邰苗苗，郭永娟，任有蛇，張春香

（山西農業(yè)大學動物科技學院，太谷 030801）

上世紀動物細胞培養(yǎng)開始出現，現今已經成為醫(yī)學及生物學中廣泛采用的技術方法之一。對于附睪細胞的培養(yǎng)是在上世紀90年代初才逐漸被重視的［1］。目前，附睪細胞原代培養(yǎng)的方法主要有兩種：一種方法是將無菌附睪剔除脂肪后，將組織塊用胰蛋白酶消化，形成細胞團后，重懸于含5%胎牛血清的培養(yǎng)液［2］；另外一種方法是胡向農等［1］報道的方法。無菌取出大鼠附睪，用眼科剪將組織剪成1～2mm3的小塊，用胰蛋白酶和膠原酶I消化后，將收集后的細胞重懸于含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)液中，在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。然而，關于山羊附睪頭細胞培養(yǎng)的研究報道還較少。因此，本試驗擬在上述原代附睪細胞培養(yǎng)方法的基礎上加以改進，實現對太行青山羊附睪頭細胞原代培養(yǎng)和凍存，為山羊附睪特異表達蛋白功能的研究提供第一手材料。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗選取15日齡太行青山羊公羔附睪頭組織作為試驗材料，試驗動物選自山西農業(yè)大學動物科技學院試驗基地。

1.2 主要試劑

細胞培養(yǎng)基DMEM/F12、無菌PBS、姬姆薩染液、胰蛋白酶購自博士德生物公司。Guava ViaCount Reagent、GuavaInstrument Cleaning Fluid購自北京強欣博瑞生物技術有限公司。秋水仙素購自TaKaRa公司。胎牛血清（Gibco）、膠原酶I及青霉素鏈霉素混合液（雙抗）購自北京博雅宏興科技發(fā)展有限公司。KCl、NaCl、冰醋酸、甲醇等常用試劑均購自康為世紀生物科技有限公司。二甲基亞砜（DMSO）購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 山羊附睪頭組織的獲取

選取15日齡公山羊，剪去陰囊周圍羊毛，消毒陰囊及腹部皮膚，無菌去勢，取出附睪和睪丸組織，用含雙抗的溫熱無菌PBS沖洗，然后用無菌剪刀取下附睪頭部組織并浸泡入37℃預熱的含雙抗無菌PBS中，盡快帶回實驗室。

1.4 附睪頭細胞原代培養(yǎng)

采用酶消化培養(yǎng)法。用37℃預熱的含雙抗無菌PBS沖洗附睪頭組織，去除被膜及血管，洗凈血污。然后用眼科剪將附睪頭組織剪成1mm3大小，移入離心管中，加入0.25%的胰蛋白酶5mL，37℃、80 r/min振蕩30min。終止消化后離心5min，吸去上清，留沉淀。加入2mg/mL的膠原酶I3mL，37℃、80 r/min振蕩60min。用200目細胞篩過濾，再用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌2～3次，吸去上清。用0.22μm濾器過濾的含血清細胞培養(yǎng)液（88%DMEM/F12，10%胎牛血清，2%雙抗）重懸細胞，移入25 cm2培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。之后，在顯微鏡下觀察細胞生長狀況并根據細胞的生長代謝情況更換培養(yǎng)液。

1.5 附睪頭細胞傳代和凍存

圖1 山羊附睪頭細胞原代培養(yǎng)生長情況（100×）

當培養(yǎng)瓶中細胞匯合達到90%以上后棄掉舊液，用PBS洗滌2次；加入37℃預熱的0.25%胰蛋白酶2mL，37℃消化3～5min，輕輕拍打，顯微鏡下觀察，待細胞變圓、脫壁時，立即用含血清培養(yǎng)基終止消化。將細胞懸液吸出放入離心管中，離心去上清。傳代的細胞加入含血清培養(yǎng)液重懸細胞，分別接種至2個培養(yǎng)瓶中，放入細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；凍存的細胞加入1mL細胞冷凍保護液（70%DMEM/F12，20%胎牛血清，10%DMSO）重懸細胞后，4℃放置 40min，-20℃放置 90min，-80℃放置過夜，投入液氮中。

