梁美蓮，朱秋勁*，劉春麗，王 坤

（貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院，貴州省農(nóng)畜產(chǎn)品貯藏與加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025）

紅肉及其加工肉制品的安全性問題一度引發(fā)世界性熱議，長期以來的流行病學(xué)資料顯示，紅肉及其加工肉制品的攝入與癌癥、動脈粥樣硬化、2型糖尿病等致命性疾病密切關(guān)聯(lián)[1-3]，除了人們熟知的亞硝酸鹽、雜環(huán)胺、多環(huán)芳烴、助氧化劑亞鐵血紅素等不安全因素之外[4]，越來越多的研究證明紅肉中存在的一種酸性氨基糖——N-羥乙酰神經(jīng)氨酸（N-glycolylneuraminic acid，Neu5Gc）與上述疾病息息相關(guān)[5-10]。

大約在2～3百萬年前，人類編碼單磷酸胞苷-神經(jīng)氨酸羥化酶（cytidine monophos-phate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase，CMAH）的基因外顯子發(fā)生缺失突變，CMAH是將體內(nèi)N-乙酰神經(jīng)氨酸合成Neu5Gc的關(guān)鍵酶，因此，正常人體內(nèi)不能合成Neu5Gc，但大多數(shù)哺乳動物、以及和人類相近的類人猿都能合成Neu5Gc[11-12]。然而，在人體的上皮及內(nèi)皮細(xì)胞以及癌癥組織中卻可以檢測到Neu5Gc，這是因?yàn)镹eu5Gc可以隨著紅肉及其加工肉制品的攝入而被人體吸收和積累[13]。Neu5Gc被機(jī)體視為外來抗原，人體內(nèi)會產(chǎn)生相應(yīng)的Neu5Gc抗體，在Neu5Gc與Neu5Gc抗體發(fā)生反應(yīng)的過程中能夠刺激炎癥的發(fā)生，而炎癥恰恰可以促進(jìn)和加劇癌癥、動脈粥樣硬化、2型糖尿病等重大疾病[14-15]。此外，紅肉易被產(chǎn)志賀毒素型大腸桿菌污染，其產(chǎn)生的志賀毒素若與人體腸上皮細(xì)胞中的Neu5Gc結(jié)合將導(dǎo)致胃腸道不適，引起腹瀉等癥狀，志賀毒素若與腎內(nèi)皮細(xì)胞中聚集的Neu5Gc結(jié)合破壞內(nèi)皮細(xì)胞從而導(dǎo)致溶血性尿毒癥綜合征，發(fā)生出血性腹瀉并伴隨腎衰竭等癥狀[16-18]。因此，紅肉及其加工肉制品中存在的Neu5Gc嚴(yán)重威脅著消費(fèi)者的身體健康。

近年來隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，紅肉的消費(fèi)也逐漸增長，加工肉制品的種類也日漸豐富，包括傳統(tǒng)的臘腸、宣威火腿、西式火腿以及培根等，這些產(chǎn)品不僅能夠滿足人們營養(yǎng)的需求，也能滿足人們對肉制品口感的追求，然而Neu5Gc在不同加工肉制品中的含量尚不清楚，因此測定不同紅肉及其加工肉制品中Neu5Gc的含量，對人們在飲食中對于不同種類的紅肉以及肉制品的選擇有著重要的指導(dǎo)意義。此外，目前國內(nèi)外鮮有關(guān)于Neu5Gc解離方法的研究，若是能為減少Neu5Gc摸索一套行之有效的方法，這對解除紅肉的安全憂患意義重大。本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜-熒光檢測器（high performance liquid chromatography-fluorescence detector，HPLC-FLD）法檢測了不同紅肉及加工肉制品中Neu5Gc的含量，探究油炸溫度、蒸煮時間、酶制劑對牛肉中Neu5Gc含量的影響，以及對Neu5Gc的解離效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

