，， ，， ，，，

黃熱病毒(YFV)是一種以伊蚊為傳播媒介黃病毒科黃病毒屬RNA病毒，主要在非洲和南美洲的熱帶、亞熱帶地區(qū)呈地方性流行[1-2]。2016年3月我國確診了首例輸入性黃熱病病例后，隨后又發(fā)現(xiàn)多例輸入性黃熱病患者[3-5]。而我國華南地區(qū)具有YFV流行區(qū)域類似環(huán)境，人群及哺乳動(dòng)物對黃熱病毒普遍易感，因此YFV已成為一種潛在威脅華南地區(qū)公共安全的蟲媒病毒[6-8]。

目前，對于YFV感染仍缺乏有效的治療措施，接種YFV-17D減毒疫苗可有效預(yù)防，控制YFV疫情需要早期確診YFV感染[9]，而當(dāng)前YFV感染實(shí)驗(yàn)室診斷以病毒核酸檢測為主[10]，該方法對設(shè)備和操作人員要求高，試劑昂貴，因而當(dāng)前需要一種簡便、快速抗原檢測方法。YFV只有一種血清型，基因全長約12 Kb，可編碼3種結(jié)構(gòu)蛋白(E-PrM-C)和7種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1、NS2A、NS2B、NS3、NS4A、NS4B、NS5)。YFV NS1為分泌性糖蛋白，分子量約45 KD，在感染患者血清中分泌早、滴度高，同病毒RNA的早期復(fù)制相關(guān)，能夠誘導(dǎo)機(jī)體免疫應(yīng)答，是一種早期診斷的靶標(biāo)[11-12]。本研究旨在制備YFV NS1重組蛋白，研究其免疫學(xué)特性，為以NS1蛋白為靶標(biāo)的抗原檢測方法和黃熱病毒NS1蛋白功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1病毒株和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 登革病毒(DENV1-4)、黃熱病毒(YFV)、YFV-17D疫苗株、乙腦病毒(JEV)和西尼羅河病毒(WNV)由廣州軍區(qū)疾病預(yù)防控制中心保存。以上毒株均在1640培養(yǎng)基培養(yǎng)的昆蟲細(xì)胞C6/36中增殖，33°C培養(yǎng)3～5 d。觀察到細(xì)胞病變后，收集感染細(xì)胞，超聲處理后收集感染細(xì)胞超聲上清，保存在-80°C 備用。SPF級(jí)雄性4～6周Balb/c小鼠和昆明小鼠購于南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2主要試劑及工具酶 RT-PCR試劑盒、PCR產(chǎn)物回收試劑盒、DNA連接試劑盒、SphⅠ、SalⅠ限制性內(nèi)切酶均購于日本TaKaRa公司；NI-NTA親和層析填料和10 kD蛋白濃縮柱購于德國Qiagen公司；His標(biāo)簽抗體、HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG購于中國博士德公司；二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine，DAB)顯色液和四甲基聯(lián)苯胺(3,3′,5,5′-Tetramethylbenzidine，TMB)顯色液購于中國生工有限公司；弗氏佐劑購于美國Sigma公司、 酶聯(lián)板購于中國怡新美生物有限公司。

1.3重組質(zhì)粒pQE30-YFV NS1的構(gòu)建、轉(zhuǎn)化和篩選 根據(jù)GenBank公布的YFV-17D疫苗株序列設(shè)計(jì)上下游引物(YFV NS1-F、YFV NS1-R)，酶切位點(diǎn)分別是SphⅠ、SalⅠ。由上海生工公司優(yōu)化合成(YFV NS1-F：5′ATAT GCATGC GAT CAA GGA TGC GCC ATC AAC TT 3′YFV NS1-R：5′ATGC GTCGAC TGA AGC CAC TGT GAG TTT CAG CA 3′)。利用病毒RNA提取試劑盒提取YFV-17D疫苗株全基因序列；以YFV NS1-F、YFV NS1-R為引物進(jìn)行RT-PCR，反應(yīng)條件為第一步50 ℃ 3 min，第二步94℃ 2 min，第三步94 ℃ 30 s、58 ℃ 35 s、72℃ 2 min共25個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增出YFV-NS1的基因片段。用限制性內(nèi)切酶SphⅠ和SalⅠ將YFV NSl基因片段和pQE30載體質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切純化回收；DNA連接試劑盒16℃水浴連接30 min構(gòu)建重組質(zhì)粒，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞M15，涂含有Amp和Kan雙抗的LB平板后37 ℃培養(yǎng)過夜；挑取數(shù)個(gè)單克隆菌落進(jìn)行PCR鑒定和SphⅠ、SalⅠ雙酶切鑒定；1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物進(jìn)行分析，篩選出陽性克隆并保種[7]。

