素對(duì)熱處理SPI的熒光猝滅機(jī)制是靜態(tài)猝滅。一般情況猝滅劑對(duì)于生物大分子最大猝滅速率常數(shù)為2×1010L/（mol·s），而花青素對(duì)熱處理SPI的熒光猝滅速率數(shù)量級(jí)均為1012，這進(jìn)一步表明花青素對(duì)熱處理SPI的作用機(jī)制為靜態(tài)猝滅。

對(duì)于靜態(tài)猝滅過程，可應(yīng)用公式（5）求得結(jié)合位點(diǎn)數(shù)：

式中：Ks為表觀結(jié)合常數(shù)；n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。

按公式（5），以lg[（F0－F）/F]對(duì)lg[Q]作圖得圖7，根據(jù)直線斜率和截距可以得到花青素與熱處理SPI間的表觀結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)（表1）。從表1可以看出，花青素與熱處理大豆蛋白間的表觀結(jié)合常數(shù)數(shù)量級(jí)為104，說明花青素與熱處理SPI發(fā)生了緊密的結(jié)合，且均形成了結(jié)合位點(diǎn)數(shù)接近于1的復(fù)合物。

圖7 不同溫度條件下花青素猝滅熱處理SPI的雙對(duì)數(shù)圖Fig. 7 Double logarithmic curves of heated SPI quenched by anthocyanins at different temperatures

2.5.3 三維熒光光譜分析結(jié)果

圖8 花青素與熱處理SPI結(jié)合對(duì)蛋白影響的三維熒光光譜分析圖Fig. 8 Three dimensional fluorescence spectrum analysis of the effect of complexation between anthocyanins and heated SPI on protein structure

如圖8所示，峰a表示拉曼散射，峰b表示瑞利散射，SPI-花青素復(fù)合物的形成使得光散射作用增強(qiáng)，從而使得這2 個(gè)散射峰的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。圖中峰1表示Trp和Tyr產(chǎn)生的特征峰[33]，加入花青素后熱處理SPI的峰1峰的顏色均變淺，該現(xiàn)象說明花青素的加入使得蛋白質(zhì)熒光強(qiáng)度顯著降低，等高線變稀疏?；ㄇ嗨氐募尤胧沟玫鞍踪|(zhì)中部分Trp和Tyr殘基的疏水基團(tuán)被掩埋在SPI-花青素復(fù)合物的疏水區(qū)域中。相應(yīng)復(fù)合物中，85 ℃蛋白的峰1峰顏色最淺，說明此時(shí)蛋白的熒光強(qiáng)度最低，Trp和Tyr殘基的疏水基團(tuán)掩埋最深。峰2表示多肽鏈骨架結(jié)構(gòu)產(chǎn)生的特征峰[34]，復(fù)合花青素后此區(qū)域面積變小，說明花青素的復(fù)合使得蛋白質(zhì)多肽鏈的骨架伸展，蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)探究了熱處理SPI與SPI-花青素復(fù)合物對(duì)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)與功能性質(zhì)的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，花青素對(duì)熱處理SPI的猝滅方式為靜態(tài)猝滅，熱處理SPI與花青素間存在著強(qiáng)烈的相互作用，二者均可形成結(jié)合位點(diǎn)近似于1的復(fù)合物。三維熒光光譜結(jié)果表明花青素的復(fù)合使得蛋白質(zhì)多肽鏈的骨架伸展，蛋白結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。同時(shí)花青素的加入使得熱處理SPI的Zeta電位絕對(duì)值增大，溶液體積平均直徑變小，EAI及ESI增強(qiáng)，但溶液溶解性有所下降。85 ℃熱處理SPI相應(yīng)復(fù)合物的Zeta電位絕對(duì)值最大，體積平均直徑最小，乳化性及乳化穩(wěn)定性增強(qiáng)，溶解性最大，說明85 ℃熱處理SPI與花青素復(fù)合后具有最好的溶解性、EAI及ESI，因此85 ℃為熱處理SPI最宜溫度。該結(jié)果說明花青素的復(fù)合對(duì)熱處理SPI的界面性質(zhì)及蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)有著不可忽視的影響，此研究將為SPI在食品復(fù)合組分中的合理應(yīng)用提供參考。

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