1.6 附睪頭細胞復蘇

細胞復蘇方法參照劉海濤等［3］所報道的棄去凍存液后換上新鮮的完全培養(yǎng)基。此后，根據細胞的生長代謝情況更換培養(yǎng)液，顯微鏡下觀察細胞生長狀況。

1.7 附睪頭細胞生物學特性觀察

1.7.1 形態(tài)學觀察 每隔1天觀察并記錄附睪頭上皮細胞生長狀況。

1.7.2 生長曲線繪制 用傳至第3代的附睪頭細胞進行生長曲線的繪制。取附睪頭細胞，用Guava EasyCyte進行計數，調整細胞濃度為1×105個/mL，接種于24孔培養(yǎng)板，每孔約50 000個細胞，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔24小時用胰蛋白酶隨機消化收集3個孔中的細胞，取細胞懸液50μL，加入450μLGuava ViaCountReagent，混勻，室溫避光10min，用Guava EasyCyte進行計數，求平均值，連續(xù)記錄8 d。依據試驗數據，繪制生長曲線。24孔板其余孔每2天更換培養(yǎng)液一次。

1.7.3 染色體分析 按照常規(guī)方法進行染色體制片，姬姆薩染液染色后自然干燥，封片，油鏡下觀察并拍照。

2 結果與分析

2.1 山羊附睪頭細胞原代培養(yǎng)結果

組織塊消化后，細胞密度較大，細胞剛從組織塊中消化分離出，體積較小，形態(tài)多呈圓形。原代培養(yǎng)1 d后，顯微鏡下觀察，還存在部分細胞團，沒有完全消化，細胞貼于培養(yǎng)瓶底壁，且均處于生長狀態(tài)。培養(yǎng)2 d后，細胞生長狀態(tài)很好，融合度達到90%以上，可以看出還有部分細胞團（圖1）。

2.2 傳代培養(yǎng)結果

圖2 山羊附睪頭細胞傳代培養(yǎng)生長情況（100×）

附睪頭細胞經過連續(xù)傳代后，細胞生長狀態(tài)仍良好，下圖分別為原代細胞傳至第1代和5代后第2天的細胞形態(tài)，可以看出細胞能夠穩(wěn)定地傳代，大的細胞團明顯消失，傳代后的細胞能夠保持原有的細胞形態(tài)，維持之前的生長速度，2 d左右細胞基本匯合。

2.3 山羊附睪頭細胞復蘇培養(yǎng)結果

圖3 山羊附睪頭細胞復蘇后生長情況（100×）

山羊附睪頭細胞經過凍存、復蘇后，細胞生長狀態(tài)仍良好，細胞形態(tài)與原代細胞形態(tài)相似，3 d左右細胞基本匯合（圖3）。

2.4 山羊附睪頭細胞生長曲線

根據每次記錄的細胞數量，以培養(yǎng)天數為橫坐標，細胞數量為縱坐標，繪制山羊附睪頭細胞生長曲線（圖4）。細胞接種第1天，細胞數量低于初始接種數量；從第2～3天開始，細胞進入對數生長期；從第5天開始，細胞生長速度減慢；從第6天開始，細胞進入平臺期。結果表明，培養(yǎng)的山羊附睪頭細胞生長趨勢整體呈“S”型，符合細胞生長規(guī)律。

圖4 山羊附睪頭細胞生長曲線

2.5 染色體分析結果

對山羊附睪頭的傳代細胞進行染色體數目分析（圖5）。結果表明，山羊附睪頭細胞的染色體數目為2n=60，說明山羊附睪頭細胞經過傳代后染色體數目正常，細胞狀態(tài)良好。

圖5 山羊附睪頭細胞染色體（400×）

3 討論

附睪結構和功能分成若干段不同的區(qū)域性管腔環(huán)境，附睪在胎兒剛出生的時候是不成熟的，上皮細胞在出生后的一段時間內才能獲得完全分化的表型［4］。郭麗娜等［5］在對山羊附睪特異蛋白β防御素104a定位時發(fā)現，7日齡的山羊附睪頭上皮細胞未分化，而60日齡的上皮細胞開始出現明顯的分化，細胞呈桿柱狀，游離端出現少量短而粗的微纖毛，管腔增大。本試驗采用的15日齡的山羊附睪頭組織并未分化出上皮細胞，是以低柱狀細胞存在，故而沒有對細胞進行區(qū)分，保留了所有附睪頭組織的貼壁細胞。

