鄭方平 毛凱麗 趙應(yīng)征

1(衢州市人民醫(yī)院藥劑科，浙江 衢州 324000)2(溫州醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，浙江 溫州 325025)

引言

近年來，多樣化的天然生物材料在再生醫(yī)學(xué)和藥物遞送系統(tǒng)領(lǐng)域中發(fā)揮著越來越大的作用，為轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)的發(fā)展奠定了重要的基礎(chǔ)[1-2]。

目前，由動物組織去細(xì)胞制備而成的三維組織細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)已被用于組織工程的研究[1,3-4]。ECM是由細(xì)胞分泌到細(xì)胞外間充質(zhì)中的蛋白質(zhì)和多糖類大分子物質(zhì)組成。ECM通過高度組織有序的細(xì)胞外微環(huán)境構(gòu)成復(fù)雜的網(wǎng)架，連接組織結(jié)構(gòu)，在細(xì)胞的生存、發(fā)育等細(xì)胞生理活動中起到關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用，ECM的支架基底和支架材料是組織工程研究的理想載體。與合成的高分子生物材料相比，天然的ECM生物材料在再生醫(yī)學(xué)應(yīng)用中具有許多固有的優(yōu)勢：一方面，由于ECM成分在不同的物種之間具有高度保守性，保留了大部分膠原蛋白、彈性纖維連接蛋白、蛋白聚糖等成分，所以具有良好的生物相容性及低免疫原性；另一方面，去細(xì)胞化得到的ECM材料有顯著的機械強度，保留的多孔網(wǎng)絡(luò)支架結(jié)構(gòu)可被用于大分子制劑的緩控釋新型生物材料。

諸多的研究表明，不同組織的ECM其基質(zhì)成分組成不同，如腦、脊髓、肝臟及膀胱的ECM成分存在明顯差異，因此對去細(xì)胞后的組織ECM進行成分的鑒定就顯得尤為重要[5]。然而，對腦組織去細(xì)胞的研究報道甚少，本實驗主要采用優(yōu)化法制備腦去細(xì)胞外基質(zhì)，并對其組分進行鑒定，進而為腦去細(xì)胞外基質(zhì)(dBECM)的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實驗動物

Sprague Dawley成年大鼠(SD大鼠，雌雄不限)，20只，體重300～400 g，溫州醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.1.2試劑

水合氯醛(上海國藥化學(xué)試劑有限公司)，脫氧膽酸鈉(北京索萊寶科技有限公司)，過氧乙酸(北京索萊寶科技有限公司)，TritonX-100(阿拉丁，中國)，SDS(阿拉丁，中國)，H2O2(阿拉丁，中國)，fibronectin(Abcam，英國)，elastin(Abcam，英國)，laminin(Abcam，英國)，collagen IV(Abcam，英國)，牛血清蛋白(BSA，Life公司，美國)，PBS緩沖液(Solarbio公司，中國)，枸櫞酸緩沖液(無錫傲銳東源生物科技有限公司)。

1.1.3儀器

BMJ-Ⅲ型病理組織包埋機(常州中威電子儀器有限公司)，旋轉(zhuǎn)型石蠟切片機(英國珊頓公司)，PHY-Ⅲ病理組織漂烘儀(常州中威醫(yī)療儀器有限公司)，ECLIPSE NI正置熒光顯微鏡(尼康公司，日本)，掃描電鏡(Hitachi, H-7500, 日本)。

1.2 方法

1.2.1腦去細(xì)胞生物支架的制備

1)灌注法。取成年SD大鼠，稱重，腹腔注射10%的水合氯醛麻醉(0.3 mL/100 g)，打開腹腔，從心尖插入灌流針直至主動脈，剪開右心耳，插入聚乙烯管，腹主動脈不結(jié)扎，打開恒流泵以10 mL/min的速度開始從心臟灌注，依次灌注500 mL的肝素化PBS(0.01 mmoL/L)、500 mL的胰酶(0.2 g/L的EDTA)、2 L的1% TritonX-100、2 L的l% SDS，然后再灌注1 L的PBS沖洗殘余的試劑。其中，1%的TritonX-100用于破損細(xì)胞膜，1%的SDS用于有效去除細(xì)胞成分，兩者均為較溫和的洗滌劑，對細(xì)胞外基質(zhì)的破壞程度小。灌注后的大鼠取腦，并用0.01%的過氧乙酸清洗24 h，清除所有細(xì)胞碎片和化學(xué)殘渣，置于含1%的青霉素/鏈霉素的4℃無菌PBS溶液中殺菌保存。

