廖欣　鄒娟　黃安亮

[摘要] 目的 明確少見類型的宮頸癌患者HPV感染亞型種類，以期評估HPV疫苗對這組宮頸癌的預防效果。 方法 收集2014年9月～2017年9月就診于四川大學華西二院的少見類型宮頸癌患者病例，HPV基因分型檢測采用PCR和Luminex流式熒光技術(shù)進行，分析HPV感染情況及基因型分布，經(jīng)計算特定HPV亞型的陽性比例來評價HPV亞型對宮頸癌的相對貢獻。采用比例權(quán)重歸因（PWA）方法將多重感染中亞型占比折算至相應的單型別感染。 結(jié)果 納入病例143例，HPV陽性數(shù)為130例，陽性率90.91%，其中黏液腺癌60例（46.15%）、腺鱗癌46例（35.38%）、神經(jīng)內(nèi)分泌癌8例（6.15%）和混合類型16例（12.31%），其中單一感染109例（83.84%），多重感染為21例（16.15%），HPV16和18亞型為各組中占比最大的亞型，在黏液腺癌、腺鱗癌、神經(jīng)內(nèi)分泌癌和混合類型中分別是85.88%、93.39%、100.00%和83.32%。 結(jié)論 HPV16/18亞型是這組少見類型宮頸癌患者感染的主要亞型，九價疫苗對于本組宮頸癌的預防效果有一定提高。

[關(guān)鍵詞] 基因分型；宮頸癌；黏液腺癌；腺鱗癌；神經(jīng)內(nèi)分泌癌；疫苗

[中圖分類號] R737.33 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）03（c）-0085-04

[Abstract] Objective To provide more evidence for the estimation of potential impact of HPV vaccine， by analyzing the distribution of HPV genotypes in unusual types of cervical cancer. Methods From September 2014 to September 2017， in West China Second Hospital of Sichuan University， unusual types of cervical cancer were collected， HPV genotyping was done by use of PCR and Luminex fluorescence technique. Relative contribution of HPV types in ICCs was expressed as the percentages of type-specifc cases among HPV-positive cases. Multiple infections were incorporated into single infection using the method of proportional weighting attribution （PWA）. Results In the study， 143 invasive cervical cancer cases were included， and 130 （90.91%） cases were positive for HPV DNA， among them， 60 （46.15%） cases were adenocarcinoma （ADC）， 46 （35.38%） cases were adenosquamous cell carcinoma （ADSCC）， 8 （6.15%） cases were neuroendocrine carcinoma （NECA） and 16 （12.31%） cases were mixed type， 109 （83.84%） cases were present as single infections and 21 （16.15%） cases were present as multiple infections. HPV types 16 and 18 were the major types in each histological group. The PWA of HPV 16/18 to ADC， ADSCC， NECA and mixed type were 85.88%， 93.39%， 100.00% and 83.32%， respectively. Conclusion HPV 16 and 18 infections are predominant in these unusual types of cervical cancer. The 9-valent HPV vaccine has some improvement for prevention of these unusual types of cervical cancer.

[Key words] Genotype； Uterine cervical cancer； Adenocarcinoma； Adenosquamous cell carcinoma； Neuroendocrine carcinoma； Vaccine

浸潤性宮頸癌（invasive cervical cancer，ICC）是世界范圍內(nèi)女性第4常見的惡性腫瘤[1-2]，人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，高危亞型HPV的持續(xù)感染是絕大多數(shù)ICC發(fā)生的必須因素[3-4]，而注射HPV疫苗是宮頸癌預防的有效措施[5-6]。目前，國內(nèi)對于HPV感染與腫瘤相關(guān)性的研究大多數(shù)集中于宮頸鱗狀細胞癌及其癌前病變中，對于其他HPV感染相關(guān)的組織學類型的宮頸癌，如黏液腺癌（胃型腺癌除外）、腺鱗癌、神經(jīng)內(nèi)分泌癌等的研究較少，單獨針對這些類型宮頸癌HPV感染情況的研究則幾乎沒有。本研究對經(jīng)病理確診的143例非鱗癌類HPV感染相關(guān)宮頸癌石蠟包埋組織進行以PCR為基礎(chǔ)的分型檢測，旨在探討HPV不同亞型和不同類型宮頸癌之間的關(guān)系，以期為HPV疫苗篩選和宮頸癌防治提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2014年9月～2017年9月四川大學華西第二醫(yī)院收治并完成根治手術(shù)的143例宮頸癌患者，所有患者均完成病理學診斷，其石蠟標本經(jīng)連續(xù)切片后仍保留有目標組織，且所有標本β-globin檢測均為陽性。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，所有患者和/或家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 儀器及試劑 采用儀器為LifeECO基因擴增儀和Luminex 200多功能流式點陣儀（配套使用透景HPV專用分析軟件）。試劑為上海透景人乳頭狀瘤病毒核酸分型檢測試劑盒（流式熒光雜交法）