冷鮮豬里脊、冷鮮牛里脊、豬火腿腸、豬培根、宣威火腿、廣式香腸、貴州香腸 貴陽市花溪區(qū)星力超市。

Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)品、1,2-二氨基-4,5-亞甲基二氧苯鹽酸鹽（1,2-diamino-4,5-methylenedioxybenzene dihydrochloride，DMB）、β-巰基乙醇（色譜純）、谷胱甘肽過氧化物酶（100 U/0.63 mg） 美國Sigma公司；乙腈、甲醇（均為色譜純） 德國Applichem公司；溶菌酶（20 000 U/mg）、葡萄糖氧化酶（10 kU/30.5 mg）、α-半乳糖甘酶（9 U/mg）、β-半乳糖甘酶（1 kU/6.67 mg） 北京Solarbio科技有限公司；菊粉酶（500 000 U/g） 上海寶曼生物科技有限公司；α-乙酰乳酸脫羧酶（食品級） 湖北遠(yuǎn)成賽創(chuàng)科技有限公司；葡萄糖異構(gòu)酶（食品級） 河南萬邦實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

1260型HPLC（配有FLD和自動進(jìn)樣器） 美國安捷倫科技有限公司；LiChrosorb RP-18柱 德國默克集團(tuán)；真空冷凍干燥機(jī)、電動玻璃勻漿機(jī)、超聲清洗器 寧波新芝有限公司；電子分析天平 奧豪斯儀器有限公司；離心機(jī) 上海盧湘儀儀器有限公司；數(shù)顯恒溫油浴鍋 上海和恒儀器設(shè)備有限公司；便攜式色差儀深圳市三恩時科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 HPLC條件

色譜柱為LiChrosorb RP-18柱（250 mm×4.0 mm，5 μm），柱溫30 ℃，F(xiàn)LD激發(fā)波長373 nm、發(fā)射波長448 nm，流動相為乙腈-甲醇-超純水（8∶7∶85，V/V），流速為0.9 mL/min，進(jìn)樣體積10 μL。

1.3.2 衍生液的配制及衍生條件

DMB衍生液的配制：8 mmol/L DMB、1.5 mol/L冰醋酸、0.25 mol/L硫代硫酸鈉、0.25 mol/L亞硫酸鈉、0.8 mmol/L 2-巰基乙醇。

衍生條件：900 μL標(biāo)準(zhǔn)品中加入100 μL DMB衍生液，50 ℃避光衍生150 min，冷卻至室溫后分析。

1.3.3 不同紅肉及加工肉制品中Neu5Gc含量的測定

分別準(zhǔn)確稱取1 g冷鮮豬里脊、冷鮮牛里脊、豬火腿腸、豬培根、宣威火腿、廣式香腸以及貴州香腸（均取瘦肉部分）于勻漿瓶中，加入10 mL 30%的飽和硫酸銨溶液研磨成均勻的肉漿，室溫下放置1 h后13 000 r/min離心15 min，將沉淀的蛋白質(zhì)和上清液分開，沉淀和上清液分別進(jìn)行冷凍干燥。冷凍干燥后的蛋白質(zhì)沉淀和上清液粉末分別加入5 mL 2 mol/L醋酸溶解并合并，于80 ℃水浴3 h使Neu5Gc游離出來，水解后再進(jìn)行冷凍干燥除去醋酸。凍干粉溶于0.8 mL水中，加入0.2 mL 0.1 mol/L NaOH溶液，37 ℃水浴30 min進(jìn)行脫乙酰處理。精確吸取處理后的樣液900 μL，加入100 μL衍生液，用0.22 μm膜過濾后衍生，待測。

1.3.4 解離Neu5Gc酶制劑的篩選

1.3.4.1 溶菌酶對Neu5Gc的解離效果

準(zhǔn)確吸取400 μL 1 mmol/L的Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)液，加入500 μL超純水，按質(zhì)量分?jǐn)?shù)添加3%的溶菌酶，37 ℃水浴30 min后加入100 μL衍生劑，0.22 μm膜過濾后，衍生，檢測，并以未添加溶菌酶為空白對照。

1.3.4.2 葡萄糖異構(gòu)酶對Neu5Gc的解離效果

準(zhǔn)確吸取200 μL 1 mmol/L的Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)液，加入700 μL的超純水，按質(zhì)量分?jǐn)?shù)添加3%的葡萄糖異構(gòu)酶，于60 ℃水浴2 h后加入100 μL衍生劑，0.22 μm膜過濾后，衍生，檢測，并以未添加葡萄糖異構(gòu)酶為空白對照。