2)化學(xué)萃取加震蕩法。取成年SD大鼠稱重，10%的水合氯醛0.3 mL/100 g麻醉后，打開腹腔，在室溫和無菌條件下，經(jīng)左心室用生理鹽水灌注后，取出大鼠腦組織，保存在4℃無菌蒸餾水中，而后用化學(xué)提取法進行腦組織去細(xì)胞化。腦組織依次經(jīng)過3%的TritionX-100室溫震蕩萃取12 h，無菌蒸餾水漂洗3次/10 min，1%的SDS室溫震蕩萃取12 h，無菌蒸餾水漂洗3次/10 min，4%的脫氧膽酸鈉室溫震蕩萃取24 h，無菌蒸餾水漂洗3次/10 min，再重復(fù)上述萃取過程1次。搖床震蕩速度為120 r/min(80 r/min為對照速度)。萃取后的腦組織經(jīng)0.01%的過氧乙酸沖洗后，置4℃無菌PBS溶液(0.01 mol/L，pH=7.4)中保存。

1.2.2去細(xì)胞程度的檢測

通過HE染色和DAPI熒光染核，對去細(xì)胞化程度進行檢測。

1)大體觀察。觀察正常腦組織和通過不同方法制備的腦去細(xì)胞生物支架的顏色及形態(tài)變化。

2)HE染色觀察。正常對照組及去細(xì)胞組的腦組織經(jīng)4%的多聚甲醛固定，酒精梯度脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋、切片，常規(guī)HE染色后光鏡下觀察。

3)免疫熒光染色觀察：分別制備正常對照組及去細(xì)胞組腦組織的石蠟切片，DAPI免疫熒光染色檢測兩組腦組織細(xì)胞核。

1.2.3腦去細(xì)胞生物支架結(jié)構(gòu)的完整性

為了觀察去細(xì)胞后腦組織ECM結(jié)構(gòu)的完整性，用標(biāo)準(zhǔn)冷凍干燥程序凍干腦組織ECM，并在真空干燥器中進一步干燥2 h。將干燥的ECM樣品進行橫切和鍍金，再通過SEM觀察它們的表面形態(tài)。作為對照，正常腦組織樣品通過相同的步驟處理，并進行SEM成像觀察。

1.2.4腦去細(xì)胞生物支架的成分檢測

通過Masson染色，檢測其膠原纖維的表達；通過免疫熒光染色，檢測纖維連接蛋白(fibronectin)、彈性蛋白(elastin)、層粘連蛋白(laminin)、IV型膠原(collagen IV)的表達。熒光顯微鏡下觀察，細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光，細(xì)胞外基質(zhì)主要蛋白成分免疫熒光染色出現(xiàn)綠色熒光為陽性表達。

1.2.5腦去細(xì)胞生物支架中蛋白成分的定量檢測

通過ELISA分析殘留蛋白含量。

1)BCA法測定總蛋白含量。根據(jù)質(zhì)量體積比，組織中加入適量的IP細(xì)胞裂解液(以體積比為100 mg:1 mL加入PMSF)，在冰浴放置30 min后磁珠裂解勻漿。裂解完全后，以超速冷凍離心機12 000 r/min離心20 min，取上清液；若離心后上清仍渾濁，可再次離心，確保提取的液體澄清。

根據(jù)樣品數(shù)量，按50∶1的體積比加入BCA工作液(BCA試劑A與BCA試劑B混合)配成備用，充分搖勻。再以BCA試劑盒標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程配制標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線，將標(biāo)準(zhǔn)品按0、1、2、4、8、12、16、20 μL加到96孔板的標(biāo)準(zhǔn)品孔中，用于PBS補足到20 μL，再將樣品加入96孔板。各孔加入200 μL的BCA工作液，37 ℃恒溫箱孵育30 min。使用酶標(biāo)儀測定波長562下的吸收值。