1.2.2 樣本DNA提取 每例樣本收集25～100 mg石蠟切片組織，采用組織基因組DNA提取試劑盒，按照試劑盒操作規(guī)程提取DNA模板待用。

1.2.3 PCR 擴增 每份PCR反應液包含10 μL預混液，5 μL引物混合液和0.8 μL聚合酶，充分混勻后瞬時離心，取15 μL加入PCR 反應板反應孔中，再取上清樣本DNA模板、陽性質(zhì)控和陰性質(zhì)控各5 μL加入相應反應孔，混勻瞬離后再放入PCR儀進行擴增。擴增條件：95℃ 5 min，1個循環(huán)；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，5個循環(huán)；95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，35個循環(huán)；72℃ 3 min。

1.2.4 熒光素微球雜交 在反應板雜交孔中分別加入22 μL微球雜交液和3 μL樣本PCR擴增產(chǎn)物，混勻后封板，放入PCR儀中進行雜交。95℃變性5 min；48℃雜交30 min；每孔加入75 μL熒光標記的鏈霉親和素-藻紅蛋白，重新封板，48℃孵育15 min。

1.2.5 上機檢測 將孵育好的雜交板轉(zhuǎn)移至預熱好的Luminex 200多功能流式點陣儀上進行檢測和結(jié)果分析，具體操作流程和結(jié)果判讀按試劑、儀器說明書進行。本研究檢測27種HPV基因型，包括17種高危亞型（16、18、26、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、82）和 10種低危亞型（6、11、40、42、43、44、55、61、81、83）。

1.2.6 宮頸癌的病理學診斷 根據(jù)2014版世界衛(wèi)生組織女性生殖器官腫瘤分類對入選病例進行組織學診斷和分類，分為黏液腺癌（非胃型）、腺鱗癌、神經(jīng)內(nèi)分泌癌和混合類型[7]。

1.2.7 觀察指標及評價標準 通過計算特定宮頸癌亞型內(nèi)HPV陽性患者中某單一HPV亞型陽性患者的比例來評價HPV亞型對該型宮頸癌的相對貢獻。由于HPV存在多重感染現(xiàn)象，如逐個累計特定HPV亞型在單一感染和多重感染患者中出現(xiàn)的次數(shù)，總感染頻次將超過總例數(shù)。在發(fā)生多重感染時，每個亞型HPV對腫瘤發(fā)生的相對貢獻需要準確評估，Stoler等[8]的研究證實，在一個細胞中存在多個亞型HPV感染時，只有一種亞型發(fā)生轉(zhuǎn)錄并具有治病性。因此，Insinga等[9]提出在分析某種HPV亞型分布時除計算該亞型單型別感染次數(shù)/比例外，對多重感染患者采用比例權(quán)重歸因（proportional weighting attribution，PWA）的分析方法，即將多重感染按同類型病變中相應單型別感染的比例折算為單個亞型感染的頻次。例如，如果存在2例HPV16和HPV18二重感染患者，組中HPV16單型別感染和HPV18單型別感染分別占所有單型別感染的60%和20%，那么按比例權(quán)重歸因計算HPV16感染的頻次為1.50[2×60/（60+20）]，HPV10感染的頻次為0.50[2×20/（60+20）]，最后計算所得2例總計感染頻次仍然為2。本研究中對多重感染HPV病例采用了這種計算方法。