1.3.4.3 葡萄糖氧化酶對Neu5Gc的解離效果

準(zhǔn)確稱取0.01 g葡萄糖氧化酶溶于1 mL超純水中，取250 μL加入200 μL 1 mmol/L的Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)液中，加入450 μL超純水，37 ℃水浴30 min后加入100 μL衍生劑，0.22 μm膜過濾后，待測，并以未添加葡萄糖氧化酶為空白對照。

1.3.4.4 α-半乳糖甘酶對Neu5Gc的解離效果

準(zhǔn)確稱取0.01g α-半乳糖苷酶溶于1 mL超純水中，取250 μL酶液加入200 μL 1 mmol/L的Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)液中，加入450 μL超純水，37 ℃水浴30 min后，再加入100 μL衍生劑，0.22 μm過濾后，待測，并以未添加α-半乳糖甘酶為空白對照。

1.3.4.5 α-乙酰乳酸脫羧酶對Neu5Gc的解離效果

準(zhǔn)確吸取α-乙酰乳酸脫羧酶50 μL于200 μL 1 mmol/L的Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)液中，加入650 μL超純水，35 ℃水浴2 h后加入100 μL衍生劑，0.22 μm膜過濾后，衍生，檢測，并以未添加α-乙酰乳酸脫羧酶為空白對照。

1.3.4.6 β-半乳糖甘酶對Neu5Gc的解離效果

將1 kU β-半乳糖甘酶溶于1 mL超純水中，取300 μL酶液加入300 μL 1 mmol/L的Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)液中，加入300 μL超純水，40 ℃水浴2 h后，加入100 μL衍生劑，0.22 μm膜過濾后，衍生，待測，并以未添加β-半乳糖甘酶為空白對照。

1.3.4.7 菊粉酶對Neu5Gc的解離效果

準(zhǔn)確吸取200 μL 1 mmol/L的Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)液，加入700 μL超純水，按質(zhì)量分?jǐn)?shù)添加0.6%菊粉酶，50 ℃水浴30 min后，加入100 μL衍生劑，0.22 μm膜過濾后，衍生，待測，并以未添加菊粉酶為空白對照。

1.3.4.8 谷胱甘肽過氧化物酶對Neu5Gc的解離效果

將0.63 mg谷胱甘肽過氧化物酶溶于1 mL水中，準(zhǔn)確吸取500 μL于300 μL 1 mmol/L的Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)液中，加入100 μL超純水，37 ℃水浴3 h后，加入100 μL衍生劑，0.22 μm膜過濾后，衍生，待測，并以未添加谷胱甘肽過氧化物酶為空白對照。

1.3.5 菊粉酶解離Neu5Gc條件的優(yōu)化

1.3.5.1 水浴時間對菊粉酶解離Neu5Gc的影響

準(zhǔn)確吸取200 μL 1 mmol/L的Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)液，加入700 μL超純水，菊粉酶添加量為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.6%，于50 ℃分別水浴10、30、60、90、120、150 min后加入100 μL衍生劑，0.22 μm膜過濾后，衍生，待測。

1.3.5.2 水浴溫度對菊粉酶解離Neu5Gc的影響

準(zhǔn)確吸取200 μL 1 mmol/L的Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)液，加入700 μL超純水，菊粉酶添加量為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.6%，分別于30、35、40、45、50、55 ℃水浴30 min后加入100 μL衍生劑，0.22 μm膜過濾后，衍生，待測。

1.3.5.3 菊粉酶添加量對菊粉酶解離Neu5Gc的影響

準(zhǔn)確吸取200 μL 1 mmol/L的Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)液，加入700μL超純水，菊粉酶添加量分別為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%，50 ℃水浴30 min后加入100 μL衍生劑，0.22 μm膜過濾后，衍生，待測。

1.3.5.4 菊粉酶解離Neu5Gc條件的正交試驗(yàn)

在各單因素最適條件的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化菊粉酶解離Neu5Gc的最優(yōu)作用條件。正交試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計因素與水平Table 1 Factors and their coded and actual levels used in orthogonal array design

