遲苗苗 王志玉

250012濟(jì)南,山東大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院病毒學(xué)研究室

副粘病毒是一科重要的人類致病病毒,為有包膜不分節(jié)段的單股負(fù)鏈RNA病毒。該科病毒包括[1]麻疹病毒(meals virus,MeV)、腮腺炎病毒(mumps virus,MuV)、副流感病毒(parainfluenza viruses,PIVs)、呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)、新城疫病毒(newcastle disease virus,NDV)、人偏肺病毒(human metapneumovirus,hMPV)及亨德拉病毒(hendra viruse,HeV)和尼帕病毒(nipah viruse,NiV)等。其中的MeV只感染人類,盡管具備安全可行的疫苗,全球每年仍有超過(guò)12萬(wàn)的兒童受到感染而死亡。NDV可引發(fā)家禽烈性傳染病,造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失,還可造成人類結(jié)膜炎感染。HeV和NiV是一種新發(fā)人獸共患病的病原體,其病死率可高達(dá)90%。新發(fā)傳染病監(jiān)測(cè)在蝙蝠體內(nèi)新發(fā)現(xiàn)了66種副粘病毒[1],雖然目前的致病情況尚不清楚,但具有很大的致病威脅。所以研究其致病機(jī)制和防治對(duì)策仍是當(dāng)務(wù)之急,以便疫情發(fā)生時(shí)從容應(yīng)對(duì)。

副粘病毒的病毒包膜與細(xì)胞膜融合后,病毒核酸-蛋白復(fù)合物釋放進(jìn)入靶細(xì)胞啟動(dòng)感染。膜融合是病毒完成細(xì)胞入侵并進(jìn)行細(xì)胞間傳播的重要機(jī)制。除肺病毒亞科(RSV和hMPV)外,大多數(shù)副粘病毒的膜融合過(guò)程需要融合蛋白(Fusion protein,F)和吸附蛋白的共同參與。吸附蛋白與細(xì)胞表面的受體結(jié)合后,可以激活F蛋白,后者進(jìn)行一系列的構(gòu)象改變來(lái)完成病毒包膜與細(xì)胞膜及細(xì)胞膜之間的融合。但是,吸附蛋白如何將受體信號(hào)傳遞給F蛋白,并激活F蛋白,引發(fā)細(xì)胞融合?其確切機(jī)制尚不清楚。副粘病毒膜融合發(fā)生的過(guò)程及其參與組分提示吸附蛋白、F蛋白及二者之間的相互作用可能造成了副粘病毒膜融合機(jī)制的不同,本研究從吸附蛋白及F蛋白的結(jié)構(gòu)功能闡述入手,進(jìn)而對(duì)比不同吸附蛋白參與的膜融合過(guò)程的機(jī)制差異,以期為該屬病毒的致病研究和疫苗研發(fā)策略提供線索。

1 F蛋白

副粘病毒的F蛋白是I型跨膜糖蛋白,由N端胞外段、跨膜區(qū)、和胞內(nèi)C端尾區(qū)組成,胞外段含有融合肽和疏水重復(fù)區(qū)。F蛋白最初合成的是非活化形式的蛋白前體F0,經(jīng)加工修飾后被宿主細(xì)胞蛋白酶裂解為二硫鍵連接的F1和F2。F蛋白以三聚體形式存在,其融合中心由疏水性重復(fù)單位HRA與HRB組成,HRA位于F1的N端,HRB位于C端。F蛋白激活后,其N端鄰近HRA的融合肽(fusion peptide,FP)暴露并插入靶細(xì)胞膜形成發(fā)卡形狀的融合前中間體(Pre-hairpin intermediate conformation,PHI)[2]。緊接著,兩個(gè)疏水重復(fù)區(qū)HR1與HR2相互結(jié)合形成6聚疏水螺旋束(Six-helix bundle,6HB),誘導(dǎo)膜融合[3]。雖然蛋白結(jié)構(gòu)和誘導(dǎo)融合時(shí)的構(gòu)象改變較為統(tǒng)一,但是不同副粘病毒的F蛋白誘導(dǎo)膜融合的機(jī)制存在差異。Xu等[4]研究發(fā)現(xiàn),NiV的F蛋白融合前構(gòu)象為F蛋白的六聚體,通過(guò)六聚體內(nèi)的F蛋白間相互激活來(lái)誘導(dǎo)膜融合的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。對(duì)于肺病毒亞科(RSV和hMPV)而言,F蛋白可能同時(shí)具有受體識(shí)別和膜融合功能,其膜融合機(jī)制更具特殊性。