2 結(jié)果

2.1 組織病理學分型

在納入的161例患者中，去除合并宮頸鱗狀細胞癌癌前病變，即鱗狀上皮內(nèi)瘤變（CIN）的18例，實際納入143例，其中HPV陽性為130例，陽性率為90.91%，年齡26～68歲，平均年齡45.76歲，中位數(shù)46歲，分別為黏液腺癌60例（46.15%）、腺鱗癌46例（35.38%）、神經(jīng)內(nèi)分泌癌8例（6.15%）和混合類型16例（12.31%），混合類型中神經(jīng)內(nèi)分泌+腺鱗癌7例（5.38%），神經(jīng)內(nèi)分泌+黏液腺癌9例（6.92%）。

2.2 HPV感染的一般情況

在130例HPV陽性患者中，檢測出的HPV亞型共13型，其中高危亞型11型，分別為16、18、33、39、45、51、52、58、59、66和68；低危亞型2型，分別為43和55。HPV感染主要為單一感染，其中HPV單一亞型感染為109例（83.84%），多重感染為21例（16.15%），包括一例三重感染，其余均為二重感染，其中HPV66， 68均為混合感染。各組的多重感染率分別是黏液腺癌10例（7.69%）、腺鱗癌5例（3.85%）、神經(jīng)內(nèi)分泌癌3例2.31%和混合類型癌3例（2.31%）。見表1。

2.3 HPV各亞型在不同類型宮頸癌中的分布

采用PWA方法對混合感染亞型中各個亞型進行比例權(quán)重計算，其PWA占比詳見表2。在各組中，除了神經(jīng)內(nèi)分泌癌組以HPV18為最常見感染亞型外，其余各類亞型均以HPV16是最常見亞型；而HPV16和18亞型為各組中占比最大的亞型，黏液腺癌占85.88%，腺鱗癌占93.39%，神經(jīng)內(nèi)分泌癌占100%，混合類型占83.32%。

3 討論

HPV感染為絕大部分ICC發(fā)生的首要因素，注射HPV疫苗為預防ICC發(fā)生的有效措施。已知HPV病毒約有40種亞型與生殖道感染有關(guān)[10]，且在不同組織學類型的ICC中感染分布情況不同，而HPV疫苗不可能覆蓋所有亞型，因此分析不同類型宮頸癌的患者人群的HPV感染情況可為HPV疫苗研制提供依據(jù)。同時，隨著宮頸細胞學檢查的廣泛推廣，鱗狀細胞癌發(fā)生率有所下降[11-12]，但腺癌和神經(jīng)內(nèi)分泌癌等少見類型的宮頸癌發(fā)生率呈上升趨勢[11，13]。故研究這類宮頸癌中HPV感染情況并進行針對性預防具有重要意義。

HPV16及18亞型為鱗狀細胞癌及其癌前病變的主要感染亞型，約占70%[1，14-15]，其他類型如腺癌、神經(jīng)內(nèi)分泌癌等由于病例數(shù)較少，其數(shù)據(jù)較少，目前開發(fā)的疫苗能否發(fā)揮良好的保護作用還有待進一步評估。Li等[14]對全世界范圍內(nèi)文獻報道的30 848例宮頸癌進行分析研究表明，對于鱗狀細胞癌及其癌前病變，HPV感染的最常見亞型是16和18，所占比例分別是57%和16%，兩者總占比73%。在另一項大宗的病例研究中，de Sanjose等[15]收集了來自38個國家10 575例的宮頸癌患者的石蠟包埋組織進行HPV分型檢測，鱗癌HPV感染的最常見亞型也是16和18，所占比例分別是66%和7%，兩者總占比73%。Pirog等[16]對760例（目前為止最大宗相關(guān)研究）宮頸腺癌腫瘤組織進行HPV檢測發(fā)現(xiàn)，經(jīng)典黏液腺癌（普通型）HPV陽性率為71.8%，其他類型HPV陽性率較低，HPV16、18及45是感染的主要亞型，占94.1%，16和18亞型占82.5%。Castle等[17]對143篇文獻進行meta分析發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)神經(jīng)內(nèi)分泌癌與HPV感染有關(guān)，85%小細胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌和88%大細胞神經(jīng)內(nèi)分泌癌與HPV感染有關(guān)，其感染的主要亞型為HPV16和18亞型，這兩種類型中單一感染亞型均為18型占優(yōu)。在本組宮頸癌患者中，整體上HPV16及18亞型占比仍顯著占優(yōu)，與前述文獻中報道的宮頸癌HPV感染情況一致，且在本文統(tǒng)計的4個非鱗癌的宮頸癌類型中，HPV16及18亞型的總占比高達83.32%～100%，提示HPV16/18感染依然是這些少見類型宮頸癌的主要致病因素，其權(quán)重甚至高于文獻報道[14-15]的在宮頸鱗狀細胞癌中的權(quán)重；在神經(jīng)內(nèi)分泌癌中，HPV18亞型占比高于16亞型，與文獻[17]中報道相符。

