劉凱　卓鴻武　劉建忠

[摘要] 目的 分析TNF-α對成骨細胞程序性壞死的影響并分析其機制。 方法 分離并常規(guī)培養(yǎng)小鼠乳鼠成骨細胞，采用TNF-α干預誘導細胞程序性壞死，Nec-1干預抑制細胞壞死。并采用正常培養(yǎng)的成骨細胞為正常對照組。MTT法檢測細胞增殖情況；Tunel和Caspase 3雙染法檢測細胞的程序性壞死情況；Western blot檢測細胞RIP1、RIP3、MLKL蛋白表達水平。 結果 與正常對照組比較，TNF-α組增殖活性降低，程序性壞死數(shù)量增加（P < 0.05）；與TNF-α組比較，TNF-α+Nec-1組增殖活性顯著增加，程序性壞死數(shù)量降低（P < 0.05）；隨著時間延長，各組之間的差異更加顯著（P < 0.05）。與正常對照組比較，TNF-α組RIP3、MLKL蛋白表達降低（P < 0.05）；TNF-α+Nec-1組RIP3、MLKL蛋白表達高于TNF-α組（P < 0.05）。 結論 TNF-α能夠抑制成骨細胞增殖，促進細胞發(fā)生程序性壞死，這可能是通過降低成骨細胞的RIP3、MLKL蛋白表達來完成的。

[關鍵詞] 腫瘤壞死因子α；成骨細胞；程序性壞死

[中圖分類號] R684 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）03（c）-0018-05

[Abstract] Objective To explore the effect and its related mechanism of TNF-α on programmed necrosis of osteoblasts. Methods Mice osteoblasts were isolated and cultured from suckling mice， and TNF-α was used to induce programmednecrosis of osteoblasts， Nec-1 was used to inhibit cell necrosis. Normal cultured osteoblasts were used as normal control group， and MTT assay was used to detect the cell proliferation. Tunel and Caspase 3 double staining was used to detect the programmed necrosis of osteoblasts. The expression of RIP1， RIP3 and MLKL were detected by Western blot. Results Compared with the normal control group， the proliferation activity of TNF-α group was decreased and the number of programmed necrosis was increased （P < 0.05）. After the Nec-1 treatment， the proliferative activity was significantly increased compared with TNF-α group， and the number of programmed necrosis was decreased （P < 0.05）. As time went on， the differences between the groups became more pronounced （P < 0.05）. Compared with the normal control group， expression of RIP3 and MLKL protein in TNF-α group was significantly lower than that in normal control （P < 0.05）. After the Nec-1 treatment， the expression of RIP3 and MLKL protein had significantly differences compared with TNF-α group （P < 0.05）. Conclusion TNF-α can inhibit osteoblast proliferation and promote programmed necrosis of osteoblasts， which may be accomplished by reducing the expression of RIP3 and MLKL proteins in osteoblasts.

[Key words] TNF-α； Osteoblasts； Programmed necrosis

骨質疏松癥是一種全身性骨代謝性疾病，絕經(jīng)后骨質疏松是以雌激素缺乏誘導破骨細胞生成為特征的疾病，是一種炎癥過程[1-2]。絕經(jīng)后骨質疏松產(chǎn)生的原因與雌激素水平下降，炎性因子表達升高有關，他們的變化可促進破骨細胞增殖分化及細胞融合，也可抑制破骨細胞凋亡，導致骨吸收增加，最終導致成骨細胞及破骨細胞偶聯(lián)失衡，誘發(fā)骨質疏松[3]。腫瘤壞死因子α（TNF-α）能與細胞膜上腫瘤壞死因子受體（TNFR1）結合，激活多條信號通路，從而引起細胞炎性反應或者細胞死亡[4]。核轉錄因子-κB（NF-κB）作為TNF-α直接激活的下游轉錄因子，在TNF信號通路中起著不可或缺的作用。細胞程序性壞死是一類因病理而產(chǎn)生的被動死亡，發(fā)生程序性壞死的細胞表現(xiàn)為細胞膜通透性增高，細胞腫脹，細胞器變形或腫大，最后細胞破裂，因此被認為是無序的過程，無從進行調控[5]。研究指出，程序性細胞壞死的發(fā)生發(fā)展與TNFR家族有關[6-7]。本研究選取成骨細胞，采用TNF-α進行干預，分析TNF-α對成骨細胞程序性壞死的影響及機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

