，，，，

近年來，真菌感染性疾病的發(fā)病率不斷增高，其中白念珠菌(Candidaalbicans)是主要病原體之一[1-2]。使用抗真菌藥物是控制真菌感染的主要手段，但隨著耐藥菌株的不斷增加，抗真菌藥物種類較少及抗真菌藥物的毒副作用等問題的出現(xiàn)，尋找新藥源、研發(fā)新型安全有效的抗真菌感染治療藥物已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)科研工作者迫切需要解決的問題[2-3]。

抗菌肽(Antimicrobial peptides，AMPs)是生物體內(nèi)具有抑殺細(xì)菌、真菌、病毒以及腫瘤細(xì)胞等生物活性的小分子肽類物質(zhì)。由于AMPs具有抗菌譜廣、低毒、不易產(chǎn)生耐藥性等特點(diǎn)，因此受到廣泛關(guān)注[4-6]。MAF-1A(Muscadomesticaantifungal peptide-1A)是來源于家蠅幼蟲由26個氨基酸殘基組成的線性小分子抗菌肽。前期研究發(fā)現(xiàn)， MAF-1A為是一陽離子多肽，N 端富含賴氨酸(Lys)，其二級結(jié)構(gòu)主要為α-螺旋結(jié)構(gòu)，具有較好的雙親性，且具有一定耐熱性，MAF-1A可通過多靶點(diǎn)作用方式對白念珠菌敏感株及耐藥菌株產(chǎn)生較強(qiáng)的抑殺作用，具有新型抗真菌藥物的開發(fā)潛力[7-8]。但MAF-1A在家蠅幼蟲體內(nèi)含量少且提取純化方法復(fù)雜，采用化學(xué)合成費(fèi)用昂貴。因此，利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)MAF-1A具有重要意義。本研究擬利用大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)對抗菌肽MAF-1A進(jìn)行體外表達(dá)和純化，并測定所表達(dá)MAF-1A的抗C.albicans活性，為后續(xù)深入研究MAF-1A和抗真菌新藥的研發(fā)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1質(zhì)粒和菌株 原核表達(dá)載體pET-28a購自寶生物工程(大連)有限公司；大腸桿菌Roseeta(DE3)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；白念珠菌(Candidaalbicans，ATCC10231)由貴州醫(yī)科大學(xué)微生物學(xué)教研室保存。

1.1.2主要試劑 Tricine、Tris、蛋白Marker、SDS-PAGE凝膠試劑盒、His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒和腸激酶(EK)、ECL發(fā)光液均購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1序列合成與表達(dá)載體的構(gòu)建 以MAF-1A氨基酸序列(KKFKETADKLIESAKQQLESLAKEMK)[7-8]為單體進(jìn)行串聯(lián)；根據(jù)大腸桿菌密碼子偏嗜性優(yōu)化編碼序列，在5個MAF-1A單體核苷酸序列間設(shè)計(jì)腸激酶(EK)酶切位點(diǎn)；在序列的5′和3′端分別引入BamHⅠ和HindIII酶切位點(diǎn)，3′端引入6×His標(biāo)簽，化學(xué)合成串聯(lián)基因序列5×MAF-1A-6×His；將基因序列克隆到pET-28a表達(dá)載體中以構(gòu)建重組質(zhì)粒，并測序鑒定。序列合成及克隆由生工生物工程(上海)有限公司完成。

1.2.2重組蛋白的表達(dá)與純化 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Roseeta(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，LB平板(含卡那霉素100 μg/mL)篩選陽性轉(zhuǎn)化子，進(jìn)行測序鑒定，鑒定結(jié)果正確的單菌落再繼續(xù)接種于液體培養(yǎng)基(含卡那霉素100 μg/mL)中，37 ℃振搖培養(yǎng)12 h后，以1∶100接種于新鮮LB液體培養(yǎng)基(含卡那霉素100 μg/mL)中，37 ℃振搖培養(yǎng)至OD600值為0.8，分別以不同濃度的IPTG、溫度及培養(yǎng)時間進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。培養(yǎng)物在4 ℃，12 000 r/min離心10 min，收集菌體，加適量pH7.4的PBS重懸，取適量菌液加入SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，沸水浴5 min，15% SDS-PAGE電泳檢測目的蛋白的表達(dá)，以確定重組串聯(lián)多肽的最佳表達(dá)條件。超聲破碎誘導(dǎo)表達(dá)的菌體，取上清與沉淀分別進(jìn)行15%SDS-PAGE電泳。按照His標(biāo)簽純化試劑盒說明書，純化重組蛋白，15%SDS-PAGE電泳鑒定目的蛋白，Nanodrop2000檢測純化蛋白濃度。