1.4YFV NSl重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及復(fù)性

挑取陽性克隆的M15菌落接種于含有Amp和Kan雙抗的LB培養(yǎng)基，分別在梯度IPTG濃度和不同誘導(dǎo)時(shí)間的條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，確定最佳誘導(dǎo)條件；提取不溶性重組蛋白包涵體，經(jīng)8M尿素溶解后，過Ni-NTA層析柱經(jīng)中高壓液相色譜儀進(jìn)行純化回收，利用梯度濃度的尿素緩沖液將變性重組蛋白進(jìn)行復(fù)性，1×PBS透析后過蛋白濃縮柱進(jìn)行濃縮回收，SDS-PAGE電泳鑒定蛋白的復(fù)性率及濃度，置-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5動(dòng)物免疫 3只4周齡的Balb/c小鼠免疫方法如下：將弗氏完全佐劑與YFV NS1重組蛋白乳化后免疫小鼠腋窩、腹股溝、50 μg/只；以后每隔14 d以弗氏不完全佐劑與YFV NS1重組蛋白乳化后免疫小鼠背部皮下及足墊；免疫6次后，眼球取血，離心獲取小鼠血清。

1.6病毒特異性多克隆腹水制備 登革病毒(DENV1-4)、黃熱病毒(YFV)、YFV-17D疫苗株、乙腦病毒(JEV)和西尼羅河病毒(WNV)等病毒特異性多克隆腹水制備方法如下：運(yùn)用對應(yīng)的病毒感染細(xì)胞超聲上清，采用前述方法免疫昆明小鼠4次，在第4次免疫時(shí)同時(shí)腹腔注射小鼠肉瘤S180細(xì)胞收集腹水。寨卡病毒(ZIKA)NS1蛋白免疫小鼠血清為香港大學(xué)惠贈(zèng)。

1.7免疫印記 10% SDS-PAGE分離加熱處理過的YFV NS1蛋白和YFV-17D感染細(xì)胞超聲上清，半干轉(zhuǎn)印儀轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，5%脫脂奶粉37 ℃孵育1 h；用DENV1-4、YFV、JEV、WNV免疫小鼠制備S180小鼠肉瘤細(xì)胞腹水、ZIKA NS1免疫鼠血清和YFV NS1免疫鼠血清37 ℃孵育YFV NS1蛋白膜1 h，YFV NS1免疫鼠血清和YFV NS1重組蛋白及YFV-17D感染細(xì)胞超聲上清膜37 ℃孵育1 h；0.1% PBS-T洗膜后HRP-羊抗鼠IgG 37 ℃孵育30 min；洗膜5 min×4次后DAB顯色1 min，去離子水終止顯色。

1.8間接酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn) 分別用復(fù)性后的YFV NSl蛋白和YFV-17D感染細(xì)胞超聲上清10 μg/mL包被微孔板，37 ℃包被2 h；加入1% BSA 37 ℃封閉1 h；將稀釋后不同濃度DENV1-4、YFV、JEV、WNV等病毒特異性多克隆腹水、ZIKA NS1免疫鼠血清加入包被YFV NSl蛋白的微孔板中37 ℃孵育1 h，YFV NS1免疫小鼠血清加入包被YFV-17D感染細(xì)胞超聲上清的微孔板中37 ℃孵育1 h，洗板5次；HRP-羊抗鼠IgG 37 ℃孵育30 min，洗板8次；TMB顯色10 min，20%H2SO4終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀測定A450/A630的OD值。小鼠肉瘤S180細(xì)胞腹水用于陰性對照，anti-His單抗用于陽性對照。

1.9間接免疫熒光法 YFV 17D感染C6/36細(xì)胞4 d后收集感染細(xì)胞，按文獻(xiàn)報(bào)道方法制備細(xì)胞涂片[14]。YFV NS1免疫小鼠血清1∶1000稀釋液15 μL滴在玻片孔中，37 ℃孵育45 min，PBS洗3次，加入FITC標(biāo)記羊抗小鼠IgG抗體, 37 ℃孵育30 min，洗滌5次后加1∶200稀釋Hoechest33258(中國上海碧云天生物技術(shù)有限公司)避光染色10 min，洗滌后再加0.25%伊文氏藍(lán)避光染色10 min，洗滌后用50%甘油封片，熒光顯微鏡下觀察。