MTT（美國Sigma公司）；RPMI-1640培養(yǎng)基（美國Gibco公司），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；Tunel試劑盒（江蘇碧云天生物有限公司），兔抗鼠受體相互作用蛋白1（RIP1）、RIP3、混合譜系激酶結構區(qū)域樣蛋白（MLKL）多克隆抗體、辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術有限公司），Caspase 3多克隆抗體（proteintech有限公司），兔抗鼠β-actin單克隆抗體（美國Sigma公司）。

1.2 主要設備

培養(yǎng)箱（Thermo公司），二氧化碳孵箱（SANYO公司），倒置顯微鏡（Nikon公司），臺式低溫高速離心機（Beckman公司），-80℃冰箱（SANYO公司）。

1.3實驗動物

出生2～3 d的清潔級SD小鼠乳鼠30只，購自上海斯萊克公司實驗動物中心，實驗動物合格證號（1131800667）。

1.4 實驗方法

1.4.1 成骨細胞的分離培養(yǎng)及鑒定 成骨細胞采用胰蛋白酶和Ⅱ型膠原酶消化方法的從乳鼠顱骨中提取。將細胞消化成單細胞懸液，然后調整濃度到2×105個/mL濃度。吹打均勻后，接種到培養(yǎng)瓶中，置于37℃，含5% CO2培養(yǎng)箱內進行培養(yǎng)。48 h換液，棄去懸浮的死細胞，每隔2 d換液。通過細胞形態(tài)，骨鈣化結節(jié)染色和堿性磷酸酶細胞化學染色三方面對成骨細胞進行鑒定。

1.4.2 細胞培養(yǎng) 采用含有10%新生牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于5% CO2、37℃飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。將培養(yǎng)的細胞用0.25%的胰酶消化，以105個/L接種于24孔板，待細胞長至70%～80%融合狀態(tài)時，用不含血清的培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)24 h。待原代細胞長滿瓶壁后，棄去原培養(yǎng)液，加入0.25%胰酶溶液3～5 min至細胞收縮變圓，加入適量培養(yǎng)液并用彎吸管吹打細胞，使之脫落并分散成單細胞懸液。

1.4.3 實驗處理及分組 將處于對數(shù)生長期的第3代成骨細胞以1×104個/mL均勻接種于6孔培養(yǎng)板，每孔2 mL，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。TNF-α溶于滅菌的PBS溶液中，配制成TNF-α存儲液，混勻分裝，-80℃保存。正常對照組細胞正常培養(yǎng)，TNF-α組細胞給予10 μmol/L的TNF-α干預，培養(yǎng)4～6 h后換液，48 h后處理細胞。TNF-α+Nec-1組細胞除采用TNF-α進行干預外，給予程序性壞死和凋亡抑制劑Nec-1干預培養(yǎng)的成骨細胞，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.4.3 MTT法檢測成骨細胞的增殖活性變化 收集對數(shù)期生長的成骨細胞，用培養(yǎng)液調整細胞懸液的濃度，以8×104個/孔種植于細胞培養(yǎng)板上，設定溫度37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。12、24、48 h后檢測細胞活性。加入MTT溶液20 μL（5 mg/mL），孵育4 h，終止培養(yǎng)，每孔加150 μL二甲基亞砜，振蕩10 min，在酶聯(lián)免疫檢測儀570 nm處測量各孔的吸光度（A值）。以A為縱坐標，以時間（h）為橫坐標，繪制生長曲線。

1.4.4 Caspase3和Tunel雙染法檢測組成骨細胞的程序性壞死情況 成骨細胞鋪板，給予相應的藥物治療后，PBS洗3遍，然后采用福爾馬林固定10 min，之后采用山羊血清封閉20 min后，孵育Caspase 3一抗（1∶100）4℃過夜，第2天恢復到室溫后，再放置30 min，PBS沖洗后，孵育FITC標記的綠色熒光二抗，洗滌后進行常規(guī)Tunel染色，按試劑盒說明書進行。采用3%過氧化氫甲醇中浸洗10 min，用0.2% Triton孵育5 min后，用PBS洗2次，切片組織上每塊組織滴加50 μL的Tunel反應液，37℃避光孵育1 h，PBS洗3次后，在熒光顯微鏡下拍照。Caspase 3陰性Tunel陽性的細胞為壞死細胞。隨機選取10個視野，計算壞死細胞百分比。