2 吸附蛋白

副粘病毒的吸附蛋白根據(jù)功能和病毒來(lái)源的不同分為3類：血凝素神經(jīng)氨酸酶(hemagglutininneuraminidase,HN)、麻疹病毒屬的血凝素(hemagglutinin,H)和來(lái)自亨尼帕病毒的糖蛋白(glycoprotein,G)。HN/H/G均為Ⅱ型跨膜糖蛋白,胞外域包含靠近胞膜端的N端頸部和C端的球狀受體結(jié)合區(qū)(receptor binding domain,RBD)。RBD區(qū)包含6個(gè)片層β折疊結(jié)構(gòu),可以識(shí)別受體,從而進(jìn)行結(jié)構(gòu)適應(yīng)和變化。HN/H/G均為四聚體,具有相似的結(jié)構(gòu)。盡管結(jié)構(gòu)相對(duì)保守,副粘病毒的吸附蛋白仍有很多不同之處,例如,RSV-G和hMPV-G,比其他副粘病毒的吸附蛋白要小[4]。對(duì)多數(shù)副粘病毒而言,吸附蛋白是F激活的前提條件,但PIV5-

HN與RSV-G僅起到促進(jìn)融合作用,hMPV-G對(duì)融合過(guò)程沒(méi)有影響[5]。HN/H/G識(shí)別宿主細(xì)胞的受體類型不同。HN識(shí)別唾液酸,H/G識(shí)別蛋白類受體,但是RSV-G和hMPV-G可能并不參與受體識(shí)別[4]。受體類型可能決定著HN/H/G-F相互作用及其調(diào)節(jié)膜融合的過(guò)程。

3 膜融合機(jī)制

3.1 F蛋白介導(dǎo)的膜融合過(guò)程絕大多數(shù)的副粘病毒的F蛋白需要吸附蛋白的協(xié)同作用來(lái)完成病毒包膜與靶細(xì)胞膜的融合,進(jìn)而釋放遺傳物質(zhì)進(jìn)入靶細(xì)胞,啟始感染。F蛋白介導(dǎo)的膜融合是副粘病毒生命周期中很重要的一個(gè)環(huán)節(jié),膜融合過(guò)程中的幾個(gè)關(guān)鍵步驟已經(jīng)被確認(rèn)[5]。早期步驟包括：HN/H/G結(jié)合受體、HN/H/G的構(gòu)象改變、激活F蛋白進(jìn)行構(gòu)象改變引發(fā)膜融合。后期步驟有：融合小孔的形成與擴(kuò)大。膜融合早期,吸附蛋白結(jié)合受體激活F蛋白對(duì)于融合的起始至關(guān)重要。膜融合的后續(xù)步驟主要依靠激活后的F蛋白不可逆的構(gòu)象改變來(lái)實(shí)現(xiàn)。

3.2 膜融合中F蛋白的構(gòu)象變化隨著F蛋白融合前和融合后構(gòu)象的晶體結(jié)構(gòu)的獲取,我們對(duì)副粘病毒F蛋白介導(dǎo)的膜融合的過(guò)程的了解逐漸清晰。對(duì)比目前已知的F蛋白融合前后構(gòu)象發(fā)現(xiàn),融合前構(gòu)象更像圓形,而融合后構(gòu)象球狀頭部呈角狀[5]。融合前的F蛋白,HRA由一系列短的螺旋構(gòu)成,呈球狀,HRB為C端頸部,通過(guò)跨膜區(qū)連著胞內(nèi)尾端。一旦切割和活化,HRA區(qū)由一系列的螺旋結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為舒展的長(zhǎng)107?的三聚卷曲螺旋。該舒展?fàn)顟B(tài)可能是融合肽插入靶細(xì)胞膜的時(shí)刻,在電鏡下觀察到此時(shí)的F蛋白將兩個(gè)細(xì)胞膜拉近至210?[6]。隨著融合肽插入靶細(xì)胞膜,HRB以反平行方式重新定位于HRA溝槽中,形成穩(wěn)定的6HB,從而合并相鄰胞膜,并促進(jìn)融合孔的打開(kāi)。融合孔的形成可能需要多個(gè)F蛋白進(jìn)行協(xié)同構(gòu)象改變來(lái)跨越膜融合的能量障礙[3]。