2 結(jié) 果

2.1黃病毒屬病毒NS1序列分析 YFV-17D疫苗株基因序列同Pubmed報(bào)道YFV-17D疫苗株(GenBank: U17066.1)完全一致。將該核酸序列在Pubmed中進(jìn)行BLAST，發(fā)現(xiàn)多株來源于不同國家和地區(qū)臨床分離株序列NS1核酸序列(如塞內(nèi)加爾，GenBank：JX8998876.1;喀麥隆，GenBank:AV572535.1;巴西，GenBank:JF912180.1；法國，GenBank: U21055.1)同該疫苗株NS1序列完全一致。將該NS1蛋白序列在Pubmed中進(jìn)行BLAST，發(fā)現(xiàn)截止2017年12月7日，Pubmed蛋白庫已報(bào)道的70株黃熱病毒中NS1蛋白序列中同源性為89%～100%(其中14株氨基酸殘基完全一致，20株99%氨基酸殘基一致，1株98%氨基酸殘基一致，2株97%氨基酸殘基一致，20株96%氨基酸殘基一致，11株93%氨基酸殘基一致，1株92%氨基酸殘基一致，1株89%氨基酸殘基一致)，表明NS1蛋白序列在黃熱病毒中高度保守。

DENV1-4、JEV、WNV和Zika標(biāo)準(zhǔn)株在Pubmed蛋白庫中ACCESSION依次為P27909、P29991、Q99D35、Q5UCB8、P32886、 ABR19639和Q32ZE1。將這些病毒株以及YFV17D基于NS1蛋白序列進(jìn)化分析，利用MEGA 5.1軟件基于鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。黃病毒屬病毒間具有不同的遺傳距離，Zika同YFV具有較高的同源性(圖1A)。黃病毒屬病毒NS1蛋白氨基酸殘基序列與YFV NS1比對結(jié)果表明以上毒株同YFV NS1同源性范圍為42%～48%(圖1B)，從低到高依次為DENV-1、DENV-3、DENV-4、DENV-2、WNV、 JEV和Zika，同進(jìn)化樹結(jié)果一致。

2.2pQE30-YFV NS1重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定 經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增獲得的YFV NSl基因片段長度約1.2 Kb。測序和雙酶切重組質(zhì)粒pQE30-YFV NS1鑒定結(jié)果表明目的基因正確插入載體質(zhì)粒。

2.3His-YFV NS1融合蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)、純化及復(fù)性 利用10%SDS-PAGE電泳分析不同誘導(dǎo)條件下的蛋白表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)37 ℃、0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)4 h條件下，目的蛋白表達(dá)量最高；目的蛋白分子量約為46 kD與預(yù)測蛋白分子量相符合。目的蛋白以不溶性包涵體形式存在，8 mmol/L尿素變性溶解后，經(jīng)NI-NTA層析柱純化回收可獲得高純度的His-NS1融合蛋白，經(jīng)復(fù)性透析后獲得可溶性NS1蛋白濃度約為0.3 mg/mL(圖2)。

圖2 His-YFVNS1融合蛋白的表達(dá)、純化及復(fù)性Fig.2 Expression, purification and renaturation of His-YFVNS1 fusion protein

圖1 黃病毒屬病毒NS1蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹及氨基酸殘基序列比對(A系統(tǒng)進(jìn)化樹B氨基酸殘基序列比對)Fig.1 Phylogenetic tree based on the complete amino acid sequences of flavivirus NS1 and alignments of amino acid sequences of flavivirus NS1 (A phylogenetic tree B alignments of amino acid sequences)

2.4YFV NS1重組蛋白免疫原性的鑒定 采用免疫印記(WB)、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)和免疫熒光方法(IFA)等方法鑒定YFV NS1重組蛋白的抗原性。

YFV NS1重組蛋白免疫小鼠制備特異性針對YFVNS1重組蛋白小鼠血清。采用WB和IFA 方法鑒定抗YFVNS1重組蛋白小鼠血清與YFV-17D感染C6/36細(xì)胞超聲上清、YFV NS1重組蛋白以及感染YFV C6/36細(xì)胞的反應(yīng)性，驗(yàn)證重組蛋白免疫原性(圖3)。重組YFVNS1免疫小鼠血清能夠同重組YFVNS1反應(yīng)，表明YFV NS1蛋白具有很好的免疫原性，同含天然NS1蛋白的YFV-17D感染C6/36細(xì)胞超聲上清反應(yīng)，免疫熒光也為陽性，表明其誘導(dǎo)抗體能夠識(shí)別天然蛋白和重組蛋白，提示重組NS1蛋白中存在類似的天然NS1蛋白表位。