1.3.6 不同處理方式對Neu5Gc解離效果的影響

1.3.6.1 油炸溫度對牛肉中Neu5Gc含量的影響

將牛里脊切成3 mm厚度均勻的切片，分別于100、125、150、175、200 ℃油溫中恒溫油炸1 min，油炸后分別準(zhǔn)確取1 g，按照1.3.3節(jié)方法對不同溫度油炸后的牛肉進(jìn)行處理，待測。為計算不同溫度油炸后牛肉中水分的損失率，每片牛肉切片油炸前后都需稱質(zhì)量。

1.3.6.2 蒸煮時間對牛肉湯中Neu5Gc含量的影響

取5 g牛里脊放入25 mL小燒杯中，加入10 mL水，蓋上保鮮膜，待水沸后放入鍋中分別蒸煮10、30、60、120、180 min。冷卻后取出肉，將肉湯進(jìn)行冷凍干燥，干燥后加入10 mL的2 mol/L醋酸溶液，80 ℃水浴3 h，冷卻后13 000 r/min離心15 min，取上清液，再次進(jìn)行冷凍干燥，凍干后加入0.8 mL超純水復(fù)溶，再加入0.2 mL 0.1 mol/L的NaOH溶液，37 ℃水浴30 min去乙?；?，吸取900 μL加入100 μL衍生劑，0.22 μm膜過濾后，衍生，待測。

1.3.7 標(biāo)準(zhǔn)曲線與工作曲線的繪制

1.3.7.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取0.032 5 g Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)品，溶解于100 mL超純水中，配成1 mmol/L Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別取濃度為1 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液50、100、200、300、400 μL按照表2配成待衍生的混合液，衍生后采用HPLC檢測，不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品分別進(jìn)樣3 次，以3 次峰面積的平均值為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。

表2 不同濃度Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)溶液配制Table 2 Preparation of Neu5Gc standard solutions of different concentrations

1.3.7.2 工作曲線的繪制

分別取濃度為1 mmol/L的標(biāo)準(zhǔn)溶液10、50、100、200、400 μL加入10 mL 30%的飽和硫酸銨溶液后進(jìn)行冷凍干燥。冷凍干燥后分別加入10 mL 2 mol/L醋酸溶液于80 ℃水浴3 h，再進(jìn)行冷凍干燥除去醋酸。冷凍干燥完畢后溶于0.8 mL水中，加入0.2 mL 0.1 mol/L NaOH溶液于37 ℃水浴30 min。精確吸取處理后的樣液900 μL，加入100 μL衍生液，用0.22 μm膜過濾后，衍生，待測。

1.3.8 解離率的計算

經(jīng)不同方式處理后的樣品中Neu5Gc的解離率按下式進(jìn)行計算：

式中：C0為空白對照中Neu5Gc含量或者峰面積；C1為不同方式處理后樣品中Neu5Gc的含量或者峰面積。

1.4 數(shù)據(jù)處理

繪圖以及統(tǒng)計分析均采用Origin 9.6軟件進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線與工作曲線方程

在已有的對肉樣Neu5Gc含量的檢測研究中，直接將肉用酸水解[19]，肉中的蛋白質(zhì)遇酸發(fā)生凝膠變性，對HPLC檢測前的過濾工作帶來極大的困難，樣品損失嚴(yán)重造成結(jié)果偏小甚至過濾不出造成實(shí)驗(yàn)失敗。本實(shí)驗(yàn)對肉樣的預(yù)處理進(jìn)行了優(yōu)化，先使用30%飽和硫酸銨溶液沉淀蛋白質(zhì)后再進(jìn)行酸水解，解決了肉樣遇酸凝膠變性的問題，避免了樣品的損失，更好地保證所得數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。實(shí)驗(yàn)中所涉及到對標(biāo)準(zhǔn)品的處理方式不同以及對肉樣處理方式不同，肉樣的前處理又較繁瑣和復(fù)雜，因此分別繪制了標(biāo)準(zhǔn)曲線和工作曲線，能更準(zhǔn)確地反映出不同方式處理后的標(biāo)準(zhǔn)液以及肉樣中的Neu5Gc含量。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=2.691 21x－14.386 27，R2=0.999 12，標(biāo)準(zhǔn)品在50～400 μmol/L濃度范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系；工作曲線方程為y=4.155 38x－30.060 11，R2=0.999 23，標(biāo)準(zhǔn)品在10～400 μmol/L濃度范圍內(nèi)，峰面積與濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.2 不同紅肉及加工肉制品中Neu5Gc的含量