3.3 F-HN/G/H的相互作用與膜融合免疫共沉淀和實(shí)時(shí)熒光互補(bǔ)技術(shù)[7]均顯示膜融合過(guò)程中二者之間存在相互作用。盡管尚未獲得副粘病毒吸附蛋白與F蛋白相互作用的直觀結(jié)構(gòu)學(xué)數(shù)據(jù),已獲取的功能研究結(jié)果均顯示這一相互作用對(duì)于副粘病毒屬的融合激活很重要。

3.3.1 相互作用的區(qū)別：F-HN/G/H相互作用的細(xì)胞內(nèi)發(fā)生位置、持續(xù)時(shí)間、強(qiáng)度等區(qū)別很大(見(jiàn)表1)。病毒顆粒負(fù)染電鏡觀察和低溫電子顯微鏡斷層成像技術(shù)結(jié)果顯示,hPIV3[8]在結(jié)合受體前,細(xì)胞膜表面存在HN-F短暫的相互作用,但不足以激活F,受體結(jié)合傳遞信號(hào)才啟動(dòng)了F蛋白激活。H/G-F在受體結(jié)合前乃至合成轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中[9]已形成復(fù)合物,直到H/G結(jié)合受體后發(fā)生構(gòu)象改變并暴露頸部的關(guān)鍵氨基酸,F才被激活并與H/G解離,然后F介導(dǎo)膜融合發(fā)生。相互作用的強(qiáng)度與融合活性之間的關(guān)聯(lián)在不同病毒之間存在一定差異。某些HN/H/G突變體,其融合功能喪失,同時(shí)相互作用被阻斷[10-13]。對(duì)于NiV和MeV,突變分析顯示F-G/H相互作用強(qiáng)度與融合程度成負(fù)相關(guān)關(guān)系[14-15]。NDV HN頸部的第69和第77位點(diǎn)引入糖基化使得融合減弱也使F-HN相互作用減弱,hPIV3的H552Q突變體增強(qiáng)融合并伴隨HN-F相互作用的增加,表明融合程度與F-HN的相互作用呈正相關(guān)[16]。但這種相關(guān)關(guān)系存在一些例外。NDV HN的頸部點(diǎn)突變體L97 A雖然減弱了融合程度,但是未影響F-HN的相互作用[17]；MeV H的I118C減弱了相互作用,但并未影響膜融合[12],NiV G的頸部第159位糖基化位點(diǎn)移除,雖然廢除了融合但是未明顯減弱G-F相互作用[18]。這說(shuō)明相互作用的確切機(jī)制,相互作用如何與HN/G/H識(shí)別的受體信號(hào)及F誘導(dǎo)的膜融合相關(guān)聯(lián)仍有待進(jìn)一步揭示。

3.3.2 相互作用的模型：根據(jù)F-HN/G/H相互作用的區(qū)別,目前有兩種解釋模型[5]：夾鉗模型(“dissociation” or “clamp” model)和破壞模型(“association” or“provocateur” model)。 夾鉗模型認(rèn)為,F蛋白同吸附蛋白在胞內(nèi)相互作用,以復(fù)合物形式轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面,當(dāng)吸附蛋白結(jié)合受體后,F蛋白被釋放,啟動(dòng)膜融合。破壞模型認(rèn)為,吸附蛋白結(jié)合受體后主動(dòng)引發(fā)亞穩(wěn)態(tài)的融合前構(gòu)象的F蛋白去穩(wěn)態(tài)。去穩(wěn)態(tài)和F激活均可以被加熱替代,因此F-HN/H/G相互作用克服了F激活的能量障礙。兩種模型最大的不同是前者認(rèn)為吸附蛋白可以穩(wěn)定F的融合前構(gòu)象,而在破壞模型中吸附蛋白則激發(fā)融合前F蛋白的構(gòu)象改變。目前的研究認(rèn)為F-G/H的相互作用通過(guò)夾鉗模式穩(wěn)定F蛋白,而F-HN相互作用則使得F蛋白去穩(wěn)態(tài)并激活引發(fā)融合。