1.4.5 Western blot檢測成骨細胞RIP1、RIP3、MLKL蛋白表達的變化 加0.1 mg/mL PMSF、抑肽酶和磷酸轉移酶抑制劑裂解細胞，加0℃ RIPA裂解液50 μL，用細胞刮仔細刮取蛋白，4℃環(huán)境下以12 000 r/m離心30 min，吸取上清，分裝后置于-80℃超低溫冰箱凍存。取提取的細胞蛋白質樣品加入等體積的2倍上樣緩沖液，100℃煮沸5 min，在5%積層膠和10% SDS-PAGE凝膠上進行電泳分離待測蛋白。10 V半干式電轉膜至PVDF膜上，根據(jù)分子量Marker觀察蛋白質轉移情況。TBST搖床上洗5 min，37℃用5%脫脂奶粉封閉2 h，加入抗兔一抗（β-actin、RIP1、RIP3、MLKL，稀釋為1∶1000）4℃孵育過夜，TBST洗滌后，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗，室溫下?lián)u床孵育1 h，TBST洗滌后，采用ECL法進行化學發(fā)光，然后用Alphalmager TM 2200進行圖像分析，結果以各目的蛋白與β-actin的灰度比值表示。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差（x±s）表示，重復測量資料采用重復測量方差分析，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 成骨細胞的增殖活性變化

處理24 h后，TNF-α組細胞增殖能力均低于正常對照組（P < 0.05），TNF-α+Nec-1組細胞增殖能力高于TNF-α組（P < 0.05）。處理48 h后，各組細胞增殖趨勢沒有變化，但各組間差異進一步放大（P < 0.05）。見圖1。

2.2 Tunel和Caspase 3雙染法檢測成骨細胞的程序性壞死情況

TNF-α組細胞程序性壞死數(shù)量高于正常對照組（P < 0.05）；TNF-α+Nec-1組成骨細胞程序性壞死數(shù)量低于TNF-α組（P < 0.05）。見表1。

2.3 成骨細胞RIP1、RIP3、MLKL蛋白的表達

在處理12 h和24 h時，與正常對照組比較，TNF-α組成骨細胞RIP1表達差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），而RIP3、MLKL蛋白表達降低（P < 0.05）；與TNF-α組比較，TNF-α+Nec-1組成骨細胞RIP1表達差異無統(tǒng)計學意義（P > 0.05），RIP3、MLKL蛋白表達明顯上調（P < 0.05）。到48 h時，TNF-α組RIP1表達明顯低于正常對照組，TNF-α+Nec-1組成骨細胞RIP1表達高于TNF-α組，差異有統(tǒng)計學意義（P < 0.05）。見圖2。

3 討論

隨著人口的老齡化，骨質疏松癥已成為中老年人骨痛、骨折的主要原因。目前，治療骨質疏松的主要藥物是雌激素和二膦酸鹽為代表的抗骨吸收的藥物，但治療效果不盡如人意。探索骨質疏松癥的發(fā)生機制，尋求更為有效的治療方式是近幾年來研究者們的關注重點。

細胞的死亡機制一直是生物醫(yī)學研究的核心熱點之一，目前公認的主要細胞死亡類型有“壞死”“凋亡”和“自噬”三種[8]。特別的是凋亡和自噬均需要能量和合成新的蛋白質，是一個細胞自我調控的主動過程，因此也被稱為“程序性死亡”[9]，而細胞程序性壞死，則是一個被動的過程。其中由TNF-α介導的細胞壞死的分子機制及其在炎癥等病理過程中的作用研究較多。本研究重點分析TNF-α對成骨細胞程序性細胞死亡的影響及機制。

