肖愛嬌,歐陽昕,陳明人

缺氧缺血性腦病(hypoxic-ischemic encephalopathy, HIE)是新生兒時期較為常見的疾病之一,是指各種圍生期窒息引起的部分或完全缺氧、腦血流減少或暫停而導致胎兒或新生兒腦損傷[1]。新生兒HIE具有較高的致死率和致殘率[2-3],對該病的研究已引起了廣泛的關注。近年來臨床研究報道顯示,針刺治療HIE及其后遺癥日漸增多,并證實其有效性[4-5],然而有關針刺治療急性期HIE的報道很少,其治療急性期HIE的作用機理研究也并不多見。有研究表明,細胞凋亡參與了新生鼠缺氧缺血性腦損傷的發(fā)病過程[6-7],而caspase-3被認為與細胞凋亡關系最為密切,是細胞凋亡過程的主要執(zhí)行者。

本課題組前期研究觀察到,造模后3 d HIE新生小鼠腦組織中細胞凋亡數和caspase-3表達增加[8-11]。那么,針刺治療能否通過降低腦組織中caspase-3表達、減少細胞凋亡而減輕急性期缺氧缺血性腦損傷?為此,本研究在前期研究的基礎上,采用7 d 新生小鼠制備HIE模型,觀察針刺治療急性期缺氧缺血性腦損傷的效果及對腦組織細胞凋亡和caspase-3表達的影響,以探討針刺的作用機理,為促進針刺在急性期HIE臨床防治中的應用提供科學依據,現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

選用7 d ICR新生小鼠129只,雌雄不限,購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司(許可證號 SCXK湘2013-0004)。隨機分為假手術組、模型組和針刺組。假手術組只行頸部正中切口手術,分離但并不閉合頸總動脈,不缺氧;模型組結扎并剪斷左側頸總動脈,然后給予缺氧處理;針刺組同模型組,于缺氧后進行針刺治療,每日1次,每次20 min。各組由于術中出血、缺氧、母鼠咬死及病情進展等原因,死亡 47只,死亡率為36.4%。剩下的82只小鼠中,模型組34只,針刺組29只,假手術組19只。

1.2 主要試劑和儀器

TTC試劑(2,3,5-氯化三苯基四氮唑,Sigma);一抗,兔抗小鼠 caspase-3(#9664,Cell Signaling Techno- logy);二抗,山羊抗兔(A11011,Invitrogen);熒光封片劑(P36931,Invitrogen),含 DAPI(4'-6'diamino- 2-phenylindole,4',6-二脒基-2-苯基吲哚);凋亡原位檢測試劑盒(S7165,Millipore)。頭戴式手術顯微鏡(DL-SSJ,中國 DL公司);熒光顯微鏡及圖像分析軟件(Leica 2000,Leica)。

1.3 HIE新生小鼠模型制備

參照文獻[8-11]制備HIE新生鼠模型,動物在異氟烷吸入麻醉狀態(tài)下行頸部正中切口,分離、閉合左側頸總動脈,縫合傷口;術后動物在室溫中恢復和母乳喂養(yǎng) 2 h后,進行缺氧處理,即將動物置于 37℃密閉艙,通入氮氣(N2),調節(jié)氧氣濃度為8%,100 min后取出。

1.4 針刺治療方法

取督脈上大椎穴作為治療穴位。大椎穴的定位參考《實驗針灸學》[12]中鼠針灸腧穴定位方法,位于第7頸椎與第1胸椎棘突間,背部正中。在腦缺氧缺血后當日,采用蘇州醫(yī)療用品廠有限公司出品的0.30 mm×13 mm無菌針灸針進行斜刺,留針20 min,每日1次。

1.5 觀察指標

1.5.1 腦組織梗死檢查

于造模后1 d,給予動物異氟醚吸入麻醉后迅速取腦,以 1.5 mm左右間隔自額向枕切成 4個冠狀切片,加入1%TTC染液,置于37℃溫箱中染色20 min,用掃描儀進行掃描,運用Image J軟件(national institute of health, USA)測量每張腦片的梗死面積,并計算梗死面積百分比[8-11]。梗死面積(%)＝[健側半球面積－(患側半球面積－梗死面積)]/全腦面積×100%。

1.5.2 腦組織形態(tài)學觀察

于造模后7 d,給予動物異氟醚吸入麻醉后迅速取腦,用數碼相機拍照,然后切片(厚 30 μm),DAPI染色后封片,采用顯微鏡觀察拍照。

1.5.3 腦組織細胞凋亡檢測

采用TUNEL法檢測腦組織細胞凋亡。于造模后3 d,給予動物異氟烷吸入麻醉后迅速取腦,置于 4%多聚甲醛溶液中固定。細胞凋亡檢測參見相關文獻[8-11]進行操作。圖中紅色為TUNEL染色陽性細胞,用Image J軟件進行圖像分析,計數每個200倍視野下的TUNEL陽性細胞數。