但是當(dāng)前有許多與模型假設(shè)不符的證據(jù)出現(xiàn)。F蛋白可以以融合前構(gòu)象單獨(dú)表達(dá)而不需要吸附蛋白來(lái)穩(wěn)定[19-20],說(shuō)明參與F-H/G/HN相互作用的融合前構(gòu)象的F蛋白不需要吸附蛋白的“夾鉗作用”來(lái)穩(wěn)定。而且加熱又可以作為外來(lái)能量激活F蛋白誘導(dǎo)膜融合[21],這與破壞模型中的加熱可以克服亞穩(wěn)態(tài)F的能量障礙的說(shuō)法相一致。這些都表明識(shí)別受體前的F-HN/H/G相互作用對(duì)于穩(wěn)定融合前構(gòu)象并非如夾鉗模型認(rèn)為的那樣是必須的。相反,這種識(shí)別受體前的相互作用可能對(duì)蛋白的正確折疊,胞內(nèi)運(yùn)輸或增加可激活復(fù)合物濃度是必須的[9]。

表1 HN/H/G-F的相互作用比較Tab.1 Comparison of HN/H/G-F interaction

3.4 F蛋白的激活機(jī)制模型有人針對(duì)F激活過(guò)程總結(jié)了5種模型[5],值得注意的是這些模型并非相互獨(dú)立。兩個(gè)或多個(gè)模型可能適用于同一種副粘病毒。更多的結(jié)構(gòu)和功能數(shù)據(jù)尤其是HN/G/H-F相互作用方面,將有助于進(jìn)一步描述和證實(shí)這些模型。

3.4.1 頸部暴露模型：目前較為認(rèn)可的觀點(diǎn)是頸部暴露模型(stalk exposure model),即吸附蛋白結(jié)合受體后會(huì)暴露出頸部激活F蛋白的區(qū)域[22],這一點(diǎn)在多項(xiàng)有關(guān)截短頭部的頸部吸附蛋白可以激活其同源F蛋白的研究中被證實(shí)。目前發(fā)現(xiàn),F蛋白誘導(dǎo)的膜融合可以同樣被不含頭部區(qū)域的MeV H蛋白[23]、NiV G蛋白[24]、MuV HN蛋白和NDV HN蛋白誘導(dǎo)[22]。因此頸部激活是HN/H/G的一個(gè)共性。目前的研究已經(jīng)初步定位了HN-F相互作用的區(qū)域[22],但是為什么只有特定長(zhǎng)度的頸部可以激活F仍然不清楚[22]為什么MeV H的單獨(dú)頸部引入穩(wěn)定基團(tuán)后才能引發(fā)融合[23]?為什么NDV HN引入二硫鍵穩(wěn)定頸部后卻抑制了融合發(fā)生[22]?都需要進(jìn)一步深入研究。

與功能研究結(jié)果一致,HN的晶體學(xué)結(jié)構(gòu)研究可以合理解釋頸部暴露激活模型。在識(shí)別受體之前,HN/H/G的頭部可以抑制F蛋白靠近其頸部的F激活區(qū)。吸附蛋白可能通過(guò)其頭部相對(duì)于其頸部4HB的空間排列方式來(lái)實(shí)現(xiàn)這一抑制效果,類似于NDV HN蛋白頭部的四聚體下垂模型(4 headsdown)的排列方式[25]。識(shí)別受體后,吸附蛋白頭部結(jié)構(gòu)重排,構(gòu)象變得接近于PIV5 HN蛋白頭部的四聚體抬舉模型(4-heads up)的排列方式或PIV5 HN蛋白的二聚體抬舉二聚體下垂的中間態(tài)模型(2 heads up-2 heads down)的排列方式[26]。這些構(gòu)象變化使得吸附蛋白頸部的F激活區(qū)暴露,進(jìn)而激活F蛋白進(jìn)行構(gòu)象改變并誘導(dǎo)膜融合。值得注意的是,在沒(méi)有結(jié)合受體時(shí),hPIV3[8]就存在“頭部抬舉”的HN和F的相互聯(lián)系,這說(shuō)明吸附蛋白的構(gòu)象變化可能存在不依賴受體結(jié)合的途徑,需要進(jìn)一步的研究。