不同亞型HPV編碼外殼蛋白的基因變異很大，且HPV各亞型之間幾乎沒有交叉保護抗體，因此容易造成不同亞型HPV多重感染。目前有研究表明， HPV多重感染也是宮頸癌的高危因素，HPV多重感染可能會影響病毒的致病能力，并最終關(guān)系到宮頸癌病程的進展和嚴重程度[18-20]。Lee等[18]的研究表明，單一HPV感染使宮頸癌的患病風險增加19.9倍，而多重HPV感染使該風險增加到31.8倍。在de Sanjose等[15]的研究中，宮頸鱗狀細胞癌的多重感染率為7%，在本組患者中，整體多重感染率為16.15%，其中侵襲性最強的神經(jīng)內(nèi)分泌癌高達37.50%，其余各組的多重感染率在各組中分別是黏液腺癌16.67%、腺鱗癌10.87%和混合類型癌18.75%。但多重感染率的差異是否與疾病類型有關(guān)，仍需更多病例及進一步的研究證實。

美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）先后批準上市的HPV預防性疫苗有3種，分別為針對HPV16和18亞型的二價疫苗Cervarix、針對HPV 6、11、16和18亞型的四價疫苗Gardasil以及針對HPV 6、11、16、18、31、33、45、52和58亞型的九價疫苗Gardasil 9。本研究通過計算HPV二價疫苗、四價疫苗和九價HPV疫苗所針對的hrHPV亞型對這些類型宮頸癌的相對貢獻，初步評估了這三類疫苗對本組的宮頸癌的預防作用。四價疫苗與二價疫苗相比，增加了6和11兩個亞型，但這兩個亞型的感染并未出現(xiàn)在本組病例中，故對于本組病例，該兩類疫苗的預防效能基本相當。而九價疫苗針對的7種hrHPV亞型對本組宮頸癌的相對貢獻較二價及四價疫苗有一定增長，其增長度分別是黏液腺癌10.59%、腺鱗癌2.17%和混合類型11.11%，在黏液腺癌和混合類型中提高最為明顯，提示九價疫苗對預防這兩種類型的宮頸癌的發(fā)生可能較二價及四價疫苗更為有效，對于腺鱗癌的預防作用也有所提升，但較為有限。本組患者中，還存在九價疫苗HPV亞型中沒有覆蓋的亞型，如39、43、59型，提示這類患者即使在接種九價疫苗后，這些少見類型的宮頸癌的發(fā)病風險仍不容忽視。

綜上所述，非鱗癌類宮頸癌，其HPV感染亞型及感染模式可能與宮頸鱗癌有一定差異，九價HPV疫苗可能對這些類型的宮頸癌有更好的預防作用。但由于樣本數(shù)量數(shù)量仍然有限，且只納入了本院病例，故尚需多中心合作，以期獲取更多地區(qū)樣本數(shù)據(jù)進行綜合分析比對，為HPV疫苗的研發(fā)提供更多理論依據(jù)。

[參考文獻]

[1] Ferlay J，Soerjomataram I，Dikshit R，et al. Cancer incidence and mortality worldwide：sources，methods and major patterns in GLOBOCAN 2012 [J]. Int J Cancer，2015， 136（5）：E359-E386.