1.5.4 腦組織caspase-3陽性細胞檢測

采用熒光免疫組織化學法進行測定。于造模后3 d,給予動物異氟烷吸入麻醉后迅速取腦,置于 4%多聚甲醛溶液中固定。腦組織caspase-3陽性細胞檢測參照相關文獻[8-11]進行操作。圖中有caspase-3蛋白的部位呈現紅色,用 Image J軟件進行圖像分析,計數每個200倍視野下的caspase-3陽性細胞數。

1.6 統(tǒng)計學方法

所有數據采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數±標準差表示,多組間采用方差分析,組間多重性比較采用Dunnett’s test。

2 結果

2.1 針刺對HIE模型小鼠腦梗死面積的影響

由圖 1可見,假手術組小鼠可見腦組織全部染成紅色,未見梗死灶;模型組小鼠可見右側半球呈紅色,左側半球有白色梗死灶;針刺組小鼠可見右側半球呈紅色;左側半球有白色梗死灶。經測量分析,模型組腦組織梗死面積百分率與假手術組比較,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);針刺組腦組織梗死面積百分率與模型組比較,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。詳見表1。

表1 各組腦組織梗死面積百分率比較 (x±s,%)

2.2 針刺對HIE模型小鼠腦組織形態(tài)的影響

由圖2可見,假手術組(n=6)腦大體形態(tài)可見腦組織紅潤,腦溝及腦回清晰,左右兩半球基本對稱;模型組(n=7)可見左側腦組織萎縮、塌陷;針刺組(n=9)可見左側腦組織小面積梗死灶,腦溝變淺。

由圖3可見,假手術組(n=6)DAPI染色結果可見腦組織細胞排列整齊、致密;模型組(n=7)可見患側腦組織細胞排列紊亂、疏松,有大量細胞脫落,細胞間隙變大;針刺組(n=9)可見患側腦組織排列較整齊、致密,有少量細胞脫落。

2.3 針刺對HIE模型小鼠腦組織細胞凋亡的影響

模型組小鼠左側腦組織TUNEL陽性細胞數明顯多于假手術組,兩組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);而針刺組小鼠左側腦組織TUNEL陽性細胞數明顯低于模型組,兩組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。詳見表2、圖4。

表2 各組腦組織TUNEL陽性細胞數比較 (x±s,個)

2.4 針刺對HIE模型小鼠腦組織caspase-3表達的影響

模型組小鼠左側腦組織caspase-3陽性細胞數明顯多于假手術組,兩組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01);而針刺組小鼠左側腦組織caspase-3陽性細胞數明顯低于模型組,兩組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。詳見表3、圖5。

表3 各組腦組織caspase-3陽性細胞數比較 (x±s,個)

圖1 各組小鼠腦組織TTC染色結果

圖2 各組小鼠腦大體形態(tài)

圖3 各組小鼠腦組織DAPI染色結果(×50 μm)

圖4 各組小鼠腦組織細胞凋亡結果(×50 μm)

圖5 各組小鼠腦組織caspase-3表達結果(×20 μm)

3 討論

新生兒缺氧缺血性腦病是指由圍生期窒息引起的足月兒和近足月兒(胎齡≥34周)的缺氧缺血性腦損傷(HIBD)。HIE是導致新生兒死亡和不可逆性腦損傷的主要原因,重者可遺留腦性癱瘓、癲癇等難治性兒童腦病,輕者也可能是導致患者今后學習障礙、輕癱、細微運動問題、注意力缺陷等危險性升高的原因。因而對該病的研究引起了廣泛的關注。

針刺療法作為中醫(yī)學的獨特分支,具有安全有效、無不良反應等優(yōu)點,在成人腦梗死治療中越來越受到人們的重視。大量的臨床試驗研究和動物實驗研究表明,針刺對梗死腦組織具有多水平、多通道、多靶點的保護和干預作用。近年來臨床研究報道顯示,針刺治療新生兒HIE及其后遺癥日漸增多,并證實其有效性[4-5]。動物研究觀察到針刺具有減輕新生大鼠缺氧缺血性腦損傷的作用[13]。然而關于針刺治療急性期新生小鼠HIE的報道并不多見。本研究采用7 d新生小鼠制備HIE模型,觀察到造模 24 h內針刺大椎穴可縮小HIE模型小鼠腦梗死面積,減少腦組織細胞脫落,表明針刺具有減輕新生小鼠缺氧缺血性腦損傷的作用。然而其作用機理尚不十分清楚。