1.2.3重組蛋白的兔多抗血清制備 取含有400 μg重組蛋白的溶液與等體積完全弗氏佐劑進(jìn)行乳化，將乳化的重組蛋白于新西蘭兔背部皮下多點(diǎn)注射；第14 d及第28 d，各取含有100 μg重組蛋白的溶液與等體積不完全弗氏佐劑進(jìn)行乳化，于新西蘭兔背部皮下多點(diǎn)注射進(jìn)行加強(qiáng)免疫；加強(qiáng)免疫后第14 d耳緣靜脈采血測定抗體效價，然后采血并分離血清存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4純化重組蛋白的Western Blot鑒定 將純化的重組蛋白經(jīng)15% SDS-PAGE電泳分離后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜(PVDF)上，用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h；用TBST洗滌3次；將PVDF與1∶2 000稀釋5×MAF-1A兔多抗血清孵育4 ℃過夜，TBST洗滌3次；再將PVDF與1∶15 000稀釋的羊抗兔IgG(H+L)于37 ℃孵育1 h，TBST洗滌3次；ECL化學(xué)發(fā)光顯色，同時作空白對照。

1.2.5重組蛋白的酶切 用EK對純化的重組蛋白進(jìn)行酶切，按說明書操作。使用SDS-PAGE電泳檢測酶切產(chǎn)物，采用Nanodrop2000檢測MAF-1A單體濃度。

1.2.6酶切產(chǎn)物的抗菌活性檢測 采用K-B紙片瓊脂擴(kuò)散法[9]檢測酶切產(chǎn)物對C.albicans的體外抗菌活性；參考美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)推薦的M27-A3方法[10],檢測酶切產(chǎn)物對C.albicans的最低抑菌濃度(MIC)和最低殺菌濃度(MBC)。

2 結(jié) 果

2.1重組質(zhì)粒的鑒定 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌Roseeta(DE3)陽性轉(zhuǎn)化子測序結(jié)果證明堿基序列正確，MAF-1A編碼序列、酶切位點(diǎn)和6×His標(biāo)簽依次正確連接。

2.2重組串聯(lián)多肽的表達(dá)、純化及SDS-PAGE電泳檢測 將含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌在200 r/min振搖培養(yǎng)，經(jīng)過SDS-PAGE電泳分析發(fā)現(xiàn)，IPTG終濃度為0.8 mmol/L時蛋白的表達(dá)量較其他濃度高；在28 ℃、0.8 mmol/L IPTG誘導(dǎo)條件下蛋白主要以可溶性狀態(tài)存在，在該條件下誘導(dǎo)12 h，蛋白表達(dá)量達(dá)高峰(圖1，2，3)。SDS-PAGE電泳結(jié)果中，目的條帶在23 kDa，與預(yù)期一致。經(jīng)Ni-NTA純化后的融合蛋白與未純化時相比，條帶較為單一，表明大部分雜蛋白被去除，最后得到的融合蛋白純度較高，Nanodrop2000檢測純化蛋白濃度為2.0 mg/mL(圖4)。

1：空載體轉(zhuǎn)化對照組；2：未誘導(dǎo)對照組；3-7：IPTG誘導(dǎo)濃度分別為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mmol/L；M：Marker圖1 不同IPTG濃度對重組蛋白表達(dá)的影響Fig.1 Effects of different IPTG concentrations on the expression of recombinant protein

1：空載體轉(zhuǎn)化對照組；2：未誘導(dǎo)對照組；3-14：誘導(dǎo)時間為2、4、6、8、10、12、14、16、18、20、22、24 h；M：Marker圖2 不同培養(yǎng)時間對重組蛋白表達(dá)的影響Fig.2 Effects of different time on the expression of recombinant protein

1：空載體轉(zhuǎn)化對照組；2：未誘導(dǎo)對照組；3-12：誘導(dǎo)溫度為18、20、22、24、26、28、30、32、34、36 ℃；M：Marker圖3 不同培養(yǎng)溫度對重組蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effects of different temperature on the expression of recombinant protein

1：誘導(dǎo)表達(dá)的重組菌超聲后沉淀；2：誘導(dǎo)表達(dá)的重組菌超聲后上清；3：被誘導(dǎo)表達(dá)的重組菌全菌蛋白；4：純化后重組蛋白；5：重組蛋白酶切產(chǎn)物；M：Marker圖4 SDS-PAGE分析蛋白表達(dá)與純化情況Fig.4 SDS-PAGE analysis of the expression and purification of recombinant protein

2.3純化重組蛋白的Western Blot鑒定 以抗重組蛋白兔血清為一抗、羊抗兔IgG(H+L)作為二抗進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示5×MAF-1A蛋白能與多抗血清反應(yīng)，在23 kDa處出現(xiàn)單一的特異性條帶(圖5)，表明重組蛋白得到很好純化。

1：純化后的重組蛋白與抗重組蛋白兔血清的免疫印跡反應(yīng)；2：陰性對照；M：Marker圖5 重組蛋白的Western Blot分析Fig.5 Western Blot analysis of recombinant protein