圖1 不同種類紅肉及加工肉制品中Neu5Gc的含量Fig. 1 Neu5Gc contents in different types of red meat and meat products

如圖1所示，冷鮮牛里脊、冷鮮豬里脊、豬火腿腸、豬培根、宣威火腿、廣式香腸、貴州香腸中Neu5Gc含量分別為（58.45±0.98）、（17.31±0.44）、（14.31±0.55）、（18.12±0.68）、（23.07±2.1）、（27.88±0.36）、（43.19±0.63）μg/g。其中牛里脊肉中Neu5Gc含量最高，豬里脊、豬火腿腸以及豬培根中Neu5Gc含量較低。

2.3 油炸溫度對牛肉中Neu5Gc含量的影響

如圖2所示，隨著油炸溫度的升高，牛里脊肉中Neu5Gc的含量出現(xiàn)先增高后減小的趨勢，但相較于未經(jīng)油炸的牛肉空白組，經(jīng)油炸后Neu5Gc含量都有所增加，這是因?yàn)橛驼ㄟ^后，牛里脊肉中的水分被蒸發(fā)帶走，油炸過后牛肉中的干物質(zhì)含量增加，Neu5Gc在紅肉組織中主要以結(jié)合態(tài)的形式存在于糖蛋白和糖脂的糖基化末端[20-21]，因此，油炸過后牛肉中Neu5Gc含量有所增加。但是，由圖3可知，當(dāng)油炸溫度達(dá)到150 ℃以后，隨著牛肉中水分損失率的增加，牛肉中Neu5Gc含量的增加率反而減小，水分損失率與Neu5Gc之間的差值表現(xiàn)出增大的趨勢，這可能是因?yàn)橐环矫骐S著油炸溫度的升高，蛋白質(zhì)等收縮變性加劇，由Neu5Gc與脂質(zhì)結(jié)合的部分糖脂被油鍋中的油溶出，從而導(dǎo)致含量減少；另一方面，Neu5Gc與組織中的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)以糖苷鍵的形式結(jié)合[22-23]，當(dāng)油溫升高到150 ℃以上，油的酸價升高，pH值降低，使得結(jié)合態(tài)的Neu5Gc游離出來，與此同時油脂的氧化速率增加，在氧化過程中油脂分解產(chǎn)生的自由基或產(chǎn)物對游離出的Neu5Gc分子產(chǎn)生破壞作用，從而導(dǎo)致Neu5Gc含量減少。有資料指出當(dāng)油炸溫度大于150 ℃時，油脂開始發(fā)生氧化產(chǎn)生有害產(chǎn)物[24]。如圖4所示，隨著油炸溫度的升高，油炸后牛肉切片的L*、a*、b*值均呈現(xiàn)明顯的下降趨勢，當(dāng)油炸溫度達(dá)到175 ℃時，L*值下降至22.16±0.29，a*值下降至6.03±0.08，b*值下降至1.76±0.02，色澤差，水分含量低，感官品質(zhì)不佳。因此，綜上所述，從油炸紅肉的安全和品質(zhì)角度出發(fā)，建議對牛肉進(jìn)行油炸時，加工溫度控制在150 ℃左右。

圖2 油炸溫度對牛肉中Neu5Gc含量的影響Fig. 2 Effects of frying temperature on the content of Neu5Gc in beef

圖3 油炸溫度對牛肉中水分損失率及Neu5Gc增加率的影響Fig. 3 Effects of frying temperatures on water loss rate and Neu5Gc increase in beef