[2] Plummer M，de Martel C，Vignat J，et al. Global burden of cancers attributable to infections in 2012：a synthetic analysis [J]. Lancet Glob Health，2016，4（9）：e609-e616.

[3] Mu？觡oz N，Bosch FX，de Sanjosé S，et al. Epidemiologic classification of human papillomavirus types associated with cervical cancer [J]. N Engl J Med，2003，348（6）：518-527.

[4] Bansal A，Singh MP，Rai B. Human papillomavirus-associated cancers：a growing global problem [J]. Int J Appl Basic Med Res，2016，6（2）：84-89.

[5] FUTURE Ⅱ Study Group. Quadrivalent vaccine against human papillomavirus to prevent high-grade cervical lesions [J]. N Engl J Med，2007，356（19）：1915-1927.

[6] Joura EA，Giuliano AR，Iversen OE，et al. A 9-valent HPV vaccine against infection and intraepithelial neoplasia in women [J]. N Engl J Med，2015，372（19）：711-723.

[7] Kurman RJ，Carcangiu ML，Herrington CS，et al. WHO Classification of Tumors of Female Reproductive Organs [M]. Lyon：IARC Press，2014：183-198.

[8] Stoler MH，Srodon M，Baber GB，et al. The frequency and biology of multiple HPV infection in vulvar neoplasia. USCAP Abstract 954 [J]. Mod Pathol，2005，18：205A.

[9] Insinga RP，Liaw KL，Johnson LG，et al. A systematic review of the prevalence and attribution of human papillomavirus types among cervical，vaginal，and vulvar precancers and cancers in the United States [J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2008，17（7）：1611-1622.

[10] Bzhalava D，Guan P，F(xiàn)ranceschi S，et al. A systematic review of the prevalence of mucosal and cutaneous human papillomavirus types [J]. Virology，2013，445（1）：224-231.

[11] Bray F，Loos AH，McCarron P，et al.Trends in cervical squamous cell carcinoma incidence in 13 European countries：changing risk and the effects of screening [J]. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev，2005，14 （3） ：677-686.

[12] Oh CM，Jung KW，Won YJ，et al. Trends in the incidence of in situ and invasive cervical cancer by age group and histological type in Korea from 1993 to 2009 [J]. PLoS One，2013，8（8）：e72012.

[13] Li S，Zhu H. Twelve cases of neuroendocrine carcinomas of the uterine cervix：cytology，histopathology and discussion of their histogenesis [J]. Acta Cytol，2013，57（1）：54-60.

[14] Li N，F(xiàn)ranceschi S，Howell-Jones R，et al. Human papillomavirus type distribution in 30，848 invasive cervical cancers worldwide：Variation by geographical region，histological type and year of publication [J]. Int J Cancer，2011，128（4）：927-935.

[15] de Sanjose S，Quint WG，Alemany L，et al. Human papillomavirus genotype attribution in invasive cervical cancer：a retrospective cross-sectional worldwide study [J]. Lancet Oncol，2010，11（11）：1048-1056.

[16] Pirog EC，Lloveras B，Molijn A，et al. HPV prevalence and genotypes in different histological subtypes of cervical adenocarcinoma，a worldwide analysis of 760 cases [J]. Mod Pathol，2014，27（12）：1559-1567.

[17] Castle PE，Amanda PA，Mark HS. A systematic review and meta-analysis on the attribution of human papillomavirus （HPV） in neuroendocrine cancers of the cervix[J]. Gynecol Oncol ，2018，148（2）：422-429.

[18] Lee SA，Kang D，Seo S，et al. Multiple HPV infection in cervical cancer screened by HPV DNA chip [J]. Cancer Lett，2003，198（2） ：187-192.

[19] Tran LT，Tran LT，Bui TC，et al. Risk factors for high-risk and multiple human papillomavirus infections among women in Ho Chi Minh City，Vietnam：a cross-sectional study [J]. BMC Womens Health，2015，15（1）：172-180.

[20] Spinillo A，Bello BD，Alberizzi P，et al. Clustering patterns of human papillomavirus genotypes in multiple infections [J]. Virus Res，2009，142（1-2）：154-159.

（收稿日期：2017-12-12 本文編輯：蘇 暢）