新生兒HIE的病理機制很多,涉及氧化應激、炎癥反應、興奮性毒性和細胞凋亡等。其中,細胞凋亡在缺血性腦損傷中的作用十分重要[6-7,14-15],且在未成熟腦中比成年腦中更常見[7]。細胞凋亡是 1972年由 Kerr和 Curry提出的,是指細胞在一定的生理或病理條件下,遵循自身的程序由基因調控的主動性死亡過程,其發(fā)生、發(fā)展都受到精確的調控,具有獨特的信號通路。目前研究表明,細胞凋亡通路主要有 caspase依賴性凋亡通路——內源性線粒體通路和外源性死亡受體通路以及非caspase依賴性凋亡通路。線粒體通路又稱為內源性凋亡途徑,由于線粒體被認為處于哺乳動物細胞凋亡調控的中心位置,因此對該通路的研究一直占有重要地位。線粒體凋亡通路的主要過程是,當細胞受損后,細胞色素 C(Cyt-C)從線粒體釋放,與細胞凋亡激活因子1(Apaf-1)結合活化caspase-9前體,從而激活caspase-3,引發(fā)caspase級聯反應,最終導致細胞凋亡的發(fā)生。死亡受體通路又稱為外源性凋亡途徑,該途徑的信號轉導通路主要包括Fas、TNFR1、DR4/DR5和 DR3,雖然這些通路的啟動、傳導與調控各不相同,但也并非完全獨立,最后都通過各自渠道激活caspase引發(fā)細胞凋亡。非caspase依賴性通路,其機制是一個繁雜的過程,其中以多聚 ADP核糖聚合酶(PARP-1),凋亡誘導因子(AIF)介導的凋亡通路研究較多。PARP-1是一種DNA修復酶,在DNA片段化時被激活,參與DNA的復制、轉錄和修復。AIF是一種存在于線粒體膜間隙的黃素蛋白,當凋亡信號刺激時,AIF從線粒體釋放到細胞漿,再通過核定位信號轉移至細胞核,引起染色質濃縮和大片段DNA斷裂[16],造成細胞凋亡。由于細胞凋亡過程中染色體DNA的斷裂是一個漸進的分階段的過程,染色體 DNA首先在內源性的核酸水解酶的作用下降解為50～300 kb的大片段,然后在Ca2+和Mg2+依賴的核酸內切酶作用下,形成180～200 bp核小體DNA多聚體。因此,大量的DNA雙鏈斷裂被認為是凋亡最顯著的特征。TUNEL法(即脫氧核糖核苷酸末端轉移酶介導的缺口末端標記法)是將脫氧核糖核苷酸和熒光素、過氧化物酶、堿性磷酸化酶等形成的衍生物標記到DNA的3’-OH末端,從而進行凋亡細胞的檢測。該檢測方法靈敏度高、反應快,能檢測出極少量的細胞凋亡,因而被廣泛應用于細胞凋亡和神經元退化的檢測,也被認為是檢測細胞凋亡的金標準[17]。為此本研究采用 TUNEL法檢測腦組織細胞凋亡,結果觀察到HIE模型組小鼠腦組織中TUNEL陽性細胞數明顯增多;而與HIE模型組相比,針刺組小鼠腦組織TUNEL陽性細胞數明顯減少(見圖 4),表明腦缺氧缺血后發(fā)生了細胞凋亡,與文獻[8-11]報道結果相近;而針刺具有抑制細胞凋亡的作用,這一結果與文獻[13,18]報道基本一致。但是對于針刺通過哪條凋亡信號通路起作用還不清楚。

Caspase蛋白是一組天冬氨酸特異的半胱氨酸蛋白酶,而 caspase-3是溝通內源性通路和外源性通路的交匯點,被認為與凋亡關系最為密切,在細胞凋亡中的作用也備受關注。有研究指出,caspase-3在細胞凋亡中起著重要的調控作用,是細胞凋亡過程中的主要執(zhí)行者,它可水解多種蛋白底物,包括細胞骨架蛋白、細胞周期調節(jié)蛋白、細胞信號轉導蛋白、DNA修復調節(jié)因子以及細胞存活等環(huán)節(jié)中重要的蛋白,導致細胞失去正常功能而凋亡[19]。由此推測,降低 caspase-3的表達或抑制caspase-3的活性可抑制細胞凋亡的發(fā)生。陳明明等[13]觀察到朱璉針刺興奮法通過降低caspase-3蛋白表達,從而減輕缺氧缺血性腦損傷。范春玲等[20]觀察到頭針透刺腦出血大鼠,可抑制腦部血腫周圍的caspase-3的活化,從而使caspase-3參與誘導的細胞凋亡減輕,神經細胞得到保護。本研究結果顯示,針刺大椎后小鼠腦組織中 caspase-3陽性細胞數明顯減少(見圖 5),這一結果與文獻[13,20-21]報道基本一致,表明針刺可能抑制 caspase-3表達而抑制細胞凋亡。

綜上所述,針刺減輕急性期缺氧缺血性腦損傷的作用,可能通過其抑制腦組織 caspase-3的表達及減少腦組織細胞凋亡實現的,這為促進針刺在防治急性期新生兒HIE的臨床實踐提供了科學依據。然而關于針刺究竟通過調控內源性信號通路還是外源性信號通路繼而抑制細胞凋亡還有待于將來進一步的研究。

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