圖4 油炸溫度對牛肉色度的影響Fig. 4 Effects of frying temperature on the color of beef

2.4 蒸煮時間對牛肉湯中Neu5Gc含量的影響

如圖5所示，隨著蒸煮時間的延長，肉湯（牛里脊肉）中的Neu5Gc含量呈現(xiàn)遞增的趨勢，當(dāng)蒸煮時間達(dá)10 min后，肉湯中Neu5Gc含量增加迅速，蒸煮時間達(dá)到60 min后增加速度有所減緩，到180 min時，牛肉湯中Neu5Gc含量達(dá)（32.7±0.77）μg/10 mL。另有研究證據(jù)表明當(dāng)肉的蒸煮時間超過10 min后，肉湯中的嘌呤含量迅速增加[25]，大量攝入高嘌呤的物質(zhì)會導(dǎo)致痛風(fēng)[26-28]。因此，長時間蒸煮的肉湯中不僅含有較多的嘌呤，還含有較高含量的Neu5Gc，不建議食用長時間蒸煮后的肉湯，然而經(jīng)過高溫蒸煮后的肉，肉中的嘌呤含量減少[25]，部分Neu5Gc解離出來游離到肉湯中，肉中的Neu5Gc含量亦減少，建議食用蒸煮后的肉。

圖5 蒸煮時間對牛肉湯中Neu5Gc含量的影響Fig. 5 Effects of cooking time on the content of Neu5Gc in beef soup

2.5 酶制劑對Neu5Gc的解離效果的影響

圖6 酶制劑對Neu5Gc的解離效果Fig. 6 Dissociation effects of different enzymes on Neu5Gc

根據(jù)Neu5Gc是含有11 個碳原子并具有吡喃糖結(jié)構(gòu)的酸性氨基糖的特性，擬從食品工業(yè)糖類酶制劑中篩選出能夠解離Neu5Gc的水解酶，本實(shí)驗(yàn)通過預(yù)先添加足量的溶菌酶、葡萄糖異構(gòu)酶、葡萄糖氧化酶、α-半乳糖甘酶、α-乙酰乳酸脫羧酶、β-半乳糖甘酶、谷胱甘肽過氧化物酶以及菊粉酶，考察這8 種酶制劑對Neu5Gc的解離效果。如圖6所示，經(jīng)過溶菌酶、葡萄糖氧化酶、葡萄糖異構(gòu)酶、α-半乳糖甘酶、α-乙酰乳酸脫羧酶、β-半乳糖甘酶以及谷胱甘肽過氧化物酶作用后的Neu5Gc峰面積與未經(jīng)處理的無顯著差異（P＞0.05），說明這些酶分子中不存在能夠與Neu5Gc分子結(jié)合并起催化分解作用的活性部位。然而經(jīng)過菊粉酶處理后的Neu5Gc峰面積與空白對照之間存在顯著差異（P＜0.05），說明菊粉酶中很可能存在某個活性中心能夠結(jié)合Neu5Gc并將之解離。

2.6 菊粉酶解離Neu5Gc優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.6.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

圖7 菊粉酶作用條件的單因素試驗(yàn)結(jié)果Fig. 7 Results of one-factor-at-a-time experiments for optimization of inulinase hydrolysis conditions

由圖7A可知，當(dāng)水浴時間達(dá)到30～60 min時酶解效果較好，隨著水解時間的延長，解離效果反而下降，這很可能是因?yàn)殡S著菊粉酶的消耗，自身溫度升高會減緩酶的解離作用。由圖7B可知，隨著水浴溫度的升高，菊粉酶對Neu5Gc的解離效果也逐漸增加，當(dāng)水浴溫度在45～50 ℃之間時表現(xiàn)出較好的解離效果。由圖7C可知，隨著菊粉酶添加量的增加，其對Neu5Gc的解離效果越好，當(dāng)添加量達(dá)到0.7%后，酶解效果較佳，且解離效果不再顯著增加。

2.6.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，采用L9（34）正交試驗(yàn)優(yōu)化酶制劑的最適作用條件。由表3可知，影響Neu5Gc解離效果的主次因素順序?yàn)镃＞A＞B，菊粉酶的最適作用條件為A3B2C3，即水浴溫度50 ℃、水浴時間30 min、菊粉酶添加量0.8%。

表3 L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果Table 3 L9(34) Orthogonal array design and results