2)用特異性ELISA檢測試劑盒，分別檢測膠原蛋白collagen IV、纖維連接蛋白fibronectin、彈性蛋白elastin和層粘連蛋白laminin，具體操作步驟如下：

步驟1，加樣。每孔各加入標(biāo)準(zhǔn)品或待測的樣品100 μL，將反應(yīng)板充分混勻后置于37 ℃恒溫箱內(nèi)孵育40 min。

步驟2,洗板。用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌6次，向濾紙上吸干。

步驟3，每孔加入蒸餾水和第一抗體工作液各50 μL(空白除外)。將板充分混勻后放置于恒溫箱(37℃)，孵育20 min；洗板，同上。

步驟4，每孔加酶標(biāo)抗體工作液100 μL，將板充分混勻后放置于恒溫箱(37℃)，10 min；洗板，同上。

步驟5，每孔加入底物工作液100 μL，置37℃避光反應(yīng)15 min。

步驟6，所有孔分別加100 μL終止液，混勻。

步驟7，30 min內(nèi)酶標(biāo)儀在450 nm處測吸光值。

1.2.6統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)以(x±s)表示。

2 結(jié)果

2.1 不同方法制備的腦去細(xì)胞生物支架

不同去細(xì)胞化方法制備得到的腦去細(xì)胞生物支架有所不同。如圖1所示，正常對照組腦組織結(jié)構(gòu)致密，用灌注法制備得到的腦去細(xì)胞生物支架歷經(jīng)16 h仍未達到去細(xì)胞化的狀態(tài)，腦組織保留了大部分的腦實質(zhì)，僅出現(xiàn)部分軟化顯現(xiàn)，呈現(xiàn)完整的腦部結(jié)構(gòu)。而化學(xué)萃取加震蕩法(120 r/min的轉(zhuǎn)速條件)制備得到的腦去細(xì)胞生物支架出現(xiàn)明顯的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，呈腦部三維結(jié)構(gòu)和完全去細(xì)胞化狀態(tài)，在相同溶劑處理條件下，80 r/min的轉(zhuǎn)速制備得到的腦細(xì)胞外基質(zhì)去細(xì)胞化不完全，有一部分未被去細(xì)胞化。

圖1 不同方法制備得到的大鼠腦組織去細(xì)胞支架。 (a)正常腦組織；(b)灌注法得到的腦去細(xì)胞支架；(c)化學(xué)萃取加震蕩法得到的腦去細(xì)胞支架

2.2 腦去細(xì)胞程度的評價

HE染色顯示，正常對照組的腦組織結(jié)構(gòu)致密，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核清晰，可見大量星形膠質(zhì)細(xì)胞和腦神經(jīng)細(xì)胞；去細(xì)胞組腦組織僅可見網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)，去細(xì)胞支架上未見殘存細(xì)胞及細(xì)胞核等結(jié)構(gòu)，見圖2(a)、(b)。DAPI熒光染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，正常對照組腦組織DAPI熒光顯示藍(lán)色胞核清晰；去細(xì)胞組未見明顯DAPI與細(xì)胞核結(jié)合后發(fā)出的藍(lán)色強熒光，進一步說明經(jīng)化學(xué)提取法制得的腦去細(xì)胞外基質(zhì)基本無細(xì)胞，見圖2(c)、(d)。

圖2 腦去細(xì)胞程度的評價。(a)正常對照組HE染色；(b)去細(xì)胞組HE染色；(c)正常對照組DAPI免疫熒光染色；(d)去細(xì)胞組DAPI免疫熒光染色

2.3 掃描電鏡結(jié)果

在掃描電鏡下，正常對照組的腦組織可觀察到組織結(jié)構(gòu)致密，有星型膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元細(xì)胞、神經(jīng)纖維和神經(jīng)超微結(jié)構(gòu)等細(xì)胞結(jié)構(gòu)。去細(xì)胞組的細(xì)胞結(jié)構(gòu)完全消失，整個視野由纖維連接蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成不規(guī)則圓形空腔網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，無細(xì)胞殘留，如圖3所示。