制備DENV1-4、YFV、JEV、和WNV等病毒特異性多克隆腹水。YFVNS1重組蛋白與上述蟲媒病毒特異性多克隆腹水、YFVNS1重組蛋白免疫小鼠血清、ZIKA NS1重組蛋白免疫小鼠血清及His單抗反應(yīng)性見圖4。結(jié)果表明該重組蛋白能夠同抗天然YFV病毒多抗反應(yīng)，進(jìn)一步提示該重組蛋白同天然NS1蛋白具有相似的表位。其他常見蟲媒病毒特異性多抗腹水也能同該重組蛋白反應(yīng)，表明蟲媒病毒NS1蛋白間存在交叉表位。

A免疫印記 B免疫熒光圖3 YFV NS1重組蛋白免疫小鼠血清鑒定重組蛋白免疫學(xué)特性Fig.3 Immunogenity identification of the recombinant YFV NS1 by sera from recombinant YFV NS1-immunized mice

A：免疫印記，B：酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)圖4 YFV NS1重組蛋白的交叉反應(yīng)性Fig.4 Identification of the recombinant YFV NS1 by Western blot and ELISA

3 討 論

YFV NS1蛋白主要以膜型存在于感染細(xì)胞膜上，同時(shí)也以六聚體形式分泌到體液中[12]，具有較強(qiáng)的免疫原性，是誘導(dǎo)體液免疫的主要蛋白之一。在YFV人源敏感細(xì)胞中，YFV感染后24 h即可在培養(yǎng)上清中檢測到分泌型NS1[13]，而48 h才能在上清中檢測到病毒RNA(本實(shí)驗(yàn)室未發(fā)表數(shù)據(jù))；正常人接種YFV17D疫苗后3～10 d血液中不能檢測到NS1蛋白，而RNA陽性YFV感染病人中能夠檢測到[13]，提示NS1蛋白是一種較好的黃熱病毒感染早期診斷的標(biāo)志物。核酸序列比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)YFV17D NS1同來源于不同國家和地區(qū)的病毒臨床分離株的NS1核酸序列完全一致，同當(dāng)前Pubmed報(bào)道的YFV臨床分離株中NS1蛋白中氨基酸殘基序列同源性為89%～100%，提示NS1蛋白在YFV臨床分離株中高度保守，來源于疫苗株的NS1蛋白同臨床分離株具有相同免疫學(xué)特性，表明以該蛋白為靶標(biāo)具有通用性，能夠用于檢測來源于不同地區(qū)病毒株YFV感染，進(jìn)一步證實(shí)NS1蛋白可作為黃熱病毒感染早期診斷的標(biāo)志物。

原核表達(dá)的YFV NS1重組蛋白同來源于含天然YFV NS1的YFV感染細(xì)胞超聲上清免疫小鼠的腹水發(fā)生明顯的反應(yīng)，提示原核表達(dá)重組蛋白雖然沒有天然蛋白糖基化位點(diǎn)，但重組蛋白仍保持天然蛋白的某些構(gòu)象，包含類似天然蛋白表位。單純YFV重組蛋白免疫小鼠血清能與含有天然蛋白的病毒感染敏感細(xì)胞及其細(xì)胞超聲上清反應(yīng)，進(jìn)一步證實(shí)重組蛋白中包含類似天然蛋白表位，能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生針對天然蛋白的抗體。因此，采用重組蛋白免疫制備的單抗可用于建立以NS1為靶標(biāo)的雙抗夾心法檢測方法。

YFV NS1重組蛋白同黃病毒屬其它病毒特異性多抗也具有交叉反應(yīng)，提示黃病毒屬NS1中存在這些交叉反應(yīng)性的表位?；贜S1蛋白序列進(jìn)化分析結(jié)果也表明黃病毒屬病毒間進(jìn)化關(guān)系，為這些交叉表位存在提供理論基礎(chǔ)。YFV NS1蛋白氨基酸殘基序列同其它黃病毒屬病毒如DENV、JEV、WNV、Zika等病毒標(biāo)準(zhǔn)株NS1氨基酸殘基相似性從42%～48%，進(jìn)一步證實(shí)NS1蛋白中存在交叉反應(yīng)性表位。氨基酸殘基序列比對結(jié)果也提示NS1蛋白中存在YFV特異性氨基酸殘基序列，因此，該蛋白也存在YFV特異性表位，同相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道針對YFV NS1蛋白的YFV特異性的單抗相一致[13]。在前期研究中采用登革病毒NS1[14]和包膜蛋白3區(qū)[15]重組蛋白制備一批登革病毒特異性單抗，在下一步研究中采用重組YFV NS1蛋白和病毒感染細(xì)胞超聲上清共同作為免疫原交叉免疫小鼠，篩選針對NS1的YFV特異性單抗。