2.7 菊粉酶對Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)品及牛肉中Neu5Gc解離效果的比較

雖然上述研究表明，菊粉酶對Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)品有一定解離效果，但是肉基質(zhì)成分復(fù)雜，解離的環(huán)境條件有所不同，因此，需探究菊粉酶作用于牛肉時，其對Neu5Gc的解離效果。選取正交試驗(yàn)中獲得的最佳條件A3B2C3，并取A3B2C1以及A2B3C1兩個條件作用后的結(jié)果作對比，結(jié)果如表4所示。所得結(jié)果一方面證實(shí)了A3B2C3組合，即水浴溫度50 ℃、水浴時間30 min、菊粉酶添加量為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.8%時，對Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)品的解離效果最優(yōu)，解離率達(dá)（50.52±0.88）%，另一方面，相同的菊粉酶作用條件處理牛肉，僅當(dāng)水浴溫度50 ℃、水浴時間30 min、菊粉酶添加量為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.8%時，對牛肉中Neu5Gc有較小的解離作用，解離率僅為（7.29±2.67）%，其余條件下對牛肉中Neu5Gc均無解離效果，這可能是由于牛肉中物質(zhì)含量豐富，成分復(fù)雜，菊粉酶的活性可能受到肉中一些金屬離子的抑制，或是其中某些成分與Neu5Gc競爭菊粉酶的同一活性中心，干擾了菊粉酶與Neu5Gc的結(jié)合，牛肉基質(zhì)的pH值與Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)品溶液不同也一定程度上抑制了菊粉酶對牛肉中Neu5Gc的解離。此外，還有可能是菊粉酶處理牛肉時，由于產(chǎn)生空間位阻效應(yīng)使其催化效果降低，導(dǎo)致解離率減小。

表4 不同菊粉酶作用條件對Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)品及牛肉中Neu5Gc的解離效果Table 4 Dissociation efficiency of Neu5Gc standard and Neu5Gc in beef under different hydrolysis conditions with inulinase

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)對不同紅肉及加工肉制品中Neu5Gc的含量進(jìn)行了檢測，研究結(jié)果顯示冷鮮牛里脊、廣式香腸以及貴州香腸中Neu5Gc含量較高。

結(jié)果表明當(dāng)油炸溫度大于150 ℃時，牛肉中的Neu5Gc損失開始增大，雖然油炸溫度達(dá)到150 ℃后，隨著油炸溫度的升高，Neu5Gc的損失也隨之增大，但是，從油炸紅肉的安全和品質(zhì)角度出發(fā)，建議對紅肉進(jìn)行油炸時，加工溫度控制在150 ℃左右。

蒸煮時間的長短對肉湯中Neu5Gc的含量也有影響，隨著蒸煮時間的延長，肉湯中的Neu5Gc含量呈現(xiàn)遞增的趨勢，當(dāng)蒸煮時間達(dá)到180 min時，牛肉湯中Neu5Gc含量達(dá)（32.7±0.77）μg/10 mL。長時間蒸煮的肉湯中含有較高含量的Neu5Gc，不建議食用長時間蒸煮后的肉湯，然而經(jīng)過高溫蒸煮后的肉中的Neu5Gc含量減少，建議食用蒸煮后的肉。

本實(shí)驗(yàn)從多種酶制劑中篩選出對Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)品具有解離作用的菊粉酶，探究了菊粉酶對Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)品解離的最適作用條件，通過正交試驗(yàn)和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明當(dāng)菊粉酶水浴溫度50 ℃、水浴時間30 min、酶添加量為質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.8%時，對Neu5Gc標(biāo)準(zhǔn)品的解離效果最優(yōu)，解離率達(dá)到了（50.52±0.88）%，然而，由于牛肉成分復(fù)雜，篩選出的條件作用在牛肉基質(zhì)中，卻未有如此理想的解離效果。

本研究不僅為人們的日常飲食提供了科學(xué)指導(dǎo)，也為開展宰前宰后紅肉中Neu5Gc安全穩(wěn)妥的去除方法提供了依據(jù)。目前，關(guān)于菊粉酶解離Neu5Gc的機(jī)制尚不清楚，仍需深入探究獲取其動力學(xué)變化信息，菊粉酶作用于紅肉基質(zhì)的最適條件也需進(jìn)一步挖掘。

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