圖3 掃描電鏡圖。(a)正常腦組織的掃描電鏡圖；(b)腦去細(xì)胞支架的掃描電鏡圖

2.4 Masson染色結(jié)果

從Masson染色結(jié)果可以看出正常對照組中黑藍(lán)色的胞核，以及紅色的肌纖維、胞漿和神經(jīng)膠質(zhì)等成分，而去細(xì)胞組明顯觀察到大量膠原纖維的保留(呈藍(lán)色)，僅存少量的肌纖維，如圖4所示。

圖4 Masson染色圖。(a)正常腦組織的Masson染色結(jié)果；(b)腦去細(xì)胞支架的Masson染色結(jié)果

2.5 免疫熒光染色結(jié)果

去細(xì)胞組腦支架經(jīng)免疫熒光染色，層粘連蛋白(LN)、IV型膠原蛋白及纖維連接蛋白(FN)和彈性蛋白(EN)均呈陽性反應(yīng)，主要表達于神經(jīng)纖維基質(zhì)及ECM中。對照組LN、IV型膠原、FN及EN染色較弱，且陽性表達面積較少，細(xì)胞密集，DAPI熒光顯示藍(lán)色胞核清晰；去細(xì)胞組均可見大面積綠染區(qū)域，呈網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，未見DAPI與細(xì)胞核結(jié)合后發(fā)出的藍(lán)色強熒光(見圖5)，說明經(jīng)化學(xué)萃取加震蕩法制備的腦細(xì)胞外基質(zhì)含有大量的纖維連接蛋白、層粘連蛋白、彈性蛋白以及膠原蛋白。此外，通過分析重要的蛋白在dBECM總蛋白中的含量(見圖6)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：層粘連蛋白含量較高，為19%±1.6%；IV型膠原蛋白含量約為16%±1.9%；纖維連接蛋白含量次之，為9%±2.1%；而彈性蛋白較上述3種蛋白含量最少，為4%±1.1%。

3 討論

圖5 腦去細(xì)胞支架的成分保留。(a)去細(xì)胞組FN免疫熒光染色呈陽性，無細(xì)胞核；(b)去細(xì)胞組LN蛋白免疫熒光染色呈陽性，無細(xì)胞核；(c)去細(xì)胞組IV型膠原蛋白免疫熒光染色呈陽性，無細(xì)胞核；(d)去細(xì)胞組EN蛋白熒光染色呈陽性，無細(xì)胞核；(e)正常組FN免疫熒光染色呈陽性，細(xì)胞核顯藍(lán)色；(f)正常組LN蛋白免疫熒光染色呈陽性，細(xì)胞核顯藍(lán)色；(g)正常組IV型膠原蛋白免疫熒光染色呈陽性，細(xì)胞核顯藍(lán)色；(h)正常組EN蛋白免疫熒光染色呈陽性，細(xì)胞核顯藍(lán)色

圖6 層粘連蛋白(LN)、IV型膠原蛋白、纖維連接蛋白(FN)和彈性蛋白(EN)分別在腦去細(xì)胞外基質(zhì)中的相對表達量

組織和器官的去細(xì)胞方法是一種成功的技術(shù)平臺，能為組織工程、再生醫(yī)學(xué)和藥物遞送領(lǐng)域制備出較好的生物支架材料[6]。各種去細(xì)胞方法直接影響著ECM的組分、力學(xué)性能以及移植后的宿主反應(yīng)，也就決定著支架材料在體內(nèi)外的應(yīng)用效果。通常，應(yīng)該盡可能地采用最溫和的去細(xì)胞方案來達到最佳的去細(xì)胞效果，要求這種方法對去細(xì)胞后ECM支架的結(jié)構(gòu)和功能成分的破壞程度是最小的[7]。相對于腎、肺、心等其他組織的去細(xì)胞技術(shù)，腦組織有其特殊性，因此采用的去細(xì)胞技術(shù)也有別于其他組織。本實驗結(jié)果表明，經(jīng)心室灌流法制備的腦去細(xì)胞生物支架因血腦屏障等諸多因素，會大大降低灌流的效率，影響去細(xì)胞的效果；而化學(xué)萃取加震蕩法制備的腦去細(xì)胞生物支架去細(xì)胞化完全，形態(tài)保留完整，適合用于腦組織的去細(xì)胞化。任何去細(xì)胞方法都不可能百分百地將組織器官中所有的細(xì)胞成分去除干凈，因此只要有一種方法能夠清除絕大部分可見細(xì)胞成分，那么經(jīng)過這種方法處理后得到的ECM生物支架可安全地應(yīng)用在體內(nèi)研究中。