本研究以疫苗株YFV17D NS1序列為模板，構(gòu)建重組質(zhì)粒pQE30-YFV NS1，并優(yōu)化YFV NS1重組蛋白的表達(dá)、純化及復(fù)性條件，制備YFV NS1重組蛋白并鑒定其免疫學(xué)特性，結(jié)果表明該重組蛋白具有良好的免疫原性，為以NS1為靶標(biāo)的雙抗夾心法檢測方法建立和蛋白功能研究奠定基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1] Otshudiema JO, Ndakala NG, Mawanda EK, et al. Yellow fever outbreak-kongo central province, democratic republic of the congo[J]. Morb Mortal Wkly Rep,2017, 66(12): 335-338.DOI: 10.15585/mmwr.mm6612a5

[2] Auguste AJ, Lemey P, Bergren NA, et al. Enzootic transmission of yellow fever virus, Venezuela[J]. Emerg Infect Dis, 2015, 21(1): 99-102. DOI: 10.3201/eid2101.140814

[3] Ling Y, Chen J, Huang Q, et al. Yellow fever in a worker returning to China from Angola[J]. Emerg Infect Dis, 2016. 22(7): 1317-1318. DOI: 10.3201/eid2207.160469

[4] 呂燕寧, 李潔, 陳麗娟,等. 中國首例黃熱病輸入病例的實(shí)驗(yàn)室檢測[J]. 首都公共衛(wèi)生. 2016. 10(2): 61-63. DOI: 10.16760/j.cnki.sdggws.2016.02.004

[5] 宋燦磊, 鄭雅旭, 劉天，等. 上海市首例黃熱病病例的確認(rèn)及其現(xiàn)場流行病學(xué)調(diào)查分析[J].中華疾病控制雜志, 2017, 21(16): 644-646. DOI: 10.16462 / j.cnki.zhjbkz.2017.06.026

[6] Wilder-Smith A, Gubler DJ, Weaver SC, et al. Epidemic arboviral diseases: priorities for research and public health[J]. Lancet Infect Dis, 2017, 17(3): e101-e106. DOI: 10.1016/S1473-3099(16)30518-7

[7] Wang L, Zhou P, Fu X, et al. Yellow fever virus: Increasing imported cases in China[J]. J Infect, 2016, 73(4): 377-380. DOI: 10.1186/s12936-016-1504-2

[8] Shearer FM, Moyes CL, Pigott DM, et al. Global yellow fever vaccination coverage from 1970 to 2016: an adjusted retrospective analysis[J]. Lancet Infect Dis, 2017, DOI: 10.1016/S1473-3099(17)30419-X

[9] 譚維國, 賈德勝, 譚偉龍，等. 黃熱病疫情及防控對策[J]. 中華衛(wèi)生殺蟲藥械, 2016, 22(3): 220-224.

[10] 凌云, 盧洪洲. 黃熱病的流行病學(xué)及診斷學(xué)進(jìn)展[J]. 新發(fā)傳染病電子雜志, 2017, 2(2): 65-67.

[11] Akey DL, Brown WC, Dutta S, et al. Flavivirus NS1 structures reveal surfaces for associations with membranes and the immune system[J]. Science, 2014, 343(6173): 881-885. DOI: 10.1126/science.1247749

[12] Rastogi M, Sharma N, Singh SK. Flavivirus NS1: a multifaceted enigmatic viral protein[J]. Virol J, 2016, 13: 131. DOI: 10.1186/s12985-016-0590-7

[13] Ricciardi-Jorge T, Bordignon J, Koishi A,et al. Development of a quantitative NS1-capture enzyme-linked immunosorbent assay for early detection of yellow fever virus infection[J]. Sci Rep, 2017, 7(1): 16229. DOI: 10.1038/s41598-017-16231-6

[14] Chen Y, Pan Y, Guo Y, et al. Comprehensive mapping of immunodominant and conserved serotype- and group-specific B-cell epitopes of nonstructural protein 1 from dengue virus type 1[J]. Virology, 2010, 398(2): 290-298. DOI: 10.1016/j.virol.2009.12.010

[15] 林亞英, 丁細(xì)霞, 朱偉，等. Ⅰ型登革病毒包膜蛋白Ⅲ區(qū)中和抗體的制備與鑒定[J]. 免疫學(xué)雜志, 2015, 31(8): 706-711. DOI: 10.13431/j.cnki.immunol.j.20150150