本研究選取小鼠乳鼠，分離培養(yǎng)成骨細胞，采用TNF-α干預的動物作為模型動物處理，加入程序性壞死和凋亡抑制劑Nec-1干預的動物作為實驗動物處理，正常對照組為常規(guī)培養(yǎng)成骨細胞。首先檢測成骨細胞的增殖活性變化，TNF-α組細胞的增殖活性較正常對照組降低，TNF-α+Nec-1組在相同時間段的細胞增殖活性高于TNF-α組，但低于正常對照組，隨著時間延長，TNF-α+Nec-1組細胞增殖活性略有升高。有研究指出，程序性壞死過程可被RIP1激酶抑制劑Nec-1阻斷，Nec-1是最早鑒定的壞死抑制劑，可特異性抑制RIP1的激酶活性[10-11]。提示TNF-α能夠抑制成骨細胞的增殖活性，細胞程序性和凋亡抑制劑Nec-1能夠對TNF-α的抑增殖效應產(chǎn)生一定的抑制作用。本研究進一步檢測成骨細胞的程序性壞死情況，TNF-α組的細胞程序性壞死數(shù)量高于正常對照組，細胞出現(xiàn)損傷；TNF-α+Nec-1組成骨細胞程序性壞死數(shù)量低于TNF-α組，但高于正常對照組；隨著時間延長，TNF-α+Nec-1組細胞程序性壞死數(shù)量略有升高。研究表明，細胞壞死是一種受到精密調控的“新型”程序性細胞死亡方式[12]。當細胞凋亡不能正常發(fā)生而細胞必須死亡時，壞死可以作為凋亡的“替補”方式被激活。相關研究提示，程序性細胞壞死在中風、心肌梗死、缺血/再灌注損傷、動脈硬化等多種人類疾病病理學中發(fā)揮著重要的作用[13-15]。在非酒精性脂肪性肝病患者中程序性壞死升高，脂肪型肝炎的動物模型中TNF-α導致的氧化應激損傷有RIP3依賴的肝細胞程序性壞死發(fā)生[16]。本研究結果提示，TNF-α能夠促進成骨細胞的發(fā)生程序性細胞壞死，Nec-1能夠抑制成骨細胞的程序性壞死發(fā)生。為了研究TNF-α對成骨細胞程序性細胞死亡的影響機制，本研究最后檢測成骨細胞RIP1、RIP3、MLKL蛋白的表達，相同時間段比較，在12 h和24 h各組成骨細胞RIP1表達無明顯改變；TNF-α組RIP3、MLKL蛋白表達正常對照組，TNF-α+Nec-1組RIP3、MLKL蛋白表達高于TNF-α組。既往研究指出，程序性細胞壞死主要由TNFR家族以及Toll樣受體家族啟動，并通過和受體蛋白相互作用的兩個蛋白激酶RIP1和RIP3傳遞死亡信號，募集并磷酸化MLKL，而MLKL作為細胞死亡的執(zhí)行者，最終會導致壞死的發(fā)生，壞死的細胞會向周圍釋放其內容物，這些內容物作為DAMPs可刺激周圍細胞發(fā)生炎性反應，激活機體免疫應答[17-18]。研究表明，TNF-α既可以通過激活NF-κB誘導細胞生存途徑，也可以通過RIP1誘導Caspases依賴性的細胞凋亡，RIP1在該信號通路中的功能相當是下游信號通路的一個支架蛋白是不依賴于其激酶活性的[19]。當RIP3和MLKL的表達水平足夠高時，RIP3和RIP1會通過它們各自的RHIM結構域相互結合，活化的RIP3募集MLKL，激活壞死途徑[20]。本研究結果表明，TNF-α可能是通過降低成骨細胞的RIP3、MLKL蛋白表達來達到抑制成骨細胞增殖，促進成骨細胞發(fā)生程序性壞死的目的，而Nec-1能夠對TNF-α的效應產(chǎn)生一定的抑制作用。

可見，TNF-α能夠抑制成骨細胞的增殖活性，促進成骨細胞的發(fā)生程序性細胞壞死，細胞程序性和凋亡抑制劑Nec-1能夠對TNF-α的抑增殖和促凋亡效應產(chǎn)生一定的抑制作用，這可能是通過降低成骨細胞的RIP3、MLKL蛋白表達來完成的。骨質疏松癥在臨床上較為常見，發(fā)病率高，如何通過進一步的研究及分析尋找更為有效的治療手段對臨床治療來說至關重要。未來可進一步從分子、基因角度進行分析，探索更多的細胞因子、蛋白基因與骨質疏松癥發(fā)生發(fā)展的關系及相關的信號通路調控，以求探索到更佳的診療方向，促進患者恢復健康。

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（收稿日期：2018-02-15 本文編輯：李岳澤）