隨著組織工程的發(fā)展，從不同組織獲得的細(xì)胞外基質(zhì)，包括皮膚、血管、神經(jīng)、骨骼、肌腱、小腸黏膜下層、膀胱、心臟瓣膜等，已經(jīng)在可再生材料應(yīng)用中做了廣泛研究[8-9]。然而，對腦細(xì)胞外基質(zhì)的研究報道很少。有研究表明，腦ECM和其他組織ECM(脊髓或膀胱)的組成之間存在明顯差異，對腦組織去細(xì)胞后得到的ECM進行成分的檢測是非常有必要的[10]。IV型膠原和層粘連蛋白共同構(gòu)成基膜，刺激細(xì)胞的黏附和運動，是維持支架三維結(jié)構(gòu)的重要組成分；纖維連接蛋白可以通過細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)細(xì)胞的形狀和細(xì)胞骨架的組織，促進細(xì)胞鋪展；彈性蛋白可賦予支架伸縮性和可逆的變形能力，這些蛋白對支架的應(yīng)用都發(fā)揮著重要的作用。本實驗通過Masson染色觀察腦ECM中胞質(zhì)成分，結(jié)果發(fā)現(xiàn)腦ECM中存在膠原纖維和肌纖維，膠原纖維表達豐富，肌纖維表達較少。進一步通過免疫熒光染色檢測特異的胞內(nèi)蛋白成分，結(jié)果表明腦ECM保留的主要成分是IV型膠原、層粘連蛋白、纖維連接蛋白和彈性蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)成分。這些蛋白成分通過比例排列成空間構(gòu)象，為種子細(xì)胞生長發(fā)育提供依附和支撐保障，是維持組織結(jié)構(gòu)與功能的基礎(chǔ)，也是細(xì)胞重要的信號調(diào)節(jié)分子，能調(diào)控細(xì)胞的生長、代謝與分化，使腦ECM在組織修復(fù)工程中發(fā)揮著重要作用。

腦細(xì)胞外基質(zhì)(dBECM)不僅作為一種良好的生物支架用于腦組織修復(fù)，而且越來越多的研究應(yīng)用dBECM固有的三維超微結(jié)構(gòu)作為小分子化療劑或大分子治療劑的緩釋載體，模擬合成的生物支架螯合生長因子，以持續(xù)釋放一些治療劑，從而實現(xiàn)相關(guān)疾病的高效治療[11]。如在帕金森疾病的治療中，用dBECM作為大分子蛋白bFGF的載體，從而增強神經(jīng)保護的作用，以及藥物對帕金森的治療效果[12]。此外，有研究證明，攜載納米粒的ECM給藥體系也可以增強多西紫杉醇對腦膠質(zhì)瘤的治療效果[13]。這些新型的應(yīng)用打破已有的支架/移植材料的局限，為dBECM的應(yīng)用開拓新的領(lǐng)域。

本研究制備的全腦去細(xì)胞支架完全地去除腦組織細(xì)胞及細(xì)胞核結(jié)構(gòu)，同時較完整地保留ECM主要成分(彈性蛋白、LN、IV型膠原等)，簡便快捷且成本較低，是一種較理想的腦去細(xì)胞生物支架材料的方法。該材料具有良好的生物相容性、低免疫原性、生物活性和三維立體網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，有望成為腦部疾病治療的優(yōu)良材料，為藥物的新型應(yīng)用提供支撐平臺。

4 結(jié)論

本研究通過化學(xué)萃取加震蕩法制備腦去細(xì)胞支架，相對于其他方法制備去細(xì)胞支架，不僅有效去除細(xì)胞，保留營養(yǎng)成分，消除免疫原性，而且最大程度地保存了組織的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，這給腦去細(xì)胞支架的應(yīng)用帶來新的機遇,具有良好的應(yīng)用前景。

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