動物細胞原代培養(yǎng)主要有組織塊貼壁法和胰蛋白酶消化法［6］。范曉梅等［7］在對絨山羊附睪上皮細胞培養(yǎng)的過程中發(fā)現，兩種方法得到的細胞形態(tài)無差別，界限清晰，具有良好的分化能力。而組織塊消化法建立細胞系周期較長，相同時間內獲得的細胞數少于胰蛋白酶消化法。采用胰蛋白酶消化法改進后對原代細胞進行獲取，采用37℃恒溫振蕩、分階段胰蛋白酶和I型膠原酶消化法，既減少了傳統(tǒng)酶消化法每隔一段時間需要進行震蕩的步驟，又避免了酶消化時間過長對細胞造成的傷害，提高了酶的消化率和細胞的產出量［8］。胡向農等［1］和范曉梅等［7］建立附睪上皮細胞系時使用的基礎培養(yǎng)基為RPMI1640培養(yǎng)基，但由于RPMI1640不含無機鹽和次黃嘌呤等物質，可能會導致細胞生長緩慢［9］，故本研究選用了營養(yǎng)豐富的DMEM/F12培養(yǎng)基作為細胞基礎培養(yǎng)基，試驗結果證明細胞生長狀態(tài)良好，2～3 d基本融合。原代細胞培養(yǎng)最關鍵的部分就是如何避免細胞污染：從手術去勢開始，所有使用的器械均高溫高壓滅菌后再使用，采取附睪頭組織的刀片和剪刀均經過無菌處理，提前準備好添加了青鏈霉素的溫熱PBS沖洗組織，培養(yǎng)基中也添加了青鏈霉素混合液，組織塊的剪切和細胞過濾等試驗均在超凈臺操作，這樣可以確保每個環(huán)節(jié)都能夠減少細菌侵染細胞的機會，做到無菌培養(yǎng)。

一般的形態(tài)學觀察之外，本試驗還通過細胞連續(xù)傳代，凍存和復蘇，生長曲線測定以及細胞染色體分析等方面進行了細胞的生物學驗證，傳代細胞貼壁較快，呈“S”型曲線增長，復蘇后死細胞較少，能夠快速生長起來并且傳代，細胞的染色體數目正常，狀態(tài)良好，具有正常的生長速率和核型，呈現接觸抑制和錨定依賴性［2］。

4 結論

本研究成功建立了太行青山羊附睪頭細胞系，并對其進行了生長曲線測定和細胞染色體分析等生物學驗證。應用本研究所建立的太行青山羊附睪頭細胞培養(yǎng)體系可以在體外保持其原形態(tài)特征近1個月。表明，此研究所建立的方法適合太行青山羊附睪頭細胞的生長。

［1］ 胡向農，張忠林，楊建軍.大鼠附睪上皮細胞的體外培養(yǎng)與研究［J］.南京鐵道醫(yī)學院學報，1999（1）：3-5.

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［4］ Breton S，Ruan Y C，Park Y J，etal.Regulation of epithelial function，differentiation，and remodeling in the epididymis［J］.Asian JAndrol，2016，18（1）：3-9.

［5］ 郭麗娜，張國林，任有蛇，等.β防御素104a在不同日齡雄性山羊睪丸與附睪中的定位及表達特性［J］.山西農業(yè)大學學報（自然科學版），2017（12）：866-871.

［6］ 馬紅.大白豬仔豬皮膚成纖維細胞系建立及生物學特征［J］.華北農學報，2009（S1）：96-98.

［7］ 范曉梅，張通，栗瑞蘭，等.絨山羊附睪上皮細胞培養(yǎng)方法的建立及其生長特性［J］.畜牧獸醫(yī)學報，2017（7）：1212-1220.

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