3.4.2 頸部暴露模型中的相互作用調(diào)節(jié)機(jī)制：深入的研究發(fā)現(xiàn)不同的副粘病毒的吸附蛋白HN/H/G通過(guò)不同的機(jī)制來(lái)調(diào)節(jié)頸部暴露之前F蛋白與吸附蛋白的相互靠近。與F-HN初次相互作用發(fā)生在細(xì)胞表面不同,F-G/H復(fù)合物在受體結(jié)合前甚至是轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞表面過(guò)程中[9]已經(jīng)存在。受體結(jié)合前出現(xiàn)的F-G/H復(fù)合物可以增加F-G/H相互作用的效率,同時(shí)也增加了不恰當(dāng)?shù)腇蛋白激活的危險(xiǎn)。因此其調(diào)節(jié)相對(duì)復(fù)雜。

3.4.2.1 頭部抑制：最近的研究顯示HN/H/G蛋白的頭部可以主動(dòng)抑制其頸部對(duì)F蛋白的激活。識(shí)別受體后,HN/H/G蛋白球狀頭部進(jìn)行構(gòu)象改變,暴露F激活區(qū)并解除對(duì)頸部的抑制作用,接下來(lái),頸部進(jìn)行構(gòu)象改變進(jìn)而引發(fā)F激活。在結(jié)合受體前的4 heads-down構(gòu)象時(shí),F-H/G存在初始相互作用可能是因?yàn)槠鋯误w在頭部下垂時(shí)暴露出的頸部區(qū)域與NDV HN及PIV5 HN不同,即4 heads-down構(gòu)象時(shí),F蛋白與H/G蛋白頸部的接觸程度不同于HN[24,27-28]。

該模型可以很好地解釋為什么HN/G/H蛋白通過(guò)不同的位點(diǎn)識(shí)別不同的信號(hào)卻導(dǎo)致一致的效應(yīng),即激活F蛋白誘導(dǎo)膜融合。

3.4.2.2 頸部C端近頭部的連接區(qū)域：除了頸部暴露外,HN/G/H蛋白頸部近C端參與了F蛋白的激活調(diào)節(jié)[9,24,28-29]。研究顯示,F-G/H的作用區(qū)相對(duì)于F-HN更為寬泛[24,30-32],但是又與HN存在線性重疊部分。H/G頸部C端近頭部的連接區(qū)域含有某種結(jié)構(gòu)穩(wěn)定區(qū)參與調(diào)節(jié)F蛋白的激活[15,24]。結(jié)合受體前的F-G/H相互作用可能通過(guò)該區(qū)實(shí)現(xiàn)[28]。這一寬泛的F-H/G接觸區(qū)可能為F-H/G相互作用如何被調(diào)控及F蛋白的不恰當(dāng)激活如何被阻止提供研究線索。但具體的F-H/G復(fù)合物如何阻止不恰當(dāng)?shù)腇-H/G相互作用發(fā)生尚需進(jìn)一步探討。

4 結(jié)語(yǔ)與展望

當(dāng)前有關(guān)副粘病毒的膜融合機(jī)制僅限于在實(shí)驗(yàn)突變分析數(shù)據(jù)基礎(chǔ)上結(jié)合吸附蛋白與F蛋白的晶體結(jié)構(gòu)進(jìn)行推測(cè)擬合出模型,但具體的膜融合過(guò)程尚不能被清楚地展示出來(lái)。探索不同副粘病毒膜融合的共性與差異,有賴于使用高分辨率的冷凍電鏡成像技術(shù),在病毒水平直觀捕獲并描述HN/G/H-F復(fù)合物的共結(jié)晶結(jié)構(gòu)來(lái)闡述二者在副粘病毒感染引發(fā)的膜融合過(guò)程中發(fā)揮的具體作用。膜融合機(jī)制的深入研究將為藥物靶點(diǎn)設(shè)計(jì)和疫苗研究奠定基礎(chǔ)。

利益沖突無(wú)