2.4MAF-1A單體的抗菌活性檢測 經(jīng)K-B紙片瓊脂擴(kuò)散法初步檢測酶切獲得的MAF-1A單體對C.albicans的抗菌活性，結(jié)果顯示MAF-1A單體對C.albicans具有抑殺活性(圖6)。采用微量稀釋法檢測MAF-1A單體對C.albicans的MIC值和MBC值分別為0.25 mg/mL、0.5 mg/mL。

1、2：MAF-1單體；3：陰性對照。圖6 MAF-1A單體的抗白念珠菌活性Fig.6 Anti-C. albicans activity of MAF-1A monomer

3 討 論

MAF-1A是來源于家蠅幼蟲體內(nèi)的一類新型小分子AMPs，實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)其具有較強(qiáng)的抗真菌活性[7-8]。盡管MAF-1A顯示了作為新型肽類抗真菌藥物的開發(fā)前景，但天然MAF-1A在蟲體內(nèi)含量極微，而且分離純化困難，難以滿足后續(xù)研究及產(chǎn)業(yè)化需求。目前，獲得高純度的AMPs途徑主要包括化學(xué)合成以及重組表達(dá)。重組表達(dá)AMPs的生產(chǎn)成本低，提取工藝簡單，產(chǎn)量高，能更好的滿足研究和產(chǎn)業(yè)化需求[11]。大腸桿菌和酵母菌是最為常用的AMPs重組表達(dá)宿主。由于MAF-1A具有對真菌較強(qiáng)的抑殺活性而對細(xì)菌影響小的特點(diǎn)，在本實(shí)驗(yàn)研究中，選用大腸桿菌作為重組表達(dá)宿主，以減少M(fèi)AF-1A表達(dá)后對宿主的毒性。

小分子多肽的克隆表達(dá)、分離、純化、鑒定都相對復(fù)雜，在表達(dá)宿主菌體內(nèi)很容易降解[12]。MAF-1A是由26個氨基酸殘基構(gòu)成的多肽，由于其相對分子量較小，也不適合直接在重組表達(dá)宿主中表達(dá)。為了增加小分子多肽的表達(dá)量和穩(wěn)定性、提高目的多肽的得率、保持多肽活性，國內(nèi)外許多學(xué)者采用了串聯(lián)表達(dá)方式，由于串聯(lián)設(shè)計(jì)可以表達(dá)出大分子肽聚體，肽聚體通過酶或其他位點(diǎn)的切割可以釋放多個肽單體，這不僅解決了小分子多肽單體不易分離、鑒定的問題，也提高了表達(dá)效率[13-15]。目前，已有MagaininII，LNK-16，BuIFN-T1a2，BuIFN-T8等多種AMPs的大腸桿菌串聯(lián)表達(dá)系統(tǒng)被構(gòu)建，其不僅能誘導(dǎo)表達(dá)出相應(yīng)AMPs的串聯(lián)分子，而且其水解產(chǎn)物均具有抑菌活性[16-19]。本實(shí)驗(yàn)研究根據(jù)大腸桿菌密碼子偏嗜性，以MAF-1A的氨基酸序列為單體，腸激酶(EK)為裂解識別點(diǎn)，6×His為標(biāo)簽，設(shè)計(jì)合成含5個MAF-1A拷貝的人工融合基因5×MAF-1A-6×His，并構(gòu)建了含該融合基因序列的大腸桿菌重組表達(dá)系統(tǒng)pET28a-5×MAF-1A-E.coliRoseeta(DE3)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，所構(gòu)建的重組表達(dá)系統(tǒng)可在 IPTG 誘導(dǎo)下表達(dá)目的重組蛋白，表達(dá)量為2.0 mg/mL。結(jié)果表明，MAF-1A原核串聯(lián)表達(dá)體系構(gòu)建成功，該串聯(lián)表達(dá)系統(tǒng)能夠較好的表達(dá)重組蛋白。

可溶性蛋白適合采用親和層析法進(jìn)行純化，并且由于純化的蛋白溶液中沒有變性劑和過多的鹽離子，對后期蛋白酶切和抗菌活性的影響不大[20]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，宿主菌所表達(dá)的目的重組蛋白主要以可溶形式存在，經(jīng)Ni-NTA 提純后在SDS-PAGE電泳中呈現(xiàn)為較為單一的目的蛋白條帶，表明該重組蛋白能夠得到較好純化；純化后的重組蛋白經(jīng)EK酶切后獲得的MAF-1A單體對C.albicans具有抑殺活性，其對C.albicansMIC和MBC值分別為0.5 mg/mL、1.0 mg/mL，表明構(gòu)建的串聯(lián)表達(dá)系統(tǒng)可以有效表達(dá)具有抗菌活性的MAF-1A。

本研究構(gòu)建的串聯(lián)表達(dá)體系能高效表達(dá)具有生物學(xué)活性的MAF-1A，為MAF-1A的進(jìn)一步研究和抗真